馮桂菊 張 紅 王守燕 郭 依 沈 鑫 鐘 霞

山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)科，山東 濟南 250021

冠心病是指由冠狀動脈狹窄或阻塞引起的一類疾病，近年來，我國冠心病的發(fā)病率呈上升趨勢。急性心肌梗死是冠心病最嚴(yán)重的表現(xiàn)形式，急性心肌梗死后早期心肌再灌注是挽救瀕死心肌以及改善臨床預(yù)后的最有效措施［1-3］。但是，缺血會增加自由基和活性氧的產(chǎn)生，并且這些物質(zhì)的產(chǎn)生會在再灌注后進一步增加［4］，引起心肌損傷，即缺血再灌注損傷，嚴(yán)重影響缺血性心肌病患者的預(yù)后。因此，尋找緩解心肌細(xì)胞損傷的方法已成為近年來心肌梗死治療的研究重點。

缺 氧 誘 導(dǎo) 因 子1（hypoxia inducible factor-1， HIF-1）是一種有助于機體對缺氧產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)的核因子，是由HIF-1α 和HIF-1β 亞基組成的異二聚體。雖然HIF-1β 是缺氧誘導(dǎo)因子1 的組成性成分，但HIF-1α 在缺氧反應(yīng)中表達上調(diào)，因此，HIF-1的活性主要取決于HIF-1α 的表達水平［5-6］。研究表明，HIF-1α具有心肌保護作用并可預(yù)防缺血再灌注損傷［7］。缺血再灌注損傷由很多因素介導(dǎo)，其中包括活性氧（reactive oxygen species， ROS）的產(chǎn)生增加，尤其發(fā)生在再灌注時［8］。但是，HIF-1α 在ROS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用尚未被完全揭示。

Notch 信號通路是一種高度保守的信號通路，參與多種生理過程，如細(xì)胞分化、增殖、凋亡和再生［9］。Notch 信號通路參與了心肌損傷中的心臟保護作用，當(dāng)Notch配體與相鄰細(xì)胞上的受體結(jié)合時，誘導(dǎo)了Notch 受體蛋白水解裂解，并從細(xì)胞膜上釋放Notch 胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（notch intracellular domain, NICD）。然后NICD進入細(xì)胞核，組裝成一個轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物，激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄。Notch 信號通路的激活可有效減輕缺血損傷，調(diào)節(jié)心肌梗死后的心臟自我修復(fù)并保護心肌細(xì)胞免于凋亡［10］。研究證明，HIF-1α可以影響Notch通路［11-12］。

本研究探討了HIF-1α 在ROS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡中的作用以及其潛在的分子機制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

AC16 心肌細(xì)胞系購自北京北納生物。AC16細(xì)胞在DMEM 高糖培養(yǎng)基（Gibco，賽默飛世爾科技公司，上海）中培養(yǎng)，添加100 u/mL 鏈霉素，100 u/mL 青霉素和10%胎牛血清（FBS），在37 ℃和5% CO2條件下培養(yǎng)。為誘導(dǎo)AC16 的氧化損傷，刺激活性氧積累，采用不同濃度的H2O2（50、100、200、400 μmol/L）處理AC16 細(xì)胞構(gòu)建缺血再灌注心肌氧化損傷模型。

1.2 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

使用AG RNAex Pro 試劑（艾科瑞生物技術(shù)公司）從心肌細(xì)胞中分離總RNA，在-80 ℃保存至分析。用NanoDrop 2000 定量測定RNA 的濃度和純度。采用EvoM-MLV Ⅱ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞生物技術(shù)公司）通過逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA進行分析。根據(jù) LightCycler?480 SYBR Green I Master qRTPCR檢測系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)方案檢測目的基因相對表達。引物由艾科瑞生物技術(shù)公司合成。GAPDH 正向引物：GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，反向引物：TGGTGAAGACGCCAGTGGA；HIF-1α 正 向 引 物：TGATTGCATCTCCATCTCCTACC，反向引物：GACTCAAAGCGACAGATAACACG。mRNA 相對表達量采用2-ΔΔCq法進行分析。

1.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

將AC16細(xì)胞以每孔1 × 104個細(xì)胞的密度接種于96孔板中，孵育過夜。每孔中加入10 μL CCK-8溶液（博奧森生物技術(shù)有限公司），黑暗環(huán)境中37 ℃孵育1 h。最后，用Thermo Multiskan GO記錄在450 nm波長處的光密度（optical density， OD）。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

