田馨莉，張妍，李嵐，陳芳

作者單位：濰坊市人民醫(yī)院婦科，山東 濰坊261000

宮頸癌是感染型腫瘤，研究已證實高危型人乳頭瘤病毒（human papilomas virus，HPV）的持續(xù)感染是其發(fā)病的根本原因［1］，高危型HPV 持續(xù)感染后所致的炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，感染導(dǎo)致腫瘤局部的固有免疫發(fā)生變化，免疫細胞及其分泌的各種免疫因子參與腫瘤的進展［2］。

Th17 細胞是近年來發(fā)現(xiàn)的一類輔助型T 細胞，通過表達轉(zhuǎn)錄因子維A 酸相關(guān)孤兒受體γt、分泌特征性的白細胞介素（IL）-17 發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)［3］。研究發(fā)現(xiàn)該細胞既具有促進腫瘤的作用，也有抗腫瘤的作用［4-5］。在宮頸癌中，外周血及腫瘤局部微環(huán)境中該細胞的表達明顯升高，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的病人中，該細胞的表達比例均明顯升高，提示在宮頸癌的進展中Th17 細胞可能起到促進作用［6］。但是Th17 細胞在宮頸癌中的分化機制研究甚少。單核細胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，能夠監(jiān)視病原體的入侵，并作為抗原提呈細胞誘導(dǎo)效應(yīng)T 細胞發(fā)揮功能［7］。研究發(fā)現(xiàn)IL-1、IL-6、IL-23、轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）等細胞因子是誘導(dǎo)Th17 細胞分化的關(guān)鍵因子，而單核細胞系IL-1、IL-6 的重要分泌來源［8-9］，因此我們推測，單核細胞可能影響Th17 細胞的分化。本研究旨在探討宮頸癌中單核細胞對Th17 細胞分化的影響，進而為宮頸癌的免疫治療提供研究基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料2019 年6 月至2020 年12 月在濰坊市人民醫(yī)院婦科收治的宮頸癌病人（宮頸癌組）39 例，均通過手術(shù)病理證實，年齡（50±5.8）歲。對照組為健康志愿者及因良性疾病在濰坊市人民醫(yī)院婦科就診的病人，共30 例，年齡（48±4.9）歲，對照組宮頸液基細胞學(xué)及宮頸HPV 均無異常。兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。排除合并心血管疾病、高血壓病、糖尿病、妊娠、活動性或慢性感染、結(jié)締組織疾病病人或有惡性腫瘤病史的病人。宮頸癌組病人均未經(jīng)過放化療、免疫治療或中醫(yī)中藥治療。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑及儀器初始CD4+T 細胞及CD14+單核細胞磁珠分選試劑盒、磁力架、均購自德國Miltenyi 公 司。anti-IL-6、anti-IL-1β、Anti-CD3、anti-CD28、IL-2（均購自Peprotech 公 司。percp∕cy5.5-CD4，AlexaFluor647-anti-IL-17（均購自美國Biolegend 公司）；佛波酯、離子霉素、莫能霉素（購自聯(lián)科生物公司）。IL-1β、IL-6 及IL-23 基因引物由Bio-Sune 生物公司合成。RPMI1640 培養(yǎng)液購自Gibco公司，人的淋巴細胞分離液（購自TBD 公司），RNA核酸提取試劑盒（購自Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（購自Takara）。采用美國BD Bioscience PharMingen Calibur 流式細胞儀檢測，采用美國ABI公司RTPCR儀（7600）檢測。

1.3 試驗方法

1.3.1流式細胞術(shù)檢測宮頸癌組、對照組外周血中Th17細胞的表達 取200 μL全血，與200 μL的RPMI 1640 混勻，同時加入莫能霉素、佛波酯、離子霉素，在孵育箱中孵育4 h（孵育箱條件為37 ℃，5%二氧化碳），取100 μL 刺激后的溶液加入Percp∕cy5.5-CD4 混勻進行表面染色，固定破膜后加入AlexaFluor647-anti-IL-17 進行染色，加入100 μL 的固定液A，PBS 洗滌、離心后，加入100 μL 破膜液B 液，立即加入AlexaFluor647-anti-IL-17 抗體，磷酸緩沖鹽溶液重懸細胞，流式細胞儀檢測Th17 細胞的比例。

