矯春晶 李明月 張 鵬

（東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，森林生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)經(jīng)營教育部重點實驗室，哈爾濱 150040）

種子休眠受遺傳背景、內(nèi)源激素或環(huán)境條件等多方面的調(diào)控［1］。與在成熟過程中形成的初生休眠相比，原來不休眠或解除休眠后的種子由于不適宜的環(huán)境條件誘發(fā)的次生休眠易被忽視［2］。在全球氣候變化的背景下，次生休眠現(xiàn)象在自然界中越發(fā)普遍，其中以高溫條件導(dǎo)致的次生休眠（熱休眠）最為典型［3］，如大麥（Hordeum vulgare）、萵苣（Lactuca sativa）和芹菜（Apium graveolens）等經(jīng)濟作物種子在過高溫度（30 ℃）條件下會發(fā)生熱休眠［4-5］，由此產(chǎn)生對農(nóng)林生產(chǎn)的不利影響也越發(fā)突出，逐漸引起人們的重視。關(guān)于種子熱休眠的研究，目前多集中在具有淺休眠的植物種子，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）、油菜（Brassica campestris）、萹蓄（Polygonum aviculare）等［6-8］，對深休眠的種子研究有限，已知在水曲柳（Fraxinus mandshurica）、紅松（Pinus koraiensis）等林木種子上有初步探索［9-10］。有研究表明初生休眠程度高的種子更易誘導(dǎo)發(fā)生次生休眠［2］，因此如何預(yù)防或減弱深休眠屬性的種子次生休眠現(xiàn)象對實際生產(chǎn)有重要意義。

目前針對種子熱休眠的預(yù)防或解除條件的研究已有關(guān)注，主要是針對單一處理方式，如激素浸種、引發(fā)技術(shù)或滲透調(diào)節(jié)等［10-12］。赤霉素（GA3）、乙烯利（ETH）或激動素（KT）等浸種處理對熱休眠都有明顯減弱作用，但不同激素對同一物種發(fā)揮的促進效果也存在差異，且各激素間的作用不是完全獨立的，如KT 和GA3浸種對解除萵苣種子的熱休眠都有作用，但KT 處理的效果更顯著［13］。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用-1.25 MPa 聚乙二醇（PEG）8000 與殺菌劑混合滲透引發(fā)對減弱種子熱休眠的效果明顯好于單獨PEG 引發(fā)［14］。若將滲透處理與外源激素浸種聯(lián)用能否提高激素對種子熱休眠的作用效果尚鮮見研究報道。

水曲柳種子在高溫（≥25 ℃）下持續(xù)培養(yǎng)3 d以上會誘導(dǎo)熱休眠［10］。研究發(fā)現(xiàn)赤霉素（GA4+7）和ETH 浸種能夠減弱水曲柳種子熱休眠［12］；質(zhì)量分數(shù)50% PEG 6000 溶液滲透處理7 d 能夠抑制熱休眠，伴隨著赤霉素和乙烯利等內(nèi)源激素水平升高，脫落酸含量降低等生理變化［11］。但將上述兩種處理同時用于水曲柳種子是否對抑制熱休眠發(fā)揮作用尚不清楚。由此，提出假設(shè)：外源激素浸種與PEG 滲透處理聯(lián)用對水曲柳種子熱休眠起到抑制作用，且抑制效果比單獨激素處理更顯著。為驗證這一假設(shè)，將解除初生休眠的水曲柳種子用赤霉素（GA4+7）、細胞分裂素（6-BA）和ETH 溶液浸泡24 h 后，在誘導(dǎo)熱休眠的溫度（25 ℃）下用不同濃度PEG 溶液處理7 d，比較處理后種子在適溫（10 ℃）下的萌發(fā)能力、內(nèi)源激素含量和酶活力的變化情況，探究二者聯(lián)用對水曲柳種子熱休眠的影響，從而豐富種子次生休眠調(diào)控理論，并指導(dǎo)播種育苗生產(chǎn)實踐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用種子采自吉林省露水河林業(yè)局水曲柳成年樹。在2017 年3 月開始對種子進行變溫裸（無基質(zhì)）層積處理，時間：18 ℃/12 周+5 ℃/10周［3］。層積結(jié)束后將種子干燥至含水率8%～9%，-20 ℃保存，以解除初生休眠的種子為材料。