HIF-1α小干擾RNA（siRNA）和陰性對照（NC）購自吉滿生物公司。AC16細(xì)胞接種在6孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長到60% 融合時，按照說明書，使用Lipofectamine 2000將siRNA和NC轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)

采用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒（BD 公司）檢測AC16細(xì)胞的凋亡百分率。將AC16細(xì)胞置于24孔板中，孵育過夜。用胰蛋白酶法收集心肌細(xì)胞，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution， PBS）沖洗。離心后，將收獲的細(xì)胞在Annexin VFITC結(jié)合緩沖液中重懸。然后收集細(xì)胞，用PBS洗滌，并再次懸浮在避光的碘化丙啶（propidium iodide， PI）溶 液 中。 最 后 采 用 流 式 細(xì) 胞 儀（Beckman FC 400 MPL，USA）分析凋亡細(xì)胞。

1.6 蛋白印跡

用RIPA 裂解緩沖液（索萊寶科技有限公司）在冰上提取蛋白質(zhì)。用BCA法測定蛋白濃度（索萊寶科技有限公司）。蛋白質(zhì)樣品在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠中分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶孵育1 h，然后與一抗（Bax、Bcl2、NICD 和Hes1）在4 ℃下孵育過夜。將PVDF膜與適當(dāng)?shù)亩乖?5 ℃下孵育2 h，然后用TBST 洗滌。最后使用電化學(xué)發(fā)光（electrogenerated chemiluminescence， ECL）法檢測目的蛋白質(zhì)，并使用Amersham Imager 600軟件分析條帶。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件和SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均來自至少3次獨立的實驗，并以均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。差異采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析。檢驗水準(zhǔn)α= 0.05。

2 結(jié) 果

2.1 體外模型的建立及細(xì)胞模型中HIF-1α的表達水平

采 用50、100、200、400 μmol/L 的H2O2誘 導(dǎo)AC16 細(xì)胞損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)處理的細(xì)胞相比，經(jīng)H2O2處理后，AC16心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力逐漸下降。當(dāng)H2O2濃度達到200 μmol/L 時，AC16 心肌細(xì)胞的活力明顯降低（表1）。采用qRT-PCR 檢測不同處理時間（6、12、24 h）下AC16 心肌細(xì)胞中HIF-1α 的表達變化，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后AC16 心肌細(xì)胞中HIF-1α 的表達較未處理的細(xì)胞增加。在H2O2處理的細(xì)胞中，HIF-1α 的表達也呈時間依賴性的增加（表2）。為保證實驗效果，本研究采用200 μmol/L H2O2處理24 h，構(gòu)建了AC16 細(xì)胞氧化損傷模型。

表1 CCK-8檢測不同濃度H2O2處理24 h后的細(xì)胞活力（ ± s）

表1 CCK-8檢測不同濃度H2O2處理24 h后的細(xì)胞活力（ ± s）

注：對照組的細(xì)胞活力已標(biāo)準(zhǔn)化為1。與對照組比較，aP ＜ 0.05；與對照組比較，bP ＜ 0.01。

分組對照組過氧化氫處理組 50 μmol/L 100 μmol/L 200 μmol/L 400 μmol/L細(xì)胞活力值1 0.68 ± 0.15 0.65 ± 0.14 0.56 ± 0.15a 0.51 ± 0.14b 6.409 0.008 FP

表2 qPCR法檢測H2O2 （200 μmol/L）處理不同時間后HIF-1α mRNA的表達量（ ± s）

表2 qPCR法檢測H2O2 （200 μmol/L）處理不同時間后HIF-1α mRNA的表達量（ ± s）

注：與對照組比較，aP ＜ 0.001。

分組對照組過氧化氫處理組6 h 12 h 24 h HIF-1α mRNA的表達量1.01 ± 0.14 FP 2.04 ± 0.20 3.39 ± 0.45a 4.16 ± 0.81a 25.600＜ 0.001