1.3.2實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）方法檢測兩組外周血中IL-1β、IL-6 mRNA 表達 首先分離外周血的單個核細胞，用Trizol 法裂解單個核細胞并提取總RNA，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA 逆轉(zhuǎn)成互補DNA（cDNA），熒光定量PCR 按照SYBR Green Realtime PCR MasterMix 試劑盒配成反應(yīng)體系，內(nèi)參為GAPDH。引物序列如下：IL-1β正向引物GTACCTGAGCTCGCCAGTG，反向引物TGTTTAGGGCCATCAGCTT；IL-6 正向引物TTCTCCACAAGCGCCTTCGGTCCA，反向引物AGGGCTGAGATGCCGTCGAGGATGTA。

1.3.3CD4+T 細胞及CD14+單核細胞的分選 使用Ficoll 密度梯度離心法分離宮頸癌組和對照組外周血中的單個核細胞，顯微鏡下計數(shù)，調(diào)整細胞濃度為1×109∕L。嚴(yán)格按照Miltenyi 公司試劑盒進行磁珠分選對照組外周血中CD4+T細胞、CD14+單核細胞及宮頸癌病人外周血中的CD14+單核細胞。分選出的細胞進行流式細胞儀進行純度檢測，均可達95%以上。

1.3.4細胞培養(yǎng) 將對照組外周血中初始CD4+T細胞以2×105個∕孔分為2 組在96 孔板中培養(yǎng)，每組設(shè)置2 個復(fù)孔。每孔中均加入anti-CD3（2 mg∕L），anti-CD28（1 mg∕L）、IL-2（10I U∕mL）。第一組：加入正常對照者（15 例）外周血中單核細胞，與CD4+T 細胞共培養(yǎng)，細胞數(shù)目比例為1∶2；第二組：加入宮頸癌外周血中單核細胞（15 例），與CD4+T 細胞共培養(yǎng)，細胞數(shù)目比例為1∶2。為研究IL-6 及IL-1β 對宮頸癌病人Th17 細胞分化的影響，我們另入組12 例宮頸癌病人，分離宮頸癌外周血中單核細胞，與對照組中CD4+T 細胞共培養(yǎng)，細胞數(shù)目比例為1∶2，設(shè)置如下四組：空白對照組、anti-IL-1β 組、anti-IL-6組、anti-IL-6+anti-IL-1β 組。于孵育箱中進行細胞培養(yǎng)5 d（條件為37 ℃，5%二氧化碳），收集各組中的細胞，應(yīng)用流式細胞術(shù)檢測各組中Th17細胞的比例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法運用SPSS 22 軟件分析，結(jié)果用表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組之間兩兩比較采用SNK-q檢驗的方法；非正態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（第25、第75 百分位數(shù)）［M（P25，P75）］表示，分析用非參數(shù)分析，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組中Th17 細胞的表達與對照組（2.3±1.6）%相比，Th17 細胞比例在宮頸癌組（3.5±1.4）%中明顯升高（t=3.20，P=0.002）。

2.2 兩組中IL-1β、IL-6 表達水平比較與對照組相比，宮頸癌組外周血中IL-1β、IL-6 的表達水平均明顯升高（P＜0.05），并且IL-1β 的表達水平與Th17細胞的比例呈正相關(guān)（r=0.52，P=0.001）。見表1，圖1。

表1 白細胞介素（IL）-1β、IL-6在宮頸癌組、對照組外周血中的表達水平∕M（P25，P75）

圖1 宮頸癌組中IL-1β表達水平與Th17細胞比例的相關(guān)性

2.3 單核細胞對Th17細胞分化的影響

2.3.1兩組外周血單核細胞分別與正常對照者的CD4+T 細胞共培養(yǎng)后，檢測兩組中Th17 細胞表達與對照組中Th17 細胞比例（0.90±0.39）相比，宮頸癌組中Th17 細胞比例（1.77±0.61）明顯升高（t=4.60，P＜0.001，n=15），說明宮頸癌病人外周血中的單核細胞更能促進Th17細胞的分化（P＜0.05）。

2.3.2宮頸癌病人加入中和抗體的培養(yǎng)組與正常對照者的CD4+T 細胞共培養(yǎng)后，檢測三組中Th17 細胞的比例 與未加中和抗體的空白對照組相比，實驗組三組中Th17 細胞比例均明顯降低（P＜0.05），且加入anti-IL-1β組與加入anti-IL-6組相比，Th17細胞下降更為明顯（P＜0.05）。說明IL-1β 及IL-6 均對Th17 細胞的分化起了重要的作用，而IL-1β 在促進Th17 細胞分化過程中的誘導(dǎo)作用可能更強。見表2。

