張子杭，成元華，2，李小梅

作者單位：1貴州醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004；2貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽550004

在我國，胃癌的發(fā)病率及病死率均居消化道惡性腫瘤之首［1-3］，每年死于胃癌的病人達(dá)16 萬人［4］。胃鏡的普及應(yīng)用使許多早期胃癌病人得到了早期診斷和治療，從而獲得了長久的生存［5］。但在國內(nèi)早期胃癌檢出率不足10%，大部分病人被發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，即使施行了胃癌根治術(shù)，5 年生存率仍低［6］，預(yù)后仍差。腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是預(yù)后差的主要原因［7-8］，上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的重要原因［6］。紡錘體蛋白（SPIN1）是新近發(fā)現(xiàn)的癌基因［9］，在多種腫瘤中高表達(dá)，且與不良預(yù)后密切相關(guān)，而緊密連接蛋白（Claudin-1）為鋅指轉(zhuǎn)錄因子（Slug）的下游基因［10］，其三者共同參與了EMT 的調(diào)控，與胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的原因密切相關(guān)，目前國內(nèi)相關(guān)研究較少，故本研究旨在分析胃癌病人癌組織中SPIN1、Slug 和Claudin-1 三種蛋白的表達(dá)情況與其臨床病理特征的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院2019年6月至2021年7月確診并收治的胃癌病人中抽取病人作為實(shí)驗(yàn)對象，在早期胃癌病人和晚期胃癌病人中按照性別進(jìn)行1∶1 分層抽樣，各抽取50 例，共計(jì)100 例，排除其中不愿參與研究病人與合并其他癌癥病人，余下的84例病患按照胃癌分期分為對照組（早期胃癌）和實(shí)驗(yàn)組（晚期胃癌）兩組。對照組男20 例，女22 例，年齡范圍30～73 歲，年齡（50.48±9.51）歲；實(shí)驗(yàn)組男23 例，女19 例，年齡范圍35～74歲，年齡（55.16±10.43）歲。所有病人均符合胃癌診斷標(biāo)準(zhǔn)。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法ELISA 檢測腫瘤組織中SPIN1、Slug 和Claudin-1 三種蛋白表達(dá)：新鮮腫瘤組織磨碎的勻漿5 000g離心5 min，上清液使用ELISA 試劑盒檢測（上?？道噬锟萍脊荆瑯?biāo)準(zhǔn)孔各加50 μL 不同標(biāo)準(zhǔn)濃度；分別設(shè)置待測空白孔和樣品孔。稀釋后，樣品的最終稀釋度為5 倍。加入100 μL 酶標(biāo)試劑，密封避光，37 ℃孵育60 min，棄去液體，洗滌5次，顯色后在450 nm 波長處測量各孔的吸光度，比較標(biāo)準(zhǔn)曲線從而計(jì)算出各組蛋白含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graph pad 8.0.2 和SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示。獨(dú)立t檢驗(yàn)用于兩組比較，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）形式表示，用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較兩組病人在性別、吸煙史上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在年齡、飲酒史、胃部疾病上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組早、晚期胃癌病人一般資料比較∕例（%）

2.2 兩組病人SPIN1、Slug 和Claudin-1 蛋白表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)組SPIN1 蛋白表達(dá)情況為（784.19±16.42）ng∕L，對照組SPIN1 蛋白表達(dá)情況為（397.46±14.29）ng∕L。實(shí)驗(yàn)組Slug 蛋白表達(dá)情況為（876.84±17.78）ng∕L，對照組Slug 蛋白表達(dá)情況為（412.34±16.08）ng∕L。實(shí)驗(yàn)組Claudin-1 蛋白表達(dá)情況為（324.03±16.77）ng∕L，對照組Claudin-1 蛋白表達(dá)情況為（918.95±19.46）ng∕L，實(shí)驗(yàn)組Claudin-1 蛋白表達(dá)程度低于對照組（P＜0.001）。

2.3 兩組胃癌病人與臨床病理的關(guān)系兩組胃癌病人組織學(xué)分級、腫瘤長徑、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 早、晚期胃癌病人臨床病理情況比較∕例（%）