1.2 研究方法

1.2.1 試驗設(shè)計

采用雙因素試驗設(shè)計，因素一為外源激素浸種，設(shè)置4個水平，分別為GA4+7、6-BA、ETH 和蒸餾水浸種，溶液濃度均為1 mmol·L-1；因素二為PEG 6000 滲透處理，設(shè)置4 個水平，滲透液質(zhì)量分數(shù)分別為0、5%、25%、50%，滲透處理溫度為25 ℃，時間為7 d。共16種處理。于2017年9月開始試驗。

1.2.2 溶液的配制

用蒸餾水配制1 mmol·L-1GA4+7、6-BA、ETH 溶液；PEG 6000 與蒸餾水配制成質(zhì)量分數(shù)0（蒸餾水）、5%、25%和50%溶液備用。

1.2.3 種子處理

取適量種子在黑暗條件蒸餾水浸泡24 h，然后分別用1 mmol·L-1GA4+7、6-BA、ETH 溶液浸種24 h，以蒸餾水浸種24 h 為對照，浸種后用流水沖洗干凈。分別置于底部鋪有一層干凈濾紙的塑料培養(yǎng)皿中，向皿中加入上述不同質(zhì)量分數(shù)PEG 溶液10 mL（對照加蒸餾水10 mL），于25 ℃黑暗條件培養(yǎng)7 d，期間每3 d 更換同濃度溶液，滲透處理結(jié)束后種子用蒸餾水沖洗干凈，用于發(fā)芽試驗和相關(guān)生理指標(biāo)的測定。

1.2.4 發(fā)芽試驗

將上述處理好的種子分別轉(zhuǎn)移至底部鋪有一層濕潤濾紙（蒸餾水）的塑料培養(yǎng)皿中，每皿25 粒種子，4次重復(fù)，放于適宜條件（10 ℃黑暗）下培養(yǎng)，定期向皿中補充蒸餾水以保證發(fā)芽環(huán)境濕潤。以胚根突破種皮超過2 mm 作為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，定期觀察記錄發(fā)芽情況，萌發(fā)周期30 d。試驗結(jié)束后計算種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)及平均發(fā)芽時間，公式如下：

式中：tg表示發(fā)芽時間；ng表示與tg對應(yīng)的發(fā)芽種子數(shù)量。

1.2.5 生理指標(biāo)測定

根據(jù)單獨激素處理與激素+PEG 處理間種子發(fā)芽能力的顯著差異，確定對水+50% PEG、6-BA、6-BA+50% PEG、ETH、ETH+50% PEG 共5 種處理于2017 年11 月進行生理指標(biāo)的測定。以種子置于培養(yǎng)皿當(dāng)日記為0 d，分別于第0、3、7、10、14 d分離種胚、胚乳，各取樣2 g 測定胚乳纖維素酶和果膠酶的活力，具體方法參照3，5-二硝基水楊酸（DNS）法［12］；另取樣1 g，液氮速凍后于-80 ℃保存，通過高效液相色譜法［12］測定各組織中赤霉素（GA3）和脫落酸（ABA）的含量。每個處理取樣重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用Excel 2016 整理數(shù)據(jù)。使用SPSS 18.0 統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。采用雙因素方差分析不同外源激素浸種與PEG 滲透處理聯(lián)用對水曲柳種子萌發(fā)能力（發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間）、細胞壁降解酶和內(nèi)源激素含量的影響，當(dāng)方差分析結(jié)果顯著時，采用Duncan 法進行多重比較。其中百分數(shù)需進行平方根反正弦轉(zhuǎn)換后再用于方差分析。采用Sigmaplot 12.5作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素浸種與PEG 滲透處理對水曲柳種子發(fā)芽能力的影響

外源激素浸種、PEG 滲透處理及兩者的交互作用對水曲柳種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和平均發(fā)芽時間影響均極顯著（P＜0.01）（見表1）。

表1 不同外源激素浸種與滲透處理對水曲柳種子發(fā)芽能力影響的方差分析結(jié)果Table 1 Analysis of variance of different exogenous hormones soaking and osmotic treatment on seeds germination ability of F.mandshurica

