鄭占敏 商玉冰 周廣波 肖 迪 劉 軼 由香玲

（1.莘縣國(guó)有馬西林場(chǎng)，聊城 252400；2.國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)國(guó)有林區(qū)森林資源監(jiān)測(cè)中心，加格達(dá)奇 165000；3.林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東北林業(yè)大學(xué)），哈爾濱 150040；4.東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150040）

靈活精確地控制細(xì)胞分裂和分化是高等植物器官進(jìn)化的關(guān)鍵因素。為了了解植物的生長(zhǎng)規(guī)律，有必要揭示細(xì)胞周期與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)之間的關(guān)系。G1/S 邊界是細(xì)胞周期過(guò)程的關(guān)鍵開關(guān)，在動(dòng)物和植物之間功能保守，屬D 型細(xì)胞周期蛋白（CYCD）通路［1-2］。CYCD是G1階段的限速組件［1］。植物中，在蔗糖和植物激素的協(xié)同調(diào)控下，細(xì)胞分裂過(guò)程的G1期受到CYCDs 表達(dá)水平和活性的強(qiáng)烈影響［3-5］。小黑楊（Populus simonii × P.nigra）的CYCD家族基因PsnCYCD1；1在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中過(guò)表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞分裂并導(dǎo)致小細(xì)胞生成和細(xì)胞分裂素反應(yīng)，導(dǎo)致葉片彎曲和花序莖扭曲。此外，在PsnCYCD1；1過(guò)表達(dá)植株中，內(nèi)源基因如ASs、KNATs、EXP10和PHB的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)［6］。在小黑楊中過(guò)表達(dá)PsnCycD1；1出現(xiàn)分生組織發(fā)育異常、細(xì)胞壁變厚、葉芽及彎曲處兩側(cè)次生木質(zhì)部分化出現(xiàn)異常，導(dǎo)致莖干偏心生長(zhǎng)等表型［7］。

同源異型域—亮氨酸拉鏈（HD-Zip）蛋白為植物中所獨(dú)有的一類轉(zhuǎn)錄因子，包含序列高度保守的同源異型結(jié)構(gòu)域（HD）和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域（LZ）2 個(gè)重要的元件，具有結(jié)合特異DNA 的活性并控制其轉(zhuǎn)錄的能力［8-10］。PsnHomeobox 13（Psn-HB13）是HD-ZIP Ⅰ亞家族的成員之一，結(jié)合己有的研究，提出了該亞家族蛋白的結(jié)構(gòu)模型：除具有HD-ZIP 結(jié)構(gòu)域外，還具有酸性環(huán)境中嵌入的大疏水氨基酸殘基結(jié)構(gòu)域（AHA motif）以及羧基末端結(jié)構(gòu)域（CRT motif）和氨基末端結(jié)構(gòu)域（NRT motif）。HD-ZIP 結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合DNA 并二聚體化，AHA 結(jié)構(gòu)域具有激活轉(zhuǎn)錄的作用，而CRT 與NRT區(qū)域的保守結(jié)構(gòu)域則控制磷酸化與泛素化對(duì)轉(zhuǎn)錄激活功能從而進(jìn)行調(diào)控［11］。該亞家族已被鑒定可以調(diào)節(jié)植物維管組織以及毛狀體的發(fā)育，介導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)到、逆境脅迫應(yīng)答，對(duì)于葉片、種子發(fā)育、莖的生長(zhǎng)等方面也發(fā)揮著重要的作用，每一個(gè)基因的異位表達(dá)都會(huì)產(chǎn)生不同的表型［12-16］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，異源過(guò)表達(dá)PsnHB13的煙草（Nicotiana tabacum）出現(xiàn)葉面積變小、葉型變長(zhǎng)，根系生長(zhǎng)緩慢，花朵變小等明顯表型［17］。說(shuō)明PsnHB13基因主要對(duì)煙草葉片、根系及花的生長(zhǎng)發(fā)育起到負(fù)調(diào)控作用。