3 討論

胃癌是全球常見的惡性腫瘤之一［11］，其發(fā)生發(fā)展涉及多信號、多基因的調(diào)控，而EMT 在這一過程中起著關(guān)鍵作用［12-14］。研究表明，細(xì)胞間連接丟失是EMT的重要標(biāo)志之一［15-16］。Claudin-1作為一種緊密連接蛋白，可調(diào)節(jié)小離子在相鄰細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)運(yùn)，保持細(xì)胞極性，在聯(lián)系細(xì)胞間通信和維持上皮屏障功能中發(fā)揮重要作用。Claudin-1 的缺失會大大增加胃癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的概率［17］，而過表達(dá)Claudin-1能抑制黑色素瘤的侵襲和遷移，同時(shí)能夠減弱裸鼠成瘤能力［18-19］。

Slug 蛋白作為EMT 的重要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可誘導(dǎo)E-cad 蛋 白表達(dá)下降從而促進(jìn)EMT 發(fā) 生［20-21］，SPIN1 表達(dá)情況與Claudin-1 成反比，而Claudin-1 本身是上皮細(xì)胞中Slug 轉(zhuǎn)錄因子的直接下游靶基因。推測SPIN1、Slug 與Claudin-1 三者間通過某種方式促進(jìn)了EMT 的發(fā)生，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。

本研究觀察到晚期胃癌病人SPIN1、Slug 蛋白表達(dá)情況較早期胃癌病人明顯升高，而Claudin-1 蛋白表達(dá)明顯下降。結(jié)合兩組間臨床病理情況后發(fā)現(xiàn)，相較于早期胃癌病人，在SPIN1、Slug 蛋白高表達(dá)而Claudin-1 低表達(dá)的晚期胃癌病人中，腫瘤體積較大且多見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，組織學(xué)分型多為高、中度分化，可看出SPIN1、Slug 蛋白表達(dá)情況與胃癌惡性程度成正比，而Claudin-1 蛋白表達(dá)情況與胃癌分期成反比，Slug 和SPIN1 蛋白可能通過抑制Claudin-1蛋白表達(dá)從而促進(jìn)EMT 的發(fā)生。E2F1 是參與調(diào)控細(xì)胞周期的重要因子［22］，在胃癌中可上調(diào)胃癌病人體內(nèi)SPIN1 的表達(dá)，研究表明，SPIN1 可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和增殖［23］，也可以促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。這些結(jié)果表明SPIN1 在胃癌中充當(dāng)潛在的癌基因，通過促進(jìn)胃癌細(xì)胞生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移從而帶來不良預(yù)后，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，SPIN1高表達(dá)時(shí)Claudin-1表達(dá)情況會顯著降低［24］，其二者之間的作用關(guān)系目前仍然未知。Slug 蛋白作為EMT 上游的重要轉(zhuǎn)錄因子，與CDH1啟動子結(jié)合后可誘導(dǎo)E-cad蛋白表達(dá)降低，從而激活EMT 發(fā)生，并導(dǎo)致遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和較差的預(yù)后。Claudin-1 是上皮細(xì)胞中Slug 家族因子的直接下游靶基因，通過Slug 與近端E-box 區(qū)域的直接結(jié)合而被抑制其轉(zhuǎn)錄［25］，Claudin-1 作為參與構(gòu)成緊密連接結(jié)構(gòu)的密蛋白，當(dāng)其表達(dá)收到Slug 轉(zhuǎn)錄因子的抑制，緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能即發(fā)生改變從而導(dǎo)致細(xì)胞間黏附的喪失。因此當(dāng)Slug蛋白高表達(dá)，E-cad和Claudin-1 表達(dá)均收到抑制，從而導(dǎo)致細(xì)胞正常極性和組織結(jié)構(gòu)完整性降低，引起癌細(xì)胞侵襲性和轉(zhuǎn)移能力增加，惡化病人預(yù)后［26］。

綜上所述，在胃癌病人中，SPIN1、Slug蛋白高表達(dá)而Claudin-1 蛋白低表達(dá)往往提示發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移且預(yù)后較差，能夠作為判斷胃癌分期較好的臨床指標(biāo)。