在不同質(zhì)量分數(shù)PEG滲透處理下，3種激素處理（ETH+50% PEG 除外）的種子發(fā)芽率均高于對照。GA4+7處理的種子發(fā)芽率隨PEG質(zhì)量分數(shù)的升高變化不明顯；6-BA 和ETH 處理的種子發(fā)芽率隨PEG 質(zhì)量分數(shù)的升高呈上升趨勢。與單獨激素處理相比，激素和滲透處理聯(lián)用對種子發(fā)芽率的顯著促進作用僅在6-BA 和ETH 處理中體現(xiàn)，其中6-BA+25% PEG 處理提高69.31%，ETH+50% PEG處理提高43.42%（見表2）。

在不同質(zhì)量分數(shù)PEG滲透處理下，3種激素處理（ETH+50% PEG 除外）的種子發(fā)芽指數(shù)均高于對照。GA4+7處理的種子發(fā)芽指數(shù)隨PEG質(zhì)量分數(shù)升高變化不明顯；6-BA 和ETH 處理的種子發(fā)芽指數(shù)隨PEG 質(zhì)量分數(shù)的升高逐漸升高。與單獨激素處理相比，激素和滲透處理聯(lián)用對種子發(fā)芽指數(shù)的促進作用表現(xiàn)在6-BA 和ETH 處理，其中6-BA+25% PEG 處理提高1.04，ETH+50% PEG 處理提高0.76（見表2）。

表2 不同外源激素浸種與PEG滲透處理后的水曲柳種子萌發(fā)情況Table 2 Germination ability of F.mandshurica seeds treated with different exogenous hormones soaking and PEG osmosis

在不同質(zhì)量分數(shù)PEG 滲透處理下，GA4+7和6-BA 處理的種子發(fā)芽時間高于對照，ETH 處理的種子發(fā)芽時間略低于對照。GA4+7處理的種子發(fā)芽時間隨PEG 質(zhì)量分數(shù)的升高略有延長；6-BA 處理的種子發(fā)芽時間隨PEG 質(zhì)量分數(shù)的升高逐漸縮短，當(dāng)與50% PEG 處理聯(lián)用時的種子發(fā)芽時間比單獨6-BA 處理縮短了7.89 d；ETH 處理的種子發(fā)芽時間隨PEG質(zhì)量分數(shù)的升高變化不明顯（表2）。

2.2 外源激素浸種與PEG 滲透處理對種子細胞壁降解酶活力的影響

ETH、6-BA 分別與50% PEG 聯(lián)用處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳纖維素酶活力變化相似（圖1：A，C）。ETH+50% PEG 和6-BA+50% PEG 處理的種子胚乳纖維素酶活力呈W 型變化，先下降再上升后降低，隨后升高。ETH+50% PEG 處理的種子胚乳纖維素酶活力在3、7、14 d 時顯著高于ETH處理；6-BA+50% PEG處理的種子胚乳纖維素酶活力僅在7 d時顯著高于6-BA處理。

ETH、6-BA 分別與50% PEG 聯(lián)用處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳果膠酶活力變化相似（圖1：B，D）。各處理的種子胚乳果膠酶活力均先上升再下降后逐漸升高。ETH+50% PEG 處理的種子胚乳果膠酶活力僅在3 d時（22.65 U·g-1）顯著高于ETH處理；6-BA+50% PEG處理的種子胚乳果膠酶活力僅在10 d時比6-BA處理略高0.23 U·g-1。

圖1 不同外源激素浸種與滲透處理的水曲柳種子萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活力變化情況A～B.ETH 浸種與滲透處理的水曲柳種子萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活力變化情況；C～D.6-BA 浸種與滲透處理的水曲柳種子萌發(fā)過程中細胞壁降解酶活力變化情況；不同小寫字母表示同一時間下不同處理間差異顯著（P＜0.05）；下同F(xiàn)ig.1 Changes in the activities of cell wall degrading enzymes during germination of F.mandshurica seeds treated with different exogenous hormones soaking and osmotic treatmentsDifferent lowercase letters in the figure indicate significant difference between different treatments at the same time（P＜0.05）；The same as below

2.3 外源激素浸種與PEG 滲透處理對種子內(nèi)源激素變化的影響

ETH 浸種和50% PEG 處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳和種胚GA 含量變化不同（圖2：A，B）。ETH+50% PEG 處理的種子胚乳GA含量先上升再下降后升高，而種胚GA 含量變化正相反；ETH 處理的種子胚乳和種胚GA 含量均先上升后逐漸下降。ETH+50% PEG 處理的種子胚乳GA 含量僅在14 d時顯著高于ETH處理，其種胚GA含量僅在10 d時顯著高于ETH處理。