PsnHomeobox 15（PsnHB15）是HD-Zip IIII 亞家族的成員之一，該亞家族的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除具有HD 和ZIP 結(jié)構(gòu)域外，從N 端到C 端還含有START（steroidogenic acute regulatatory protein lipid transfer domain）、HD-SAD（homeodomain START associated domain）和MEKHLA（Met-Glu-Lys-His-Leu-Ala）結(jié)構(gòu)域。START結(jié)構(gòu)域約有200個(gè)氨基酸，可以結(jié)合疏水小分子，如固醇類、類胡蘿卜素以及磷脂等，該結(jié)構(gòu)在動(dòng)物體內(nèi)的研究己經(jīng)較為透徹，START 結(jié)合膽固醇將其從線粒體膜內(nèi)運(yùn)到膜外，MEKHLA 結(jié)構(gòu)域與細(xì)菌、綠藻的MEKHLA 蛋白同源性較高，所以該結(jié)構(gòu)域可能與接收光信號(hào)調(diào)控有關(guān)［18-20］。HD-ZIP Ⅲ類基因起初在苔蘚類植物的單倍世代區(qū)域表達(dá)，這類基因的原始功能并不包含器官的極性調(diào)控、分生組織的調(diào)控以及維管組織的發(fā)育，隨著植物的進(jìn)化和對(duì)環(huán)境的適應(yīng)，該類基因的功能也隨之多樣化，在陸生植物中參與維管組織和根的發(fā)育，側(cè)生分支，頂端生長(zhǎng)和次生生長(zhǎng)等多個(gè)方面［21］。

本課題組通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析PsnCycD1；1過(guò)表達(dá)小黑楊植株，發(fā)現(xiàn)2 個(gè)與植物維管發(fā)育以及葉片、莖部等組織形成相關(guān)的基因PsnHB13以及PsnHB15為顯著差異基因，其中PsnHB13為HDZip 蛋白家族Ⅰ類成員基因，PsnHB15基因?yàn)棰箢惓蓡T基因。目前關(guān)于HD-Zip 蛋白參與周期蛋白調(diào)控植物發(fā)育的機(jī)制仍不深入，因此對(duì)于Psn-HB13與PsnHB15基因的研究將有助于進(jìn)一步了解植物HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子功能和調(diào)控機(jī)制，可以更好地揭示木本植物中CYCDs的生物學(xué)功能，為CYCDs的調(diào)控機(jī)制研究提供有意義的參考和補(bǔ)充。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

供試材料為林木遺傳育種全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（東北林業(yè)大學(xué)）保存的小黑楊組培苗。Y2Hgold酵母感受態(tài)均購(gòu)自上海唯地公司。BSC01S1 Biospin 質(zhì)粒DNA 提取試劑盒購(gòu)自博日公司；PCR 相關(guān)試劑、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶，DNA Ligation Kit，TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，PrimeScriptTMRT reagent Kit，SYBR Premix Ex

TaqTMⅡ均購(gòu)自TaKaRa 公司（大連）；其他試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。RNA-seq 測(cè)序由武漢博越致和公司完成。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1PsnHB13與PsnHB15基因的生物信息學(xué)分析

利用在線軟件InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）對(duì)基因保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析；利用在線軟件STRING（https：//cn.string-db.org/）對(duì)基因功能性蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析。

1.2.2PsnHB13與PsnHB15基因酵母表達(dá)載體構(gòu)建及互作驗(yàn)證

參考Clontech Gold Yest Two-Hybrid System 說(shuō)明書構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到Y(jié)2Hgold感受態(tài)細(xì)胞中，并涂布相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)缺陷型培養(yǎng)基。

1.2.3PsnHB13過(guò)表達(dá)植株轉(zhuǎn)錄組分析

選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的3 月齡PsnHB13過(guò)表達(dá)量最高的株系L9 與野生型小黑楊的功能葉（從上至下第5 片葉片），L9 與野生型均取3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)液氮速凍后，送武漢博越致和生物科技有限公司進(jìn)行RNA-seq測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsnHB13 與PsnHB15 基因在PsnCycD1；1轉(zhuǎn)基因小黑楊中的表達(dá)差異

PsnHB13與PsnHB15為PsnCycD1；1過(guò)表達(dá)小黑楊轉(zhuǎn)錄組差異基因，首先采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證。以不同Psn-CycD1；1過(guò)表達(dá)小黑楊株系與野生型小黑楊組培苗葉片cDNA 為模板進(jìn)行表達(dá)差異分析（見表1）。L1～L3 均為PsnCycD1；1高表達(dá)株系，L3 中Psn-CycD1；1表達(dá)量最高，為野生型植株350 倍，L2 中PsnCycD1；1表達(dá)相對(duì)較低，為野生型植株230 倍。根據(jù)qPCR 結(jié)果顯示，PsnHB13與PsnHB15均隨著PsnCycD1；1表達(dá)量升高而出現(xiàn)不同程度的升高且與野生型相比達(dá)到顯著差異。L3 株系中PsnHB13基因表達(dá)量差異最大為野生型小黑楊的14 倍；PsnHB15基因表達(dá)量升高最多為野生型小黑楊的6 倍（見圖1）。表明PsnCycD1；1直接影響Psn-HB13及PsnHB15的表達(dá)。

