杜微波，張志強，陳敬然，萬瑩瑩，沈建梅

（北京康仁堂藥業(yè)有限公司，中藥配方顆粒關(guān)鍵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，北京市中藥配方顆粒工程技術(shù)研究中心，北京 101301）

柴胡為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狹葉柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根，按性狀分別習稱“北柴胡”和“南柴胡”，其中北柴胡為臨床常用藥。北柴胡中主要藥效成分為柴胡皂苷（SS），具有抗菌、解熱、鎮(zhèn)靜、抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用［1］。 SS 包含柴胡皂苷a（SSa）、柴胡皂苷c（SSc）、柴胡皂苷d（SSd）、柴胡皂苷f（SSf）等原生苷，柴胡皂苷b1（SSb1）、柴胡皂苷b2（SSb2）等次生苷。 近年來，學者采用高效液相色譜-紫外檢測（HPLC-UV）法測 定SSa［2］或SSa+SSd［3-5］或SSa+SSc+SSd［6-9］或SSa+SSb2+SSc+SSd［10］或SSa+SSb2+SSc+SSd+SSf［11］、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測（HPLC-ELSD）測定SSa［12］或SSa+SSd［13-14］或SSa+SSc+SSd+SSf［15］、液 相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HPLC-MS）測定SSa+SSd［16］等，為北柴胡的質(zhì)量評價提供了一定的參考信息。

中藥標準湯劑是飲片以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，臨床應(yīng)用為基礎(chǔ)，經(jīng)標準化工藝制備而成的水煎液。 在工藝過程中要關(guān)注各個成分是否存在轉(zhuǎn)化、降解等現(xiàn)象，當成分的量傳遞較低，說明該成分在中藥標準湯劑中轉(zhuǎn)移較差或者發(fā)生分解（即負轉(zhuǎn)化），若為主要活性成分，在生產(chǎn)中則需要進行控制，保證其臨床藥效，當成分的量傳遞明顯過高時，說明該成分在中藥標準湯劑中得到富集或由其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來（即正轉(zhuǎn)化），則應(yīng)重點監(jiān)控，控制富集或正轉(zhuǎn)化程度，保證其臨床應(yīng)用的安全性。 因此，對成分的量值傳遞規(guī)律研究是中藥標準湯劑的關(guān)鍵步驟，其決定了以中藥標準湯劑為參照而制定的中藥配方顆粒工藝的穩(wěn)定性及所得產(chǎn)品的安全有效性。

《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標準制定技術(shù)要求》（《技術(shù)要求》）也明確了對量值傳遞的要求，“以出膏率、含量及含量轉(zhuǎn)移率、指紋圖譜或特征圖譜、浸出物等的值為表征，詳細說明生產(chǎn)全過程的量值傳遞情況”［17］。目前對于如何利用指紋圖譜或特征圖譜進行量值傳遞還處于摸索階段，雖然現(xiàn)有研究嘗試以相似度、峰相對保留時間及峰數(shù)目等方式描述標準湯劑化學成分的變化，但均屬于定性評價，不適用于物質(zhì)傳遞規(guī)律的分析［18-20］。

本研究以北柴胡為例，基于目前對北柴胡化學成分的研究情況，針對SS 進行特征圖譜研究，采用雙波長對北柴胡標準湯劑中的原生苷和次生苷進行監(jiān)測。 并參照含量轉(zhuǎn)移率，建立了以標準湯劑、飲片中單位濃度下特征峰峰面積、標準湯劑出膏率為因子的公式，計算K 值，在不需要測定各特征峰含量的前提下描述標準湯劑中SS 的量值傳遞，明確北柴胡標準湯劑的傳遞規(guī)律，用于指導(dǎo)北柴胡配方顆粒及含北柴胡經(jīng)典名方制劑的生產(chǎn)研究及質(zhì)量標準制定。

1 材料

表1 北柴胡材料來源

2 方法

2.1 北柴胡標準湯劑制備及出膏率測定

將北柴胡藥材按2020 年版《中國藥典》柴胡飲片炮制的規(guī)定進行炮制，獲得北柴胡飲片。 取飲片適量于砂鍋中，浸泡30 min，一煎加入飲片量9 倍水，武火（500 W）煮沸后，文火（200 W）煎煮20 min，趁熱過濾，迅速冷卻，備用；二煎加飲片量6 倍水，武火煮沸后，文火煎煮15 min，趁熱過濾，迅速冷卻備用，合并二次煎煮濾液，在50 ℃以下濃縮，濃縮至料液比約為1∶1，冷凍干燥，即獲得北柴胡標準湯劑。稱定北柴胡標準湯劑質(zhì)量，計算出膏率。