ETH 浸種和50% PEG 處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳和種胚ABA 含量變化不同（圖2：C，D）。ETH+50% PEG 處理的種子胚乳ABA 含量呈S 型變化，先下降再上升后降低，而種胚ABA 含量呈M 型變化，先上升再下降后升高，隨后降低；ETH處理的種子胚乳ABA含量先上升再下降后升高，而種胚ABA 含量先升高后逐漸降低。ETH+50% PEG處理僅種子胚乳ABA含量在3、7、14 d時低于ETH處理。

ETH 浸種和50% PEG 處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳和種胚ω（GA）/ω（ABA）變化不同（圖2 E， F）。ETH+50% PEG 處理的種子胚乳ω（GA）/ω（ABA）先上升再下降后升高，而種胚ω（GA）/ω（ABA）變化趨勢正相反；ETH 處理的種子胚乳ω（GA）/ω（ABA）呈M 型變化，而種胚ω（GA）/ω（ABA）呈W 型變化。ETH+50% PEG處理的種子胚乳ω（GA）/ω（ABA）僅在14 d時顯著高于ETH 處理，其種胚ω（GA）/ω（ABA）在10 d 時顯著高于ETH處理。

圖2 ETH浸種與PEG滲透處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中不同部位內(nèi)源激素變化情況Fig.2 Changes of endogenous hormone in different parts of Fraxinus mandshurica seeds treated with ETH and PEG during germination

6-BA 浸種和50% PEG 處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳和種胚GA 含量變化不同（圖3：A，B）。6-BA+50% PEG 處理的種子胚乳GA 含量呈M 型變化，而6-BA 處理的種子胚乳GA 含量先上升后逐漸降低，同時2 種處理的種子種胚GA 含量均呈S 型變化。6-BA+50% PEG 處理的種子種胚GA含量僅在10 d時顯著高于6-BA處理。

6-BA 浸種和50% PEG 處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳和種胚ABA 含量變化不同（圖3：C，D）。6-BA+50% PEG 處理的種子胚乳和種胚ABA 含量均先升高后下降；6-BA 處理的種子胚乳ABA 含量先上升再下降后升高，而種胚ABA 含量先升高后降低。6-BA+50% PEG 處理的種子胚乳ABA 含量僅在3 d 時顯著低于6-BA 處理，其種胚ABA含量在3 d和14 d時顯著低于6-BA處理。

6-BA 浸種和50% PEG 處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中胚乳和種胚ω（GA）/ω（ABA）變化不同（圖3：E，F(xiàn)）。6-BA+50% PEG 處理的種子胚乳ω（GA）/ω（ABA）呈M 型變化；6-BA 處理的種子胚乳ω（GA）/ω（ABA）先上升后逐漸降低，同時2種處理的種子種胚ω（GA）/ω（ABA）均呈S 型變化。6-BA+50% PEG 處理的種子種胚ω（GA）/ω（ABA）僅在3 d時顯著高于6-BA處理。

圖3 6-BA浸種與PEG滲透處理的水曲柳種子在萌發(fā)過程中不同部位內(nèi)源激素變化情況Fig.3 Changes of endogenous hormone in different parts of Fraxinus mandshurica seeds treated with 6-BA and PEG during germination