表1 本實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this experiment

圖1 PsnHB13與PsnHB15基因在不同株系的相對(duì)表達(dá)量WT.野生型；L1～L3.PsnCycD1；1 過(guò)表達(dá)植株；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；下同F(xiàn)ig.1 Relative expression levels of PsnHB13 and PsnHB15 gene in different linesWT.Wild type；L1-L3.PsnCycD1；1 overexpression lines；*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；The same as below

2.2 PsnHB13和PsnHB15基因保守結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)在線軟件InterPro 輸入PsnHB13 蛋白序列后，將蛋白質(zhì)分類為家族并預(yù)測(cè)域和重要位點(diǎn)，分析蛋白質(zhì)的功能，最終生成結(jié)構(gòu)域分析（見圖2A）。結(jié)果表明：PsnHB13主要包含HDZip class Ⅰplant 及HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN在內(nèi)的2 個(gè)家族保守結(jié)構(gòu)域；Homeobox dom、Hox 1、Homeodomain、Homeobox 2、Leu-Zip homoe 以及HALZ 6 個(gè)保守的域；Homeobox-like sf 和Homeodomain-like 2 個(gè)同源超家族；Homeobox CS、Homeobox 1、HTH motif 和HTHREPRESSR 4 個(gè)保守位點(diǎn)以及1 個(gè)未整合的HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN ATHB-13 結(jié)構(gòu)域。通過(guò)GO tems 分析發(fā)現(xiàn)，PsnHB13在生物過(guò)程上富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA 模板化（GO：0006355）；分子功能上主要富集在DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性，RNA 聚合酶Ⅱ特異性（GO：0000981）、DNA 結(jié)合（GO：0003677）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0003700）以及序列特異性DNA結(jié)合（GO：0043565）中。

圖2 PsnHB13（A）和PsnHB15（B）的保守結(jié)構(gòu)域及位置Fig.2 Conserved domains and positions of PsnHB13（A） and PsnHB15（B）

通過(guò)同樣的方法對(duì)PsnHB15 氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（見圖2B）：PsnHB15主要包含HDZip Ⅲ及HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN ATHB-14 在內(nèi)的2 個(gè)家族保守結(jié)構(gòu)域。與PsnHB13 不同的是PsnHB15包含的保守結(jié)構(gòu)域是HDZip Ⅲ而非HDZip Ⅰ，說(shuō)明PsnHB13 與PsnHB15 屬 于2 個(gè)不同的亞家族。PsnHB15 還包含Homeobox dom、Homeodomain、Homeobox 2、START lipid-bd dom 及MEKHLA 在內(nèi)的5 個(gè)域；2 個(gè)先后存在于不同氨基酸位點(diǎn)的Homeobox-like sf同源超家族位點(diǎn)；bZIP、Bet v1-like、START_ArGLABRA2_like、CLASS ⅢHD-ZIP PROTEIN CNA1和HTHREPRESSR 在內(nèi)的5 個(gè)保守位點(diǎn)，以及1 個(gè)與PsnHB13 相同的HOMEOBOX-LEUCINE ZIPPER PROTEIN ATHB-13未整合結(jié)構(gòu)域。PsnHB15 未在生物過(guò)程上存在富集，但在分子功能上含有DNA結(jié)合（GO：0003677）、脂質(zhì)結(jié)合（GO：0008289）、DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性（GO：0003700）3 個(gè)GO 富集，其中DNA 結(jié)合和DNA 結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性與PsnHB13 完全相同，脂質(zhì)結(jié)合為PsnHB15 特有。PsnHB15 為Ⅲ類同源域-亮氨酸拉鏈（HD-Zip Ⅲ）蛋白質(zhì)家族，其中包括來(lái)自擬南芥的5 個(gè)成員（REVOLUTA、ATHB-9/PHAVOLUTA、ATHB-14/PHABULOSA、ATHB-15/CORONA 和ATHB8），以及來(lái)自水稻（Oryza sativa）的 同 源 物（OsHOX9-10、OSHOX29、OsHOX32-33）［22-25］。這些蛋白質(zhì)包含1個(gè)參與DNA 結(jié)合和蛋白質(zhì)二聚化的HD-Zip 結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)START 結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)功能未知的保守C 端結(jié)構(gòu)域。該家族調(diào)節(jié)頂端胚胎模式、胚胎芽分生組織形成、器官極性、血管發(fā)育和分生組織功能。它們顯示出重疊、拮抗 和 發(fā) 散 功 能：PHABULOSA、PHAVOLUTA 與REVOLUTA 執(zhí) 行 重 疊 功 能，PHABULOSA、PHAVOLUTA 和CORONA/ATHB15 基 因 執(zhí) 行 與REVOLUTA 不同的重疊功能，而ATHB8 和CORONA 編碼的功能在某些范圍內(nèi)與REVOLUTA 的功能均可拮抗組織并與其他組織中的REVOLUTA重疊［25］。