2.2 HIF-1α 敲低加重了H2O2誘導(dǎo)的AC16 心肌細(xì)胞凋亡

為了檢測HIF-1α 是否參與了H2O2誘導(dǎo)的AC16 心肌細(xì)胞凋亡，本研究使用HIF-1α 特異性小干擾RNA（si-HIF-1α）轉(zhuǎn)染AC16 心肌細(xì)胞，并采用qRT-PCR 檢測轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果表明，在AC16 心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-HIF-1α 使HIF-1α 表達水平降低到33.9%（0.34 ± 0.10vs. 1.00 ± 0.06，P＜ 0.001）。CCK-8 實驗結(jié)果表明，敲除HIF-1α 可以增加H2O2對AC16 心肌細(xì)胞活力的傷害作用（表3）。促凋亡相關(guān)蛋白（Bax）在H2O2處理的心肌細(xì)胞中表達上調(diào)，并在HIF-1α 敲低后進一步升高?？沟蛲鱿嚓P(guān)蛋白（Bcl-2）在H2O2處理的AC16 心肌細(xì)胞中下調(diào)，而HIF-1α 下調(diào)則逆轉(zhuǎn)（圖1、表4）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與NC 組相比，HIF-1α 敲低增加了H2O2處理組心肌細(xì)胞的凋亡率（圖2、表5）。

表3 CCK-8檢測敲低HIF-1α對心肌細(xì)胞活力的影響（ ± s）

表3 CCK-8檢測敲低HIF-1α對心肌細(xì)胞活力的影響（ ± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.001；與H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組比較，bP ＜ 0.05。

細(xì)胞活力值1.15 ± 0.14 0.66 ± 0.05a 0.60 ± 0.11a 0.29 ± 0.03b 44.230＜ 0.001分組空白對照組H2O2刺激組H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組si-HIF-1α轉(zhuǎn)染組FP

圖1 免疫印跡法檢測各組凋亡相關(guān)蛋白表達

表4 免疫印跡法檢測敲低HIF-1α對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響（ ± s）

表4 免疫印跡法檢測敲低HIF-1α對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響（ ± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.05；與H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組比較，bP ＜ 0.05；與H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組比較， cP ＜ 0.001。

Bax 0.30 ± 0.04 0.59 ± 0.06a 0.42 ± 0.12 1.12 ± 0.15c 37.82＜ 0.001分組空白對照組H2O2刺激組H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組si-HIF-1α轉(zhuǎn)染組FP Bcl-2 1.07 ± 0.08 0.70 ± 0.03a 0.89 ± 0.23a 0.51 ± 0.11b 9.471 0.005

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

表5 流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低HIF-1α對心肌細(xì)胞凋亡率的影響（± s）

表5 流式細(xì)胞術(shù)檢測敲低HIF-1α對心肌細(xì)胞凋亡率的影響（± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.05；與H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組比較，bP ＜ 0.001。

分組空白對照組H2O2刺激組H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組si-HIF-1α轉(zhuǎn)染組FP凋亡率/%6.13 ± 0.12 13.10 ± 0.40a 13.80 ± 0.44a 27.77 ± 5.19b 36.161 0.001

2.3 HIF-1α敲低抑制了Notch信號通路。

為了評估HIF-1α 是否能夠調(diào)控Notch 信號通路，采用si-HIF-1α 處理AC16 心肌細(xì)胞，分析H2O2處理24 h后Notch信號關(guān)鍵成分的表達。免疫印跡結(jié)果顯示，H2O2增加了NICD 和Hes1（Notch 的活性形式和Notch下游效應(yīng)物）的蛋白表達，敲低HIF-1α的心肌細(xì)胞中，NICD 和Hes1 的蛋白表達下調(diào)（圖3、表6）。

表6 免疫印跡法檢測敲低HIF-1α對Notch信號相關(guān)蛋白表達的影響（± s）

表6 免疫印跡法檢測敲低HIF-1α對Notch信號相關(guān)蛋白表達的影響（± s）

注：與空白對照組比較，aP ＜ 0.05；與H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組比較，bP ＜ 0.05；與H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組比較，cP ＜ 0.001。

分組空白對照組H2O2刺激組H2O2刺激+空白轉(zhuǎn)染組si-HIF-1α轉(zhuǎn)染組FP Hes1 0.24 ± 0.05 0.63 ± 0.08a 0.63 ± 0.10a 0.31 ± 0.10b 16.881＜ 0.001 NICD 0.46 ± 0.07 0.64 ± 0.04a 0.71 ± 0.07a 0.40 ± 0.07c 15.542 0.001

