麥東媚 沈樂 譚俊青

1廣東省第二中醫(yī)院檢驗科，廣州 510000；2廣東江南醫(yī)院檢驗科，廣州 510000

近年來，我國鼻咽癌人數(shù)不斷上漲，特別是兩廣地區(qū)，鼻咽癌趨勢更是由北向南逐漸遞增。據(jù)研究，我國鼻咽癌發(fā)病人數(shù)占世界鼻咽癌患者的38.29%，鼻咽癌致死人數(shù)占世界鼻咽癌死亡人口的40.14%，發(fā)病率和病死率高于世界平均水平（1.2/10萬、0.7/10萬），且男性患鼻咽癌的比例遠高于女性［1］。其中，EB病毒與鼻咽癌有著密不可分的聯(lián)系，EB病毒衣殼抗原抗體（epstein-barr virus capsid antigen antibody，EBV-VCA-IgA）和 EB病毒早期抗原抗體（epstein-barr virus early antigen antibody，EBV-EA-IgA）水平抗體與鼻咽癌臨床表現(xiàn)有一定相關(guān)性，可應(yīng)用于鼻咽癌的診療［2］。但鼻咽癌預(yù)后和治療情況復(fù)雜，患者治療后體內(nèi)的EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA和EBV-DNA水平會大幅減少，導(dǎo)致檢出率大幅度下降，這時候要通過這三項聯(lián)合檢查才能為鼻咽癌療效及預(yù)后提供一定的參考意義［3］。廣州地區(qū)是鼻咽癌高風(fēng)險地區(qū)，所以能夠有一個準確檢測EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA的指標對快速確診鼻咽癌與觀察鼻咽癌的治療愈后具有重要意義。

過去臨床實驗室是通過定性試驗確認機體是否感染有EB病毒的風(fēng)險，這種方法存在假陰性或假陽性的可能，無法對患者體內(nèi)EB病毒進行準確檢測。近幾年，臨床實驗室對EB病毒的定性試驗轉(zhuǎn)變?yōu)槎吭囼?。這種定量試驗可以更精準檢測患者體內(nèi)的EB病毒抗原抗體含量，反應(yīng)機體感染病毒的嚴重程度，為臨床篩查與治療提供更為準確的檢測結(jié)果。但是這種定量試驗運用到臨床檢驗上的時間并不長，大多數(shù)臨床實驗室還是直接使用試劑商提供的EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA的參考區(qū)間。由于廣州地區(qū)居民的飲食、環(huán)境、生活習(xí)慣的不同，無法準確驗證試劑廠商提供的參考區(qū)間是否適用于廣州地區(qū)的居民［4］。因此，建立適用于本實驗室的EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA的生物參考區(qū)間具有一定的臨床指導(dǎo)意義。

運用直接法去建立當?shù)氐纳飬⒖紖^(qū)間［5］，于各地醫(yī)院是一個十分重要的診斷指標，但需要嚴格篩查患者樣本，程序復(fù)雜，十分費時且花費大，這對于醫(yī)學(xué)實驗室來說是一種巨大的負擔(dān)。而間接法建立生物參考區(qū)間是指運用臨床實驗室數(shù)據(jù)庫中已有的數(shù)據(jù)去建立生物參考區(qū)間的方法，相比于直接法，間接法更加方便、快速，為不同地區(qū)和不同等級的臨床實驗室降低了建立生物參考區(qū)間的難度［6］。因此，本次研究將運用間接法，通過收集并篩選廣東省第二中醫(yī)院2020年8月至2021年7月體檢健康人群的數(shù)據(jù)，建立本實驗室EBV-VCA-IgA及EBV-EA-IgA的生物參考區(qū)間，并參考WS/T 402—2012《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》中推薦的方法［7］，選取廣東省第二中醫(yī)院2021年8月至10月的體檢健康人群參與驗證，按照本文研究數(shù)據(jù)的篩選標準篩選出參考區(qū)間對應(yīng)的驗證數(shù)據(jù)，從中隨機取20個標本對其參考區(qū)間進行驗證，建立臨床較為適用的參考區(qū)間，提高臨床對EB病毒感染的確診率與及時反饋鼻咽癌患者的預(yù)后情況。