2.3 PsnHB13和PsnHB15蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析

在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)輸入PsnHB13 和PsnHB15氨基酸序列，然后在毛果楊（Populus trichocarpa）數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選互作蛋白，對(duì)有可能互作的蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，并生成蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)（見圖3A）。預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，與PsnHB13 發(fā)生互作的蛋白共有10 條，這10 條蛋白分別是具有Tlc 結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)at5g14285，與PsnHB13 互作強(qiáng)度最高達(dá)到0.741；葉綠體類核DNA 結(jié)合家族蛋白；2 條鋅指同源域蛋白2、2條鋅指同源域蛋白11及4條未知蛋白。

預(yù)測(cè)結(jié)果顯示與PsnHB15 互作的蛋白同樣有10 條（見圖3B）。這10 條與PsnHB15 互作的蛋白包括4 條與PsnHB15 同屬于同源域亮氨酸拉鏈家族（HD-Zip）的蛋白，2 條轉(zhuǎn)錄阻遏物kan1 蛋白，1條衰老相關(guān)家族蛋白Mard1，1 條轉(zhuǎn)錄因子bHLH68 蛋白，1 轉(zhuǎn)錄因子MYB103 蛋白及1 條未知蛋白。根據(jù)預(yù)測(cè)的PsnHB15 互作蛋白分類顯示，PsnHB15 極易與同家族HD-Zip 成員互作。這與預(yù)測(cè)的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性相符合。

圖3 PsnHB13（A）和PsnHB15（B）蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PsnHB13（A）and PsnHB15（B）protein association network

2.4 PsnHB15蛋白互作驗(yàn)證

以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的pROKⅡ-PsnHB13與pROKⅡ-PsnHB15過(guò)表達(dá)載體為模板［17］，構(gòu)建pGBKT7-PsnHB13、pGBKT7-PsnHB15、pGADT7-Psn-HB13、pGADT7-PsnHB15酵母表達(dá)載體。

互作蛋白關(guān)聯(lián)網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，PsnHB15更易與同家族基因互作，通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)室前期已構(gòu)建pGBKT7-Psn-CYCD1；1，pGADT7-PsnCYCD1；1載體［7］。參考Clontech Gold Yest Two-Hybrid System說(shuō)明書，分別將對(duì)應(yīng)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化至Y2Hgold酵母感受態(tài)細(xì)胞。通過(guò)判斷SD/-Trp/-Leu/-His（TDO）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA（QDO/A）、SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA（QDO/A/X）培養(yǎng)基平板中菌落生長(zhǎng)狀態(tài)，可以判定PsnHB15 與PsnHB13 存 在 相 互 作 用，PsnHB13 與PsnCycD1；1存在相互作用，PsnCycD1；1與PsnHB15很可能通過(guò)PsnHB13產(chǎn)生間接相互作用（見圖4）。這與前期對(duì)基因互作蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果相符。

圖4 酵母雙雜交互作驗(yàn)證DDO.SD/-Trp/-Leu 培 養(yǎng) 基；QDO/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA 培養(yǎng)基；QDO/X/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA 培養(yǎng)基；Positive control.pGBKT7-53、pGADT7-T 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)；Negative control.pGBKT7-Lam、pGADT7-T質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Fig.4 Yeast two-hybrid interaction for verificationDDO.SD/-Trp/-Leu medium；QDO/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/AbA medium；QDO/X/A.SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade/X-α-gal/AbA medium；Positive control.pGBKT7-53 and pGADT7-T plasmid co-transformation；Negative control.pGBKT7-Lam and pGADT7-T plasmid co-transformation

