劉延霞,麥菁蕓,林則彬,蒙晶

新生兒膿毒血癥是指細(xì)菌、真菌等微生物在新生兒血液中異常增殖并分泌毒素產(chǎn)生全身炎性反應(yīng)的一種綜合征[1]。臨床多表現(xiàn)為感染性休克和多器官功能障礙,嚴(yán)重者會(huì)迅速死亡[2]。研究表明,新生兒膿毒血癥的病死率可高達(dá)50%[3]。因此,需要找到能預(yù)測(cè)膿毒血癥病情嚴(yán)重程度的指標(biāo),從而早期干預(yù),防止病情惡化。研究表明,C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和降鈣素原(procalcitonin,PCT)等炎性指標(biāo)對(duì)膿毒血癥有較好的診斷價(jià)值,但對(duì)病情變化的預(yù)測(cè)不理想[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn),miR-141、miR-181a廣泛參與炎性反應(yīng),對(duì)胃炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等疾病有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值[5-6],但目前尚無二者與膿毒血癥嚴(yán)重程度有關(guān)的報(bào)道?，F(xiàn)分析血清miR-141、miR-181a水平對(duì)新生兒膿毒血癥病情嚴(yán)重程度的影響,建立新的預(yù)測(cè)指標(biāo)體系,及時(shí)判斷膿毒血癥病情變化,從而盡早優(yōu)化治療方案,防止病情惡化,報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年6月—2022年8月海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院新生兒科收治膿毒血癥患兒50例為研究對(duì)象。根據(jù)患兒的序貫器官衰竭評(píng)分(sequential organ failure assessment, SOFA)分為輕癥組27例和重癥組23例。2組患兒在性別、胎齡、出生體質(zhì)量、發(fā)病日齡、感染部位比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性,見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HL2021013),患兒家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標(biāo)準(zhǔn) (1) 診斷標(biāo)準(zhǔn):參照“中國膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)”[7]制定:①白細(xì)胞水平異常(所有白細(xì)胞或中性粒細(xì)胞水平變化>10%);②直腸、膀胱、口腔或中心靜脈導(dǎo)管測(cè)量體溫異常(>38.5℃或<36℃);③心率>同年齡組2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,持續(xù)加快超過30 min且無明確病因,或心率<同年齡組第10百分位,持續(xù)減慢超過30 min且無明確病因;④呼吸頻率>同年齡組2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差,或需要機(jī)械通氣。以上4項(xiàng)需包含2項(xiàng)以上,且必須包含①或②項(xiàng)。(2)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合新生兒膿毒血癥診斷;②發(fā)病48 h內(nèi);③之前未接受藥物或其他措施治療 。(3)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并先天性心臟病;②合并血液系統(tǒng)疾病;③合并先天性畸形;④合并新生兒黃疸;⑤合并肝腎功能不全;⑥臨床資料不完整。

表1 輕癥組、重癥組患兒臨床資料比較

1.3 觀測(cè)指標(biāo)與方法

1.3.1 血清miR-141和miR-181a表達(dá)檢測(cè): 抽取患兒空腹靜脈血3 ml,離心留取上層血清。采用miRNA提取分離試劑盒[凱杰生物工程(深圳)有限公司]提取血清miRNA,采用miRNA的cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)將miRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)說明書配制反轉(zhuǎn)錄體系,將配置好的體系放入Aplied Biosystems的實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?95℃加熱1 min,95℃變性30 s、58℃退火40 s、72℃延伸30 s,最后72℃加熱5 min充分反應(yīng),共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。miR-141和miR-181a的引物由上海生物工程公司合成,miR-141上游引物:5’-GTACCCTCTAGAAGTCGCGCCA-3’,下游引物:5’-AGTCACTACTGAAGATCTG-3’; miR-181a上游引物:5’-CTCGGCTCTGGCAGTCTATCT-3’,下游引物:5’-TCGTTCTCGACCTGCCGGAT-3’;內(nèi)參采用U6基因,上游引物:5’-GACTGATGCTCTGGCCGA-3’,下游引物:5’-GTCGGGTCGAAGCATGG-3’。采用2-△△Ct法計(jì)算miR-141和miR-181a的表達(dá)量。