2.2 特征圖譜方法

2.2.1 對照品溶液的制備

取SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 對照品適量，精密稱定，加甲醇制成1 mL 含SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 75 μg 的溶液，搖勻，即得。

2.2.2 供試品溶液制備

取標準湯劑及飲片粉末（過三號篩）適量，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含5%濃氨試液的50%乙醇25 mL，密塞，稱重，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱重，用5%濃氨試液的50%乙醇補足減失的粉量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，柱長為10 cm，柱內(nèi)徑為2.1 mm，粒徑為1.7 μm；以乙腈為流動相A，以水為流動相B，按表2 中的規(guī)定進行梯度洗脫；檢測波長為211 nm、250 nm；柱溫35 ℃；流速0.4 mL/min；進樣體積各3 μL。理論板數(shù)按SSa 峰計算，應(yīng)不低于10 000。

表2 北柴胡標準湯劑流動相梯度洗脫程序

2.2.4 特征峰確認

測定18 批北柴胡標準湯劑、飲片特征圖譜，使用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.1 版本）［21］，按中位數(shù)計算，進行共有峰標識，生成對照圖譜，并利用SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 對照品溶液進行特征峰確定。

2.2.5 方法學考察

2.2.5.1 重復(fù)性試驗

按2.2.2 項下方法制備供試品溶液6 份，記錄其特征圖譜，以SSa 為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.2.5.2 中間精密度試驗

采用不同儀器（島津超高效液相色譜儀LC-30AD），按2.2.2 項下方法獲得6 份供試品溶液的特征圖譜，SSa 為參照峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h 進樣測定，記錄色譜圖，并以SSa 為參照物峰，計算各特征峰的相對保留時間和相對峰面積。

2.3 飲片至標準湯劑量值傳遞分析

按2.2.2 項“供試品制備方法”制備18 批標準湯劑、飲片供試品溶液，按2.2.3 項色譜條件測定其特征圖譜，以獲得的特征圖譜數(shù)據(jù)，計算K 值，分析飲片至標準湯劑物質(zhì)傳遞情況。

3 結(jié)果

3.1 特征峰確認

采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2012.1 版本），按中位數(shù)計算，對18 批北柴胡標準湯劑進行共有峰標識，生成的對照圖譜見圖1。

圖1 18 批北柴胡標準湯劑對照圖譜

通 過 對 比SSa、SSb1、SSb2、SSc、SSd、SSf 對 照 品溶液，分析確定了211 nm 下峰1 為SSc，峰2 為SSf，峰3 為SSa，峰4 為SSb2；250 nm 下峰6 為SSa，峰7為SSb2，峰9 為SSb1。 見圖2。

圖2 北柴胡標準湯劑特征圖譜特征峰確認

3.2 特征圖譜方法學

3.2.1 重復(fù)性試驗

各特征峰相對保留時間的相對標準偏差（RSD）為0.11%～0.26%，相對峰面積的RSD 為1.07%～2.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.2.2 中間精密度試驗

各特征峰的相對保留時間的RSD 為0.1%～0.2%，相對峰面積的RSD 為0.3%～1.6%。 不同儀器間相對保留時間RSD 范圍為0.1%～0.5%，相對峰面積RSD 范圍為1.5%～21.8%，結(jié)果表明該特征圖譜的在不同儀器間相對保留時間符合分析要求，不同儀器間相對峰面積差異較大。

3.2.3 穩(wěn)定性試驗

各特征峰的相對保留時間RSD 為0.1%～4.0%，相對峰面積的RSD 為1.0%～4.1%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)測定結(jié)果穩(wěn)定。

3.3 飲片至標準湯劑物質(zhì)傳遞分析

以18 批北柴胡飲片及標準湯劑特征峰峰面積、樣品濃度及出膏率計算K 值，結(jié)果見表3。

表3 18 批北柴胡中柴胡皂苷的K 值

由表3 可知，18 批北柴胡飲片與北柴胡標準湯劑的各峰量值傳遞的K 值趨勢一致，但傳遞的效率不一。其中峰1、2、3、4、8 的K 值小于1，表明該類成分至標準湯劑中不易轉(zhuǎn)移或發(fā)生分解（即負轉(zhuǎn)化），峰7、9 的K 值大于1，表明該類成分至標準湯劑中得到富集或存在物質(zhì)的正轉(zhuǎn)化過程，而峰5、峰6 在不同批次中傳遞趨勢不同。