材料與方法

1.分析對象

研究所用到的體檢標本均來自廣東省第二中醫(yī)院實驗室信息管理系統(tǒng)（laboratory information management system，LIS）中2020年8月至2021年7月的體檢標本，運用Excel軟件篩選體檢標本信息中同時檢測了EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA、血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、總膽紅素（T-BILI）、直接膽紅素（D-BILI）、間接膽紅素（I-BILI）、血清肌酐（CR）及尿素氮（BUN）等的標本，共計有2 160例符合要求的體檢標本，其中男998例，女1 162例。本次研究僅對大于20歲、小于100歲的成年人進行研究。篩查標準：（1）體檢標本；（2）信息完整；（3）EB兩項（EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA）、肝功五項（ALT、AST、T-BILI、I-BILI、D-BILI）、腎功二項（CR、BUN）結(jié)果正常的體檢標本。按年齡段區(qū)分為3個年齡組：20～50歲組、≥50～70歲組以及≥70歲組。20～50歲組1 135例，男558例，女 577例；≥50～70歲組 807例，男 359例，女448例；≥70歲組218例，男81例，女137例。

本研究經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準，意見號：Z202303-004-01。

2.儀器與試劑

新產(chǎn)業(yè)MAGLUMI X8化學(xué)發(fā)光免疫分析儀、EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA抗體檢測試劑盒均購自深圳市新產(chǎn)業(yè)生物醫(yī)學(xué)工程股份有限公司。

3.方法

3.1.質(zhì)量控制 為了保證本次實驗數(shù)據(jù)準確可靠，必須要確認實驗所需要的儀器與試劑室內(nèi)質(zhì)控情況。經(jīng)檢測得出一份關(guān)于EBV-VCA-IgA/EBV-EA-IgA性能驗證報告，EBV-VCA-IgA的實驗室變異系數(shù)（%）為Level 1（低水平）：3.978%，Level 2（高水平）：2.337%；EBV-EA-IgA的實驗室變異系數(shù)（%）為Level 1（低水平）：6.078%，Level 2（高水平）：4.131%。以上兩項目的變異系數(shù)都低于廠商提供的變異系數(shù)10%，證明本次結(jié)果均符合實驗室中的質(zhì)控標準。

3.2.數(shù)據(jù)導(dǎo)出 體檢標本包括EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA、ALT、AST、T-BILI、I-BILI、D-BILI、CR、BUN的體檢標本信息、性別以及檢測結(jié)果，并且以患者ID號為唯一標準，刪除重復(fù)與信息缺失的數(shù)據(jù)結(jié)果。

3.3.數(shù)據(jù)剔除 運用K-S檢驗對各性別組以及年齡組進行正態(tài)性分析，P＞0.05為正態(tài)分布，P＜0.05為非正態(tài)分布。對于非正態(tài)分布的組別需要用非參數(shù)法進行檢驗，運用統(tǒng)計學(xué)分析得出各組別的上下四分位數(shù)（P75，P25），計算各組的四分位間距（IQR），并且繪制箱式圖，剔除大于P25-3×IQR和小于P75+3×IQR的數(shù)據(jù)。

3.4.數(shù)據(jù)分組 對EB病毒的兩個檢測項目先進行性別分組，兩組比較使用Mann-WhitneyU檢驗，再進行年齡分組，年齡組分為20～50歲組、≥50～70歲以及≥70歲這3個組別（各組數(shù)據(jù)均符合WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》中規(guī)定最少檢測數(shù)量為120例）［7］。3組及以上使用Kruskal-Wallis（K-W）秩和檢驗，3組及以上的兩兩比較使用DunnettT3檢驗。對差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）的年齡組進行合并分析，若再無統(tǒng)計學(xué)意義便暫時不考慮建立該組的生物參考區(qū)間。對差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）的年齡組分別建立生物參考區(qū)間。

3.5.建立生物參考區(qū)間 根據(jù)性別與年齡組進行分組篩選，對結(jié)果進行正態(tài)性檢驗，比對組間VCA-IgA和EA-IgA的水平是否存在差異。繪制箱式圖對于非正態(tài)分布的結(jié)果進行離群值的剔除后，選用非參數(shù)法檢驗計算出第2.5個百分位數(shù)（P2.5）作為VCA-IgA和EA-IgA生物參考區(qū)間的上限值，第97.5個百分位數(shù)（P97.5）作為VCA-IgA和EA-IgA生物參考區(qū)間的下限值。