1.3.2 血清CRP和PCT水平檢測(cè):上述血清采用酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行檢測(cè)(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)。準(zhǔn)備酶標(biāo)板,每孔分別滴加血清和標(biāo)準(zhǔn)品25 μl,37℃孵育15 min,再滴加酶底物100 μl,反應(yīng)20 min,加入顯色液,避光15 min,最后滴加終止液。將酶標(biāo)板放入酶標(biāo)儀(山東云唐科技有限公司,型號(hào):YT-MB96A)中,于450 nm波長處檢測(cè)溶液吸光度,計(jì)算CRP、PCT水平。

1.3.3 急性生理與慢性健康評(píng)分:急性生理與慢性健康評(píng)分(acute physiology and chronic health evaluation-Ⅱ,APACHE-Ⅱ)測(cè)量包含3部分:(1)生理狀態(tài)評(píng)分:體溫、脈搏、呼吸、血壓、血細(xì)胞分析、肝腎功能、血?dú)夥治?、格拉斯哥評(píng)分等12個(gè)項(xiàng)目;(2)年齡評(píng)分:為0～6分;(3)慢性病狀態(tài)評(píng)分:擇期手術(shù)2分,其余情況5分。將以上三項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加,即為總評(píng)分。分?jǐn)?shù)越高,患者預(yù)后越差,死亡風(fēng)險(xiǎn)越大。

2 結(jié) 果

2.1 2組血清miR-141、miR-181a、 CRP、PCT水平比較 重癥組血清miR-141和miR-181a水平低于輕癥組, CRP、PCT水平高于輕癥組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01),見表2。

表2 輕癥組與重癥組患者血清miR-141、miR-181a、 CRP、PCT水平比較

2.2 2組APACHE-Ⅱ評(píng)分比較 重癥組APACHE-Ⅱ評(píng)分為(32.58±6.47)分,高于輕癥組的(21.72±4.35)分(t/P=7.054/<0.001)。

2.3 血清miR-141、miR-181a與APACHE-Ⅱ評(píng)分、CRP、PCT的相關(guān)性 膿毒血癥患兒血清miR-141、miR-181a均與APACHE-Ⅱ評(píng)分、CRP、PCT呈明顯負(fù)相關(guān)(P均<0.01),見表3。

表3 膿毒血癥患兒血清miR-141、miR-181a與APACHE-Ⅱ評(píng)分、CRP、PCT的相關(guān)性

2.4 膿毒血癥患兒病情加重的多因素Logistic回歸分析 以新生兒膿毒血癥病情嚴(yán)重程度為因變量,以上述結(jié)果中P<0.05項(xiàng)目為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析,結(jié)果顯示,血清miR-141高和miR-181a高為膿毒血癥患兒病情加重的保護(hù)因素(P均<0.01),APACHE-Ⅱ評(píng)分高、CRP高和PCT高為病情加重的危險(xiǎn)因素(P均<0.01),見表4。

表4 膿毒血癥患兒病情加重的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清miR-141、miR-181a對(duì)膿毒血癥患兒病情變化的ROC曲線分析 繪制血清miR-141、miR-181a水平預(yù)測(cè)新生兒膿毒血癥病情嚴(yán)重程度的效能ROC曲線,并計(jì)算曲線下面積(AUC),結(jié)果顯示,血清miR-141、miR-181a及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)新生兒膿毒血癥病情嚴(yán)重程度的AUC分別為0.936、0.856、0.959 ,二者聯(lián)合檢測(cè)優(yōu)于各自單獨(dú)預(yù)測(cè)效能(Z=5.318、9.652,P<0.001),見表5、圖1。