2.5 PsnHB13 與PsnHB15 小黑楊的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測(cè)

通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的小黑楊轉(zhuǎn)基因體系［7］，經(jīng)10～12 周獲得小黑楊抗性生根苗。提取小黑楊抗性生根苗葉片DNA，通過(guò)PCR 檢測(cè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株（引物詳見表1）。檢測(cè)結(jié)果顯示，共獲得10 個(gè)PsnHB13過(guò)表達(dá)小黑楊株系（見圖5A），3 個(gè)Psn-HB15過(guò)表達(dá)小黑楊株系（見圖5B）。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系DNA檢測(cè)A.PsnHB13 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小黑楊DNA PCR 檢測(cè)電泳圖（1.陽(yáng)性對(duì)照；2～11.10 個(gè)轉(zhuǎn)基因小黑楊株系；12.野生型植株對(duì)照；13.ddH2O陰性對(duì)照）；B.PsnHB15 過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因小黑楊DNA PCR 檢測(cè)電泳圖（1.陽(yáng)性對(duì)照；2～4.3 個(gè)轉(zhuǎn)基因小黑楊株系；5.野生型植株對(duì)照；6.ddH2O陰性對(duì)照）；M.DL5000 MarkerFig.5 DNA detection of transgenic strainsA.PCR detection electrophoresis of PsnHB13 overexpression transgenic lines DNA（1.Positive control；2-11.10 transgenic lines；12.Wildtype plant control；13.ddH2O as negative control）；B.PCR detection electrophoresis of PsnHB15 overexpression transgenic lines DNA（1.positive control；2-4.3 transgenic poplar lines；5.Wild type plant control；6.ddH2O as negative control）；M.DL5000 Marker

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)PsnHB13與Psn-HB15在轉(zhuǎn)基因小黑楊植株中的表達(dá)情況（引物詳見表1）。結(jié)果顯示，10 個(gè)PsnHB13過(guò)表達(dá)株系均在mRNA 水平上超量表達(dá)，表達(dá)量最高為野生型5.0 倍，最低為野生型1.3 倍（見圖6A）。3 個(gè)Psn-HB15過(guò)表達(dá)株系均在mRNA 水平上超量表達(dá)，表達(dá)量最高為野生型2.5 倍，最低為野生型1.5 倍（見圖6B）。以PsnHB13L9、L7、L6 過(guò)表達(dá)株系為材料，檢測(cè)PsnHB13與PsnHB15表達(dá)模式。結(jié)果顯示：PsnHB15隨PsnHB13表達(dá)量的升高而升高，PsnHB13表達(dá)量為野生型小黑楊5.0 倍時(shí)，Psn-HB15表達(dá)量升高至野生型小黑楊3.5 倍（見圖6C）。與酵母雙雜交結(jié)果一致，PsnHB13 與Psn-HB15 存在相互作用，并且過(guò)量PsnHB13促進(jìn)Psn-HB15的表達(dá)。

圖6 轉(zhuǎn)基因株系表達(dá)量檢測(cè)A.不同PsnHB13過(guò)表達(dá)株系中PsnHB13基因表達(dá)量（WT.野生型；L1～L10.不同轉(zhuǎn)基因株系）；B.不同PsnHB15 過(guò)表達(dá)株系中Psn-HB15 基因表達(dá)量（WT.野生型；L1～L3.不同轉(zhuǎn)基因株系）；C.不同PsnHB13過(guò)表達(dá)株系中PsnHB15基因表達(dá)量（WT.野生型；L6、L7、L9.不同轉(zhuǎn)基因株系）Fig.6 Detection of the relative expression of transgenic linesA. PsnHB13 gene expression in different PsnHB13 overexpression line（sWT.Wild type；L1-L10.Different transgenic lines）；B.PsnHB15 gene expression in different PsnHB15 overexpression lines（WT.Wild type；L1-L3.Different transgenic lines）；C.PsnHB15 gene expression in differentPsnHB13 overexpression lines（WT.Wild type；L6，L7，L9.Different transgenic lines）

2.6 PsnHB13 與PsnHB15 過(guò)表達(dá)小黑楊葉片長(zhǎng)寬比與質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

轉(zhuǎn)基因小黑楊株系第4 葉片葉片長(zhǎng)寬比差異在幼苗初期（頂芽生根培養(yǎng)后15 d）最明顯，Psn-HB13過(guò)表達(dá)株系L9為野生型的1.83倍，葉型發(fā)生明顯變化。但隨著培養(yǎng)時(shí)間逐漸增加，60 d 后轉(zhuǎn)基因與野生型葉片長(zhǎng)寬比無(wú)明顯差異（見圖7A）。表明PsnHB13對(duì)小黑楊幼苗早期葉型發(fā)育產(chǎn)生影響。PsnHB15對(duì)小黑楊葉型發(fā)育影響與PsnHB13基本一致，均在幼苗初期（頂芽生根培養(yǎng)后15 d）第4 葉片葉片長(zhǎng)寬比產(chǎn)生明顯變化，L3 為野生型的2.16倍（見圖7B）。說(shuō)明PsnHB13與PsnHB15在小黑楊早期葉片形態(tài)發(fā)育中發(fā)揮作用。