3.6.驗證生物參考區(qū)間 參照WS/T 402-2012《臨床實驗室檢驗項目參考區(qū)間的制定》中推薦的方法［7］，隨機抽取20例2021年8月的體檢健康人群標本進行驗證，如果檢測結(jié)果中有90%以上的結(jié)果均分布在新建立的參考區(qū)間范圍內(nèi)，則證明該生物參考區(qū)間適用。如果第1次試驗不通過驗證，則需要重新篩選20例標本進行2次驗證，如再次驗證失敗，證明該生物參考區(qū)間不適用。

4.統(tǒng)計學(xué)方法

運用 SPSS 20.0中的 Kolmogorov Smirnov（K-S）檢驗對各性別組以及年齡組進行正態(tài)性分析，P＞0.05為正態(tài)分布，P＜0.05為非正態(tài)分布，得出的結(jié)果結(jié)合K-S檢驗的統(tǒng)計結(jié)果可分析出，男女性別組及年齡組的檢驗結(jié)果是否為正態(tài)分布，如數(shù)據(jù)分析后呈正態(tài)分布，則可以使用參數(shù)檢驗對其進行分析；若結(jié)果非正態(tài)分布，則使用非參數(shù)檢驗中Mann-WhitneyU檢驗分析男女性別差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義，再繪制箱式圖，剔除離群值。男女性別組間比較使用Mann-WhitneyU檢驗；年齡組間比較則使用非參數(shù)檢驗中K-W秩和檢驗法并使用Dunnett T3法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義

結(jié) 果

1.各項數(shù)據(jù)的分布情況

將篩查分類后的各組EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA數(shù)據(jù)進行K-S檢驗，結(jié)果如圖1～3所示，各組數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布，使用非參數(shù)檢驗法。同時，建立各組數(shù)據(jù)的箱式圖，根據(jù)箱式圖剔除離群值，用非參數(shù)檢驗各組間差異。

圖2 2 189例健康體檢人群按年齡分組的EB病毒早期抗原抗體（EBV-EA-IgA）、EB病毒衣殼抗原抗體（EBV-VCA-IgA）數(shù)據(jù)直方圖。A為20～50歲組EBV-EA-IgA數(shù)據(jù)，B為20～50歲組EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，C為≥50～70歲組EBV-EA-IgA數(shù)據(jù)，D為≥50～70歲組EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，E為≥70歲組EBV-EA-IgA數(shù)據(jù)，F(xiàn)為≥70歲組EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)

圖3 EB病毒衣殼抗原抗體（EBV-VCA-IgA）男女年齡組數(shù)據(jù)的直方圖。A為20～50歲組男性EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，B為20～50歲組女性EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，C為≥50～70歲組男性EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，D為≥50～70歲組女性EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，E為≥70歲組男性EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)，F(xiàn)為≥70歲組女性EBV-VCA-IgA數(shù)據(jù)

2.分析性別組間的參考區(qū)間

運用Mann-WhitneyU檢驗，對EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA性別結(jié)果分別進行分析，結(jié)果顯示EBV-VCA-IgA 性 別 差 異 有 統(tǒng) 計 學(xué) 意 義（P＜0.001），EBV-EA-IgA性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.127），證明EBV-VCA-IgA的生物參考區(qū)間需要區(qū)分性別。

3.分析各項目年齡組間的參考區(qū)間

EBV-EA-IgA性別差異無統(tǒng)計學(xué)意義，EBV-VCA-IgA男女性別間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，EBV-EA-IgA項目按20～50歲、≥50～70歲及≥70歲分成3組，EBV-VCA-IgA項目在性別分組的基礎(chǔ)上分別按20～50歲、≥50～70歲及≥70歲分成3組。將各個項目的年齡組間進行非參數(shù)檢驗中獨立樣本K-W秩和檢驗法得出，EBV-VCA-IgA、EBV-VCA-IgA男性、EBV-VCA-IgA女性年齡組別間，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.087、0.294、0.087），所以不需要建立年齡分組的參考區(qū)間。僅有EBV-EA-IgA年齡組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.004），即EBV-EA-IgA年齡組需要將其分別進行參考區(qū)間的建立。接著，使用Dunnett T3法對EBV-EA-IgA的年齡分組進行兩兩比較。如圖4所示，20～50歲與≥50～70歲組之間，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.002、P＜0.001），故合并為一組（20～70歲），與≥70歲組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001）。