3 討 論

膿毒血癥是新生兒常見的死亡原因,發(fā)病率逐年增長[8]。肺部、胃腸道等是膿毒血癥最常發(fā)生的部位,臨床表現(xiàn)為重癥肺炎、急性肺損傷、腸道功能紊亂,甚至多器官功能障礙,導(dǎo)致死亡[9]。發(fā)病機(jī)制包括感染引起的血管內(nèi)皮受損、炎性因子升高、代謝功能異常等,其中炎性因子與感染后病情加重存在密切關(guān)聯(lián)[10]。機(jī)體產(chǎn)生的內(nèi)毒素會(huì)誘導(dǎo)caspase活化,增強(qiáng)鞘氨醇-磷酸2受體信號(hào),導(dǎo)致其對(duì)炎性小體敏感性增加,激活細(xì)胞凋亡途徑,從而導(dǎo)致臨近組織細(xì)胞發(fā)生炎性反應(yīng),產(chǎn)生細(xì)胞損傷,導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生,當(dāng)炎性反應(yīng)長時(shí)間持續(xù)時(shí),會(huì)嚴(yán)重抑制免疫功能,引起膿毒癥休克,甚至死亡[11]。因此,尋找到能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)膿毒血癥預(yù)后的指標(biāo)很關(guān)鍵。

表5 血清miR-141、miR-181a預(yù)測(cè)膿毒血癥患兒病情變化的價(jià)值比較

圖1 血清miR-141、miR-181a及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)膿毒血癥患兒病情程度的ROC曲線

CRP是產(chǎn)自肝細(xì)胞中的一種急性期蛋白,與非特異性免疫有關(guān),其水平能指示炎性反應(yīng)程度,然而其在早期升高不明顯,通常在嚴(yán)重感染后18 h才顯著上升,在炎性反應(yīng)消退后1～3 d才恢復(fù)至正常水平,因此其對(duì)于預(yù)測(cè)炎性疾病的預(yù)后價(jià)值有限[12]。PCT在正常人體內(nèi)水平較低,當(dāng)出現(xiàn)膿毒血癥時(shí),血清水平迅速增加,在感染早期即可有明顯上升,然而其峰值持續(xù)時(shí)間過長,不能及時(shí)隨機(jī)體感染好轉(zhuǎn)而下降,因此對(duì)于疾病的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值不理想[13]。APACHE-Ⅱ評(píng)分廣泛應(yīng)用于膿毒血癥等嚴(yán)重感染性疾病的評(píng)估,但是其主觀性較強(qiáng),存在評(píng)價(jià)者個(gè)體差異問題,因此預(yù)后價(jià)值不高[14]。近年來發(fā)現(xiàn),許多miRNA均參與炎性反應(yīng),其表達(dá)水平與感染的嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān),其中miR-141和miR-181a在肺炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等炎性疾病的嚴(yán)重程度預(yù)測(cè)方面都有很好的價(jià)值,但是對(duì)新生兒膿毒血癥病情變化的影響尚無報(bào)道[15-16]。因此,本研究分析了新生兒膿毒血癥血清miR-141和miR-181a表達(dá)水平,比較了二者與以往研究指標(biāo)APACHE-Ⅱ評(píng)分、CRP和PCT的作用大小,從而有力證明了血清miR-141和miR-181a對(duì)病情變化的預(yù)測(cè)價(jià)值。

miR-141是miR-200家族(miR-141、miR-200a、miR-200b、miR-200c及miR-429)成員之一,是一個(gè)成熟的序列,全長共22 個(gè)核苷酸[17]。miR-141可以通過結(jié)合不同靶點(diǎn)經(jīng)多條通路調(diào)節(jié)一系列的生理過程,可在細(xì)胞生長和凋亡、新陳代謝、炎性反應(yīng)、血管新生等多個(gè)生物學(xué)過程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[18]。本研究結(jié)果提示,miR-141對(duì)于新生兒膿毒血癥具有很好的預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。李靜等[19]發(fā)現(xiàn),miR-141水平升高,能抑制脂多糖誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞中IL-6和IL-1β的表達(dá),從而減輕上皮細(xì)胞損傷。臧雪風(fēng)等[20]測(cè)量了167例高血壓性腦出血患者血清miR-141水平,發(fā)現(xiàn)其與TNF-α、IL-1β、IL-6水平均呈負(fù)相關(guān),miR-141是高血壓腦出血的預(yù)后保護(hù)因素,這與本研究結(jié)果一致。陳勝樂等[21]研究表明,miR-141抑制炎性反應(yīng)的機(jī)制可能是通過抑制NF-κB信號(hào)通路,阻斷IκB激酶α、磷酸化IκB激酶α等因子的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),從而降低IL-1、IL-10、TNF-α等炎性因子水平,從而促進(jìn)炎性細(xì)胞凋亡,緩解炎性反應(yīng)。然而,也有少數(shù)研究認(rèn)為miR-141與炎性反應(yīng)可能存在相互促進(jìn)的關(guān)系,陳筱濤等[22]采集108例尿毒癥患者外周血,發(fā)現(xiàn)miR-141高表達(dá)與微炎性狀態(tài)有關(guān),與本研究結(jié)果存在爭議,原因可能是由于尿毒癥患者存在嚴(yán)重腎功能損害,引起血清miR-141異常升高所致。