表2 anti-白細胞介素（IL）-1β、anti-IL-6對Th17細胞分化的影響∕

表2 anti-白細胞介素（IL）-1β、anti-IL-6對Th17細胞分化的影響∕

注：①與對照組比較，P＜0.05。②與anti-IL-1β組比較，P＜0.05。

3 討論

Th17 細胞作為一種輔助型T 細胞，參與多種炎癥相關(guān)性惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，包括結(jié)直腸癌、前列腺癌、肝癌等［10-13］。Salazar 等［14］在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)，Th17 細胞在肺癌組織中明顯升高，且與病人的生存率呈負相關(guān)，體外培養(yǎng)試驗中發(fā)現(xiàn)，抑制IL-17的作用可減少上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，減緩肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，說明Th17 細胞在肺癌中發(fā)揮促癌的作用。在一項乳腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，IL-17+CD4+T 細胞在腫瘤微環(huán)境中表達明顯升高，腫瘤組織中IL-17 與血管內(nèi)皮生長因子的表達、腫瘤血管密度呈正相關(guān)，提示IL-17 在乳腺癌的進展中起到促進作用［15］。Xue等［16］研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病人中，Th17細胞的比例隨著腫瘤期別增加而逐步升高，推測在宮頸癌中，Th17 細胞可能起到促進疾病進展的作用。此次我們通過流式細胞術(shù)檢測到宮頸癌病人外周血Th17細胞比例明顯增加，驗證該細胞在宮頸癌中高表達，但是Th17細胞在宮頸癌中的分化尚不明確。

單核細胞可分泌多種細胞因子，包括IL-6，IL-1β，IL-10等［17-18］，是IL-6，IL-1β的重要分泌來源。而在原始CD4+T 細胞向Th17 細胞的分化過程中，多種細胞因子參與其中，主要包括IL-1β，IL-6，IL-23，TGF-β 等。Kuang 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，抑制肝瘤小鼠體內(nèi)的單核細胞所致的炎性環(huán)境，小鼠體內(nèi)的Th17細胞比例顯著減少，且腫瘤的生長速度明顯減緩。提示在Th17細胞的分化過程中，單核細胞所分泌的細胞因子可能發(fā)揮了重要作用。我們通過qRT-PCR技術(shù)驗證了宮頸癌病人外周血中表達較高水平的IL-1β、IL-6，我們推測宮頸癌病人外周血中的單核細胞可能通過高表達這兩種細胞因子促進Th17 的分化。同時我們發(fā)現(xiàn)，宮頸癌病人中Th17細胞的表達水平與IL-1β 的表達水平呈顯著正相關(guān)，推測IL-1β 可能對Th17 細胞的分化起著更重要的作用。我們通過細胞共培養(yǎng)的方式進一步研究單核細胞、IL-1β、IL-6對Th17細胞分化的影響。

從健康對照者外周血中分選出CD4+T 細胞，分別與對照組和宮頸癌病人外周血中分離出的單核細胞共培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組中Th17 細胞分化的比例明顯升高，表明宮頸癌病人中的單核細胞更能促進Th17 細胞的分化。為進一步研究單核細胞是否通過分泌IL-1β 及IL-6 這兩種細胞因子影響Th17 細胞的分化，我們在與宮頸癌病人單核細胞共培養(yǎng)的體系中，分別加入抗IL-1β 抗體、抗IL-6 抗體、IL-1β 抗體+抗IL-6 抗體，結(jié)果顯示，與未加中和抗體的空白對照組相比，加入兩種細胞因子中和抗體后，Th17 細胞分化的比例均明顯下降，在加入抗IL-1β 組，Th17 細胞比例下降較加入抗IL-6 組更為明顯，進一步驗證在Th17細胞分化過程中，IL-1β 對Th17細胞的誘導(dǎo)作用更強。

綜上所述，宮頸癌病人外周血中高表達Th17細胞，宮頸癌病人中的單核細胞可能通過分泌更高水平的IL-β 及IL-6（尤其是IL-1β）促進了Th17 細胞的分化，進而促進腫瘤的進展。但是誘導(dǎo)單核細胞分泌功能增強的機制仍有待進一步研究。