圖4 2 189例健康體檢人群按年齡分組后組間EB病毒早期抗原抗體（EBV-EA-IgA）比較

另外，通過擬合線性的散點圖（圖5）可以看出，EBV-EA-IgA隨年齡增長其檢測值有所增高，主要反映在女性人群。而EBV-VCA-IgA無論男性或女性均無明顯趨勢。

圖5 各項目組的擬合線性散點圖。A為2 160例健康體檢人群的EA-IgA擬合線性散點圖，B為男性的EA-IgA擬合線性散點圖，C為女性的EA-IgA擬合線性散點圖，D為2 160例健康體檢人群的VCA-IgA擬合線性散點圖，E為男性VCA-IgA擬合線性散點圖，F(xiàn)為女性的VCA-IgA擬合線性散點圖

4.生物參考區(qū)間的建立

由于此次建立生物參考區(qū)間是使用的間接法，所以要使用非參數(shù)檢驗對本次結(jié)果的2.5百分位數(shù)和97.5百分位數(shù)的數(shù)據(jù)作為生物參考區(qū)間。離群值經(jīng)剔除后，對差異有統(tǒng)計學(xué)意義的組別進行P2.5和P97.5分布點位的計算，根據(jù)百分位數(shù)（P2.5～P97.5）建立各個組別的生物參考區(qū)間，分別是EBV-VCA-IgA：男性0.34～3.88 AU/ml，女 性 0.32～3.71 AU/ml；EBV-EA-IgA：20～70 歲 ：0.01～1.39 AU/ml，≥70歲：0.01～1.52 AU/ml（廠家提供的生物參考區(qū)間EBV-VCA-IgA為0～4、EBV-EA-IgA為0.00～3.00）。

5.生物參考區(qū)間的驗證

使用隨機抽樣法抽取2021年8月至10月的符合條件的體檢標本，對有年齡分組的生物參考區(qū)間進行年齡分層隨機抽樣法抽取體檢標本，對有性別分組的生物參考區(qū)間進行性別分層隨機抽樣法抽取體檢標本。為各組的生物參考區(qū)間隨機抽取20例標本進行驗證，驗證以18個以上的結(jié)果在建立的參考區(qū)間內(nèi)為通過，驗證次數(shù)不能多于2次。運用Excel軟件，進行驗證各組參考區(qū)間的可靠性，EBV-VCA-IgA男性組、EBV-VCA-IgA女性組、EBV-EA-IgA 20～70歲組、EBV-EA-IgA≥70歲組的生物參考區(qū)間通過驗證要求。所以，此次研究建立的生物參考區(qū)間驗證通過，符合臨床實驗室標準要求。

討 論

使用直接法建立的生物參考區(qū)間相對間接法來說更可靠且適用，這也是國際臨床實驗室標準推薦的建立生物參考區(qū)間方法［5］。但對直接法來說，健康人群選擇是一個很復(fù)雜的問題，根據(jù)不同項目組合去篩選健康人群與因不同疾病在不同人群中產(chǎn)生的亞臨床狀態(tài)，這些細微的差異都會直接引起生物參考區(qū)間的差異。長此以往，諸多不便利的因素使國內(nèi)的臨床實驗室仍在使用試劑廠商提供的參考區(qū)間，特別是購入國外廠商的試劑，他們是根據(jù)外國人的身體檢查數(shù)據(jù)所建立的生物參考區(qū)間，與國內(nèi)人群因飲食、文化、生活環(huán)境的差異導(dǎo)致兩者會產(chǎn)生兩種截然不同的參考區(qū)間。在Fraser［8］報道中，也指出了各個項目的生物參考值并不是一個固定的常數(shù)，其中生物與生俱來的變異性對每個臨床檢驗項目都造成了一定影響。我國衛(wèi)生部門在2012年頒布了一套生化與血常規(guī)部分項目的標準后，國內(nèi)的臨床實驗室才有了較為規(guī)范的行業(yè)標準。

用間接法建立生物參考區(qū)間需要以大量數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，所以，這次使用的體檢人群數(shù)據(jù)結(jié)果會存在一定數(shù)量的離群值，間接法的弊端之一就是離群值［9］。建立參考區(qū)間需要將離群值剔除，本次實驗數(shù)據(jù)均為非正態(tài)分布，采用箱式圖將離群值剔除。觀察近幾年各文章所使用的方法［10-11］，不同剔除方式都有不同的適用范圍，應(yīng)根據(jù)數(shù)據(jù)的分布與數(shù)量進行篩選合適的剔除方式。本研究采取了大于P25-3×IQR和小于P75+3×IQR作為數(shù)據(jù)剔除標準。