miR-181a作為一種重要的miRNA,其包含2條前體序列:其中1條前體序列位于1號(hào)染色體反義鏈,另1條位于9號(hào)染色體正義鏈,2條序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄后再進(jìn)一步加工為成熟序列,長度為23 nt,參與調(diào)控靶基因表達(dá)[23]。作為miR-181家族成員,miR-181a種子區(qū)域高度保守,其不僅參與細(xì)胞的分化發(fā)育,還在介導(dǎo)腫瘤發(fā)生、侵襲轉(zhuǎn)移及炎性反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用[24]。本研究結(jié)果提示,miR-181a對(duì)于新生兒膿毒血癥具有較好的預(yù)后價(jià)值。楊曉娜等[25]發(fā)現(xiàn),慢性阻塞性肺疾病患者血清miR-181a低于健康對(duì)照組,miR-181a水平與IL-1β、hs-CRP等炎性因子呈負(fù)相關(guān)。李強(qiáng)等[26]檢測(cè)了50例冠心病患者和50例健康人的miR-181a水平,發(fā)現(xiàn)miR-181a在冠心病患者中低表達(dá),以上研究與本研究結(jié)果一致。陶鳳姣等[27]研究表明,miR-181a可能是通過抑制TLR4/MyD88信號(hào)通路,減輕嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤,從而減輕炎性反應(yīng)。但是也有少數(shù)研究結(jié)果存在爭議,古裕鳥等[28]發(fā)現(xiàn)新生兒呼吸窘迫綜合征血清miR-181a升高與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān),這與本研究結(jié)果不一致,原因可能是該研究各組間樣本量不均衡(非危重組53例、危重組24例、極危重組15例),可能會(huì)導(dǎo)致組間測(cè)量結(jié)果不穩(wěn)定,同時(shí)單組樣本量過少(極危重組15例)會(huì)降低統(tǒng)計(jì)效能。

本研究的優(yōu)點(diǎn)在于通過相關(guān)分析表明了miR-141、miR-181a與多種炎性因子的相關(guān)性強(qiáng)度,采用多因素Logistic回歸分析得出miR-141、miR-181a對(duì)病情嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)作用大小,通過ROC曲線得出了miR-141、miR-181a的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率,通過多個(gè)定量結(jié)果證明了二者對(duì)病情的預(yù)測(cè)價(jià)值。本研究不足之處在于僅研究了患兒病情輕重這一個(gè)因素,在以后的研究中,可以考慮對(duì)患兒進(jìn)行長期隨訪,采用生存分析研究miR-141、miR-181a的遠(yuǎn)期預(yù)后價(jià)值。

綜上所述,血清miR-141和miR-181a在新生兒膿毒血癥中低表達(dá),與APACHE-Ⅱ評(píng)分、CRP和PCT呈負(fù)相關(guān),其水平升高是膿毒血癥患兒病情嚴(yán)重程度的保護(hù)因素,對(duì)新生兒膿毒血癥病情變化有很好的預(yù)測(cè)價(jià)值。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

劉延霞:設(shè)計(jì)研究方案,論文撰寫;麥菁蕓:分析試驗(yàn)數(shù)據(jù),論文修改;林則彬:實(shí)施研究過程,資料搜集整理;蒙晶:提出研究思路,論文審核