圖7 PsnHB13（A）和PsnHB15（B）過(guò)表達(dá)株系與野生型葉片長(zhǎng)寬比Fig.7 Aspect ratio of PsnHB13（A）and PsnHB15（B）overexpression lines and wild type

測(cè)量并計(jì)算3 月齡野生型小黑楊與PsnHB13過(guò)表達(dá)株系從上至下第4～8 葉片干質(zhì)量、鮮質(zhì)量及其比值，結(jié)果顯示：小黑楊野生型葉片平均鮮質(zhì)量0.30 g，平均干質(zhì)量0.09 g，干鮮質(zhì)量比值為0.30。L7 株系葉片平均鮮質(zhì)量為0.33 g，平均干質(zhì)量為0.13 g，干鮮質(zhì)量比值為0.39。L6株系葉片平均鮮質(zhì)量為0.32 g，平均干質(zhì)量為0.11 g，干鮮質(zhì)量比值為0.34（見圖8A）。L7 葉片的干鮮質(zhì)量比值與野生型差別最大，相差0.09。

同樣對(duì)3 月齡野生型小黑楊與PsnHB13過(guò)表達(dá)株系莖的干質(zhì)量、鮮質(zhì)量及其比值進(jìn)行測(cè)量并計(jì)算。野生型小黑楊莖部平均鮮質(zhì)量2.57 g，平均干質(zhì)量0.90 g，干鮮質(zhì)量比值為0.35。L9莖部平均鮮質(zhì)量為1.86 g，平均干質(zhì)量為0.93 g，干鮮質(zhì)量比值為0.50；比值最低的L6 株系莖部平均干質(zhì)量為0.73 g，平均鮮質(zhì)量1.75 g，干鮮質(zhì)量比值為0.45（見圖8B）。

有趣的是，可以發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系顯著提高了莖部及葉片干鮮質(zhì)量比值，尤其是促進(jìn)莖段物質(zhì)積累。但通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因株系以及野生型小黑楊株高測(cè)量發(fā)現(xiàn)，野生型小黑楊平均株高為45.7 cm，轉(zhuǎn)基因小黑楊L9 平均株高最高，為37.5 cm，L6 平均株高最低，為26.1 cm（見圖8C），L6 與野生型株高差異最大，比野生型矮19.6 cm，差異顯著（P＜0.01）。PsnHB15過(guò)表達(dá)株系葉片、莖干鮮質(zhì)量比與株高對(duì)比野生型無(wú)顯著差異。

圖8 PsnHB13過(guò)表達(dá)植株株高與質(zhì)量比A.PsnHB13過(guò)表達(dá)植株與野生型小黑楊葉片干鮮質(zhì)量比值；B.Psn-HB13 過(guò)表達(dá)植株與野生型小黑楊莖部干鮮質(zhì)量比值；C.PsnHB13過(guò)表達(dá)植株與野生型小黑楊株高Fig.8 Plant height and mass ratio of PsnHB13 overexpression linesA.The dry and fresh weight ratio of PsnHB13 overexpression lines and wild-type leaves；B.PsnHB13 overexpression lines and wild-type stem dry and fresh weight ratio；C.PsnHB13 overexpression lines and wildtype height

2.7 PsnHB13過(guò)表達(dá)株系轉(zhuǎn)錄組分析

PsnHB13在轉(zhuǎn)化小黑楊時(shí)，轉(zhuǎn)基因小黑楊葉片干物質(zhì)積累量發(fā)生明顯變化。為進(jìn)一步探究PsnHB13對(duì)小黑楊發(fā)育的影響，取3月齡生長(zhǎng)狀態(tài)良好且長(zhǎng)勢(shì)一致的PsnHB13過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系L9與野生型葉片，送轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

2.7.1PsnHB13過(guò)表達(dá)株系葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量及Unigene功能注釋

PsnHB13過(guò)表達(dá)株系L9及野生型小黑楊葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序后得到Raw reads 過(guò)濾之后的Input reads 值。WT 及轉(zhuǎn)基因 株系L9 的Concordant pair alignment rate 均高于70%，符合分析要求。WT 組GC 含 量 為44.30%，質(zhì) 量 參 數(shù)Q20和Q30分 別 為98.32%和94.27%，均大于90%，數(shù)據(jù)質(zhì)量較好。PsnHB13過(guò)表達(dá)株系L9 組GC 含量為44.04%，質(zhì)量參數(shù)Q20和Q30分別為98.83%和95.70%，均大于95%，質(zhì)量良好。