廣州是鼻咽癌高風(fēng)險地區(qū)，EB相關(guān)定量檢測的生物參考區(qū)間建立未見相關(guān)報道。因此，本次研究的主旨在于能夠初步建立本實驗室EBV-VCA-IgA及EBV-EA-IgA定量檢測的生物參考區(qū)間。檢測EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA等EBV相關(guān)抗體是篩查和輔助診斷常用方法。對于EB病毒抗原抗體來說，其臨床意義在于當檢測的數(shù)值高于參考區(qū)間提供的上限時，提示機體可能存在潛在的鼻咽癌風(fēng)險或反映鼻咽癌的治療預(yù)后效果［12］。所以EBV-VCA-IgA和EBV-EA-IgA的參考區(qū)間上限比下限更具有臨床意義，與廠家推薦的參考區(qū)間上限進行比較，發(fā)現(xiàn)新建立的參考區(qū)間范圍更加精準，測量范圍更小。

本研究發(fā)現(xiàn)，EBV-VCA-IgA在性別分組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并且男性的參考范圍上限值比女性偏高。另外，EBV-VCA-IgA在年齡分組上差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故未作下一步分組。EBV-EA-IgA在性別分組上差異無統(tǒng)計學(xué)意義。據(jù)研究，EBV-EA-IgA在不同年齡段的陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其中，中老年區(qū)間EBV-EA-IgA的陽性率較高［13］。這與本文研究結(jié)果一致，EBV-EA-IgA在年齡分組上差異有統(tǒng)計學(xué)意義，并劃分了20～70歲及≥70歲的年齡段參考范圍，并呈現(xiàn)出隨著年齡增長而增長的趨勢（圖4），提示EBV-EA-IgA在健康人群中可能會隨著年齡的變化而變化。因此，對于不同年齡段的人群可能應(yīng)選擇不同的診斷界值，才能提高患者的診斷率。而EBV-VCA-IgA不會因年齡的變化而大幅度波動（圖4），因此不需要建立年齡分組的參考區(qū)間。

據(jù)李曉華等［14］報道，健康人群中EBV-VCA-IgA的男女間rA值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與本文研究的結(jié)果不一致。分析原因如下：一，檢測方法不一致，李曉華等研究的方法是ELISA（定性），而本文研究的是化學(xué)發(fā)光法（定量）；二，本研究無法完全篩除體檢標本中可能存在的慢性病、遺傳病以及各類疾患等；三，標本數(shù)量不夠多，無法抹去因?qū)嶒灁?shù)據(jù)不足帶來偏移的可能；四，在用間接法建立生物參考區(qū)間時，我們沒有使用兩種或以上的檢驗方法，以得出更符合臨床實驗室的生物參考區(qū)間。另外，我們分析數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)EBV-VCA-IgA的男女參考區(qū)間上限值差異不大?？紤]到分組的意義，其性別分組的參考區(qū)間尚待進一步完善和驗證。

結(jié) 論

目前，大部分醫(yī)院檢驗科的信息化建設(shè)已逐漸完善，利用間接法驗證和建立參考范圍的條件已逐漸成熟。本研究利用間接法初次建立本實驗室EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA的生物參考區(qū)間，結(jié)果表明，廠家推薦的參考區(qū)間可能不適用于所有地區(qū)及人群，利用實驗室大數(shù)據(jù)進行參考區(qū)間的建立和驗證具有一定的研究價值。本研究得出的EBV-VCA-IgA、EBV-EA-IgA性別及年齡分組的參考區(qū)間具有一定的實際意義與參考價值。但由于標本數(shù)量不足、篩選標準不夠嚴格等，無法建立更精確的生物參考區(qū)間。同時，單一的方法學(xué)檢驗存在的缺陷，也沒有使用其他檢驗方法進行彌補。所以，此次建立的生物參考區(qū)間不夠完善，為本實驗室提供更為準確的EBV-VCA-IgA與EBV-EA-IgA生物參考區(qū)間還需要進一步完善和驗證。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明麥冬媚：醞釀和設(shè)計試驗，起草文章，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析；沈樂：采集數(shù)據(jù)，分析/解釋數(shù)據(jù)；譚俊青：指導(dǎo)，支持性貢獻