4 討論

北柴胡主要化學成分為皂苷、黃酮、揮發(fā)油、甾醇、香豆素、多糖類、木脂素等，具有解熱、抗炎、抗病毒、抗細菌內(nèi)毒素、抗腫瘤、保肝、降血脂、抗驚厥、提高免疫力等作用，其中生理活性較強有皂苷、黃酮、揮發(fā)油等［22］。 北柴胡標準湯劑是中藥飲片的水煎液，因此物質(zhì)基礎(chǔ)主要為水溶性成分。 梳理活性成分發(fā)現(xiàn)，黃酮類成分多為水溶性，但該類成分主要分布于地上部分［23］，根中含量較低；揮發(fā)油成分由于其揮發(fā)性，湯劑中不易獲得。 SS 為柴胡主要活性成分，且水溶性較好，為本研究的目標分析物質(zhì)。 由于SS 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，在酸性及高溫等條件下，原生苷易降解為次生苷。 因此，針對標準湯劑中原生苷與次生苷成分，利用UPLC 建立了真實反映標準湯劑物質(zhì)成分的特征圖譜方法。

指標成分轉(zhuǎn)移率是以成分含量的相對值進行定量評價，能夠表明物質(zhì)成分的變化趨勢，但僅適用于有對照品參照的成分。 本研究參照指標成分轉(zhuǎn)移率公式，以特征峰峰面積、樣品濃度、出膏率為因子，建立基于特征圖譜分析物質(zhì)傳遞規(guī)律的K 值。 K 值是以峰面積進行比對，不需引入成分對照品進行含量測定，在缺少成分對照品的前提下也能夠進行分析，同時降低了多因子對于結(jié)果分析的影響，能夠科學分析標準湯劑量值傳遞規(guī)律。

由表3 可知，飲片至標準湯劑過程中主要物質(zhì)都進行了傳遞，但傳遞效率不一。 峰1、2、3 分別為211 nm 下的SSc、SSf、SSa，由于轉(zhuǎn)化為次生皂苷，因此較小，多在0.10 左右。峰6 為250 nm 下的SSa，而SSa 末端紫外吸收，因此在250 nm 上靈敏度較差，導(dǎo)致傳遞趨勢不一；同樣峰4 為211 nm 下的次生皂苷SSb2，在211 nm 上靈敏度較差，SSb2的傳遞規(guī)律以250 nm 峰7 為 參 照。 峰7、9 為 次 生 苷SSb2和SSb1，K 值均大于1，這與原生苷SSa、SSd 在標準湯劑中不同程度的轉(zhuǎn)化有關(guān)。 根據(jù)文獻報道SSa 轉(zhuǎn)化為SSb1，SSd 轉(zhuǎn)化為SSb2，對比SSb1與SSb2的K 值可知，SSb2K 值大于SSb1，說明SSd 轉(zhuǎn)化程度較大，這與李軍等［24］對水煎液中SSa、SSd 的溶出與轉(zhuǎn)化差異研究結(jié)果一致。 綜上，北柴胡標準湯劑物質(zhì)傳遞規(guī)律符合SS 成分特性，表明K 值能夠準確分析標準湯劑制備過程中物質(zhì)的變化規(guī)律。 根據(jù)《技術(shù)要求》中藥配方顆粒應(yīng)以標準湯劑為參照物的要求，應(yīng)根據(jù)北柴胡標準湯劑制備過程中物質(zhì)的變化規(guī)律及各化學成分對北柴胡功效的影響，對北柴胡配方顆粒的質(zhì)量控制指標進行轉(zhuǎn)變，應(yīng)由傳統(tǒng)的SSa+SSd轉(zhuǎn)變?yōu)镾Sa 或SSa+SSb2，同時在配方顆粒生產(chǎn)過程中，也應(yīng)著重對各工藝環(huán)節(jié)影響上述指標的因素進行研究，控制SSa 負轉(zhuǎn)化及SSb2正轉(zhuǎn)化的程度，確保成分的量與標準湯劑相當，保證配方顆粒與標準湯劑的一致性。

本研究利用北柴胡標準湯劑專屬性UPLC 特征圖譜方法，結(jié)合K 值，明確飲片至標準湯劑中各化學成分的傳遞情況，可根據(jù)《技術(shù)要求》明確可接受范圍，用于指導(dǎo)以標準湯劑為參照的北柴胡配方顆粒生產(chǎn)全過程，保證臨床用藥的安全性、有效性，為其他藥材標準湯劑量值傳遞規(guī)律的分析提供參考。