圖3 免疫印跡法檢測各組Notch信號相關(guān)蛋白表達量

3 討 論

盡管近幾十年來在心血管疾病的預(yù)防、診斷和治療方面取得了較大進展，但這些疾病仍然是導(dǎo)致死亡的主要原因之一。心肌梗死是一種潛在的致命性疾病，威脅著全世界數(shù)百萬人的生命［13］。隨著介入技術(shù)的發(fā)展，冠狀動脈介入治療已成為心肌梗死患者治療的首選，極大提高了患者生存率［14］。但是，心肌缺血再灌注損傷成為了冠狀動脈介入治療不可避免的問題。心肌缺血再灌注在使心臟功能恢復(fù)的同時，可導(dǎo)致線粒體中的活性氧爆發(fā)［15］，可能會加劇心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能障礙，這種現(xiàn)象被稱為缺血再灌注損傷。因此，如何緩解缺血再灌注導(dǎo)致的心肌損傷至關(guān)重要。

氧化應(yīng)激以ROS的積累為特征，ROS在多種細(xì)胞活動中起著重要作用［16］。在生理情況下，循環(huán)系統(tǒng)輸送氧氣，線粒體不斷地將氧氣轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物，并產(chǎn)生適當(dāng)水平的ROS 以促進細(xì)胞的增殖［17］；在缺氧狀態(tài)下， ROS 的過度累積會引起線粒體功能障礙，進而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)失衡、代謝紊亂，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡［18］。在心肌缺血再灌注過程中細(xì)胞內(nèi)氧穩(wěn)態(tài)的失衡增加了ROS的產(chǎn)生。本研究中，采用H2O2刺激心肌細(xì)胞模擬了缺血再灌注過程中ROS 的產(chǎn)生。HIF-1α 是對缺氧反應(yīng)的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，主要在心肌中表達［19］。研究表明，HIF-1α在心肌梗死和缺血再灌注中發(fā)揮重要作用，HIF-1α可增強心肌梗死后的心臟修復(fù)［20］。HIF-1α 通過調(diào)節(jié)糖酵解和能量代謝而激活，從而提高心肌細(xì)胞對缺血缺氧的耐受性，減少心肌細(xì)胞的凋亡。因此，在ROS 刺激下機體可通過代償性上調(diào)HIF-1α 的表達來改變心肌代謝，以提高心肌細(xì)胞對缺血、缺氧的耐受。本研究也證明了這一結(jié)論。

心肌缺血再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，包括心肌細(xì)胞凋亡和壞死［21］。心肌缺血再灌注損傷中過量產(chǎn)生的ROS 是心肌細(xì)胞凋亡的主要原因［22］。心肌細(xì)胞的凋亡在心肌細(xì)胞損傷和心功能不全中起著關(guān)鍵作用［23-24］。因此，本研究評估了HIF-1α對心肌細(xì)胞凋亡的作用。H2O2減弱心肌細(xì)胞活力，加重心肌細(xì)胞損傷，增加心肌細(xì)胞凋亡，而敲低HIF-1α 進一步加重上述情況，并通過下調(diào)Bcl-2和上調(diào)Bax來抑制細(xì)胞凋亡。這證實了HIF-1α的心肌保護作用，其水平上調(diào)可以抑制ROS 誘導(dǎo)損傷后心肌細(xì)胞的凋亡。

Notch 信號可以通過促進心肌再生、保護缺血心肌、誘導(dǎo)血管生成、負(fù)調(diào)控心臟成纖維細(xì)胞-肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化來修復(fù)心肌損傷。研究證明，HIF-1α可以影響Notch通路［11-12］。為了證明Notch信號通路在心肌細(xì)胞損傷中的保護作用，本研究通過敲低HIF-1α表達來證明其相關(guān)性，結(jié)果表明，Notch信號的已知成分如NICD 和Hes1 的表達受到HIF-1α 的調(diào)控，H2O2增加了心肌細(xì)胞中NICD和Hes1的表達。然而，在敲低HIF-1α的情況下NICD和Hes1的表達反而下降。

綜上，HIF-1α 可能會通過Notch 信號通路調(diào)控Bax 和Bcl-2 表達來調(diào)控心肌細(xì)胞缺血再灌注過程中ROS 誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。這些數(shù)據(jù)將為未來急性心肌梗死缺血再灌注的治療提供一個潛在的靶點。本研究可能有以下局限性：首先，HIF-1α 調(diào)控Notch 信號通路的確切機制尚不清楚，不能排除其他參與調(diào)控HIF-1α心肌細(xì)胞損傷的其他機制；此外，HIF-1α對體內(nèi)心臟損傷和心臟恢復(fù)功能的影響還需要在未來的研究中進行評估。

志謝 感謝上海海天醫(yī)藥科技開發(fā)有限公司對本研究的資助。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突