3 討論

目前，外源激素處理成為調(diào)控種子休眠的常用方法，GA、IAA或ETH等都能夠減弱種子次生休眠［15-16］。PEG 性質(zhì)穩(wěn)定無毒無害，對種子具有良好的滲透性［17］。在種子萌發(fā)過程中，應(yīng)用PEG 對一些經(jīng)濟作物種子進行滲透處理，能夠有效縮短種子發(fā)芽時間［18］。若在PEG 溶液中加入某些生長調(diào)節(jié)劑，有助于進一步提高種子的萌發(fā)性能［19］，如不同濃度過氧化氫溶液與PEG 協(xié)同處理能顯著提高種子活力［20］。本研究發(fā)現(xiàn)，不同外源激素與PEG聯(lián)用對水曲柳種子熱休眠的作用表現(xiàn)不同，與單獨激素處理相比，除了GA4+7與PEG 聯(lián)用對種子發(fā)芽率無顯著影響，且發(fā)芽時間略有延長外，6-BA、ETH 浸種均隨著PEG 處理濃度的升高而逐漸增強種子的發(fā)芽能力。有研究表明赤霉素浸種是目前調(diào)控種子休眠最有效的方法之一［21］，這與本研究發(fā)現(xiàn)GA4+7處理的水曲柳種子發(fā)芽能力高于其他激素處理和激素+PEG 聯(lián)用處理的表現(xiàn)相吻合。赤霉素作為調(diào)控種子萌發(fā)的關(guān)鍵激素之一，能夠直接促進內(nèi)源赤霉素合成、調(diào)節(jié)物質(zhì)代謝及貯藏物質(zhì)的分解，協(xié)同作用調(diào)控種子萌發(fā)［22-23］。6-BA和ETH 主要通過對ABA 的拮抗作用、間接誘導(dǎo)GA 合成及增強呼吸作用來調(diào)節(jié)種子萌發(fā)［24］。對于許多物種來說，單獨應(yīng)用其中某種激素可能不會完全打破種子休眠［25］，特別是像水曲柳種子這種由高溫脅迫造成的次生休眠，單獨應(yīng)用6-BA 或ETH 處理的水曲柳種子發(fā)芽效果并不理想（21.98%；9.00%），但與不同濃度PEG 處理聯(lián)用后種子萌發(fā)能力大幅提高，特別是6-BA 與25% PEG聯(lián)用后的種子發(fā)芽率提高了69.31%，發(fā)芽時間明顯縮短。由此能夠支持本研究的部分假設(shè)：外源激素與滲透處理聯(lián)用能夠減弱水曲柳種子熱休眠，但其效果因激素種類而異，GA4+7與滲透處理聯(lián)用減弱種子熱休眠的效果沒有比單獨使用激素的效果更顯著，但6-BA 或ETH 與滲透處理聯(lián)用不但有減弱種子熱休眠的效果，而且比單獨使用激素的效果更明顯。

外源激素通過調(diào)控內(nèi)源激素變化實現(xiàn)植物不同生長發(fā)育階段的需求［26］。在種子次生休眠過程中，ABA 與GA含量變化呈顯著負相關(guān)［27］。適宜的滲透處理能夠提高酶活力，修復(fù)細胞膜損傷對環(huán)境脅迫做出響應(yīng)，提高植物抗逆性［28］，近年來對其與種子萌發(fā)關(guān)系的研究逐漸增多。本研究發(fā)現(xiàn)，與單獨激素處理相比，6-BA、ETH 與50% PEG 聯(lián)合處理的水曲柳種子種胚和胚乳ω（GA）、ω（ABA）及ω（GA）/ω（ABA）在萌發(fā)過程中均有不同程度的改變，但無明顯調(diào)控規(guī)律。有報道指出除了激素的含量變化，組織對激素的敏感性也是影響休眠的關(guān)鍵因素之一，特別是對ABA 的敏感性［29］。種子萌發(fā)不僅受GA 和ABA 兩種激素的調(diào)控，還由乙烯、細胞分裂素及外界環(huán)境諸多因子共同決定的，并且激素間的信號途徑不是單獨作用的，而是存在交叉調(diào)控［24］。與單獨激素浸種相比，6-BA、ETH 處理的種子經(jīng)滲透處理后在萌發(fā)過程中胚乳纖維素酶活力均顯著提高，而果膠酶活力無顯著變化。不同種水解酶與種子萌發(fā)過程中胚乳弱化的關(guān)系在不同物種上的表現(xiàn)雖然存在差異［18］，但主要目的都是為了促進胚乳部位淀粉和蛋白質(zhì)的水解，弱化種子周圍組織對胚根伸長的阻礙作用［30］，從而促進種子萌發(fā)。由此能夠確定：6-BA、ETH 與滲透處理聯(lián)用能夠通過提高種子胚乳纖維素酶活力來減弱水曲柳種子熱休眠，促進種子萌發(fā)。

綜上所述，外源激素與滲透處理聯(lián)用減弱水曲柳種子熱休眠的效果因激素種類而異。GA4+7與滲透處理聯(lián)用減弱種子熱休眠的效果與單獨激素處理差異不顯著， 6-BA、ETH 浸種與滲透處理聯(lián)用的效果顯著強于單獨激素處理，其中6-BA 與25% PEG、ETH 與50% PEG 聯(lián)用的效果最好，顯著提高種子胚乳纖維素酶活力，對種胚和胚乳的GA、ABA含量變化影響無顯著規(guī)律。