2.7.2 差異基因篩選及GO 分類和KEGG pathways富集分析

GO 分為分子功能、生物過(guò)程和細(xì)胞組成3 個(gè)部分。WT 與PsnHB13過(guò)表達(dá)株系差異基因在分子功能上主要富集在：轉(zhuǎn)錄因子活性，序列特異性DNA 結(jié)合以及核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性等。在生物過(guò)程上主要富集在：化學(xué)反應(yīng)（GO：0042221）；對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)（GO：0010033）；調(diào)節(jié)RNA 代謝過(guò)程（GO：0051252）；RNA 生物合成過(guò)程的調(diào)控（GO：2001141）；轉(zhuǎn)錄調(diào)控，DNA-模板化（GO：0006355）；對(duì)有機(jī)氮化合物的反應(yīng)（GO：0010243）等（見圖9A）。

在生物體內(nèi)，不同的基因產(chǎn)物相互協(xié)調(diào)來(lái)行使生物學(xué)功能，對(duì)WT與PsnHB13過(guò)表達(dá)株系差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG Pathway 注釋分析有助于進(jìn)一步解讀基因的功能。差異表達(dá)基因主要富集在：轉(zhuǎn)錄因子，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞色素P450（Cytochrome P450），角質(zhì)、木栓質(zhì)和蠟的生物合成等通路中（見圖9B）。

圖9 富集分析A.PsnHB13過(guò)表達(dá)株系L9與野生型小黑楊差異基因GO富集分析；B.PsnHB13過(guò)表達(dá)株系L9與野生型小黑楊差異基因KEGG富集分析Fig.9 Enrichment analysisA.Analysis of GO enrichment of differential genes between PsnHB13 overexpression line L9 and wild-type Populus nigra；B.Enrichment analysis of differential gene KEGG between PsnHB13 overexpression line L9 and wild-type Populus nigra

通過(guò)KEGG 富集分析，共找到轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)差異基因31 條，主要包括MADS-box轉(zhuǎn)錄因子、MYBP轉(zhuǎn)錄因子、ERF1轉(zhuǎn)錄因子、EREBP轉(zhuǎn)錄因子、ANT AP2-like轉(zhuǎn)錄因子、NFYA轉(zhuǎn)錄因子、RAV轉(zhuǎn)錄因子、PTI6轉(zhuǎn)錄因子、MYC2轉(zhuǎn)錄因子等。值得注意的是PsnHB13、PsnHB15所屬HD-ZIP 家族其他轉(zhuǎn)錄因子也出現(xiàn)差異表達(dá)。植物激素是植物體內(nèi)調(diào)節(jié)自身生理過(guò)程的重要有機(jī)化合物，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起到關(guān)鍵性作用，根據(jù)差異基因KEGG 富集，進(jìn)一步分析WT 與PsnHB13 過(guò)表達(dá)株系植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化。在此通路中共富集到23條基因，包括色氨酸代謝、玉米素生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、油菜素類固醇生物合成、α-亞麻酸代謝和苯丙氨酸代謝6 個(gè)途徑中的SAUR蛋白家族基因、AHP含組氨酸磷酸轉(zhuǎn)移蛋白基因、GH3 生長(zhǎng)素響應(yīng)基因、ERF1 乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子、IAA 生長(zhǎng)素響應(yīng)基因BKI1 激酶抑制劑、JAZ茉莉酸ZIM 結(jié)構(gòu)域蛋白、NPR1調(diào)節(jié)蛋白、MYC2轉(zhuǎn)錄因子、EBF1_2 結(jié)合蛋白、PR1 蛋白，而這些差異基因又主要富集在色氨酸代謝途徑（見圖10），其中紅色方框?yàn)轱@著上調(diào)的基因，綠色方框?yàn)轱@著下調(diào)的基因。生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子AUX1、3 類生長(zhǎng)素旱期響應(yīng)基因Aux/IAA、GH3、SAUR均上調(diào)表達(dá)，最終促進(jìn)植物細(xì)胞增大生長(zhǎng)。

圖10 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)色氨酸代謝途徑基因差異表達(dá)Fig.10 Differential expression map of plant hormone signal transduction tryptophan metabolic pathway genes

3 討論

CYCD1；1是探究植物的生長(zhǎng)規(guī)律、揭示細(xì)胞周期與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)之間的關(guān)鍵基因，在小黑楊中過(guò)表達(dá)PsnCYCD1；1出現(xiàn)偏心生長(zhǎng)、纖維細(xì)胞形體改變、細(xì)胞壁變厚等微觀結(jié)構(gòu)變化，導(dǎo)致楊樹中其他D 類周期蛋白、周期蛋白激酶、周期蛋白激酶抑制因子、下游分裂基因及纖維素發(fā)育、木質(zhì)素發(fā)育相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化［7］。為進(jìn)一步了解植物HD-Zip 轉(zhuǎn)錄因子功能和調(diào)控機(jī)制，更好地揭示木本植物中CYCDs的生物學(xué)功能，對(duì)小黑楊Psn-CYCD1；1下游基因——基因PsnHB13與PsnHB15功能進(jìn)行探究。PsnHB13含有HDZip class Ⅰ結(jié)構(gòu)域，PsnHB15 含有HDZip class Ⅲ結(jié)構(gòu)域，2 個(gè)基因?qū)儆贖DZip 不同亞家族，但均含有HOMEOBOXLEUCINE ZIPPER PROTEIN 結(jié)構(gòu)域，酵母雙雜交互作驗(yàn)證結(jié)果表明PsnHB15 與PsnHB13 存在相互作用。

有研究表明ZeHB13轉(zhuǎn)錄物優(yōu)先在植物的原形成層細(xì)胞中積累，可能在原形成層和木質(zhì)部前體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用［26］。PsnHB13過(guò)表達(dá)小黑楊植株葉片早期發(fā)育出現(xiàn)顯著差異，長(zhǎng)寬比顯著增加，同時(shí)葉片與莖部干鮮質(zhì)量比值較野生型顯著提高，推測(cè)正是由于PsnHB13同樣影響植物原形成層的發(fā)育，促進(jìn)轉(zhuǎn)基因小黑楊干物質(zhì)積累。類似地，AtHB15啟動(dòng)子表達(dá)僅限于葉和根中的原形成層細(xì)胞［27］，PsnHB15過(guò)表達(dá)小黑楊植株葉片早期發(fā)育同樣出現(xiàn)長(zhǎng)寬比增加的趨勢(shì)，這些結(jié)果強(qiáng)烈暗示PsnHB13/15參與形成層功能。

BRs 合成缺陷突變體主莖橫切面中形成層異常，產(chǎn)生過(guò)量的韌皮部細(xì)胞以及減少的木質(zhì)部細(xì)胞，BR 合成抑制了木質(zhì)部的發(fā)育。ZeHB13的表達(dá)受油菜素甾體激素影響，油菜素類固醇對(duì)Ze-HB13的表達(dá)具有反饋促進(jìn)［26-28］。BKI1 是感知BR信號(hào)的富含絲/蘇氨酸的類受體蛋白激酶BRI1 的負(fù)調(diào)控蛋白，PsnHB13轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析顯示，PsnBKI1為顯著差異基因，說(shuō)明PsnHB13的過(guò)量表達(dá)同樣對(duì)油菜素類固醇的合成產(chǎn)生影響。而只有Psn-HB13在原形成層和木質(zhì)部前體細(xì)胞中表達(dá)和發(fā)揮作用，才可能影響菜素類固醇感知機(jī)制。但仍需要進(jìn)一步分析以闡明油菜素類固醇與PsnHB13表達(dá)之間的關(guān)系。油菜素內(nèi)酯促進(jìn)ZeHB13的表達(dá)，形成反饋調(diào)節(jié)。除油菜素內(nèi)酯外，生長(zhǎng)素也是誘導(dǎo)ZeHB13、AtHB15、AtHB8等基因表達(dá)所必需的，原形成層細(xì)胞向TEs 分化需要同時(shí)存在生長(zhǎng)素和油菜素內(nèi)酯。PsnHB13轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，在PsnHB13過(guò)表達(dá)的小黑楊中，AUX1，Aux/IAA等生長(zhǎng)素合成基因與野生型相比出現(xiàn)差異表達(dá)。但PsnHB13如何同時(shí)影響生長(zhǎng)素和油菜素內(nèi)酯的合成還有待進(jìn)一步探究。

多種HD-Zip Ⅲ轉(zhuǎn)錄本以1種獨(dú)特的組合在不同的木質(zhì)部細(xì)胞類型中積累，HD-Zip Ⅲ蛋白可以形成異質(zhì)二聚體和同源二聚體［29-30］。PsnHB13、PsnHB15蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)關(guān)聯(lián)分析與酵母雙雜交結(jié)果也進(jìn)一步證明PsnHB15對(duì)HD-Zip 蛋白具有較高的互作概率。因此，HD-Zip Ⅲ蛋白的異質(zhì)二聚體和同源二聚體的特定組合可能在某些木質(zhì)部細(xì)胞類型方面發(fā)揮作用，進(jìn)而對(duì)木材發(fā)育產(chǎn)生影響。