李玉苓，鄒東花，高健

作者單位：1滄州市第三醫(yī)院，a中西醫(yī)結(jié)合肝病科，b檢驗科，河北 滄州 061000；2河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院肝膽外科，河北 石家莊050000

肝癌是全球男性第五大常見癌癥，女性第九大癌癥，同時也是癌癥死亡的第二大常見原因，其中肝細胞癌是最常見的肝癌類型［1-2］。全球約有3.5 億人感染乙型肝炎病毒（HBV），而HBV 感染是引起肝細胞癌的最主要原因；慢性HBV 感染期間機體免疫反應(yīng)所引起的反復(fù)肝臟炎癥可導致肝纖維化和肝硬化，從而加速肝細胞更新，增加肝癌發(fā)生概率［3-5］。近年來，醫(yī)療水平不斷進步，肝癌的診療手段不斷完善，但肝癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率仍較高［6］，探索可能影響病人預(yù)后的新靶點，將其轉(zhuǎn)化并應(yīng)用于臨床，對改善肝癌病人預(yù)后有重大意義。

微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）是一種腫瘤抑制因子，在多種癌癥中下調(diào)［7-8］，研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p 在肝癌組織和細胞系中表達低于正常肝組織和肝細胞，過表達miR-125a-5p 可抑制肝癌細胞增殖、誘導癌細胞凋亡［9］。維生素D 受體（VDR）水平能夠影響腫瘤細胞的發(fā)展變化及轉(zhuǎn)歸，可調(diào)控腫瘤細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡［10］，研究發(fā)現(xiàn)，肝癌組織中VDR mRNA 及蛋白水平均高于正常肝組織，VDR 可能參與肝癌疾病進展［11］。本研究致力探索miR-125a-5p及VDR水平對于HBV相關(guān)肝癌病人預(yù)后的影響，以期能夠找出新分子靶點，提高肝癌病人預(yù)后生存質(zhì)量。

1 資料與方法

1.1 一般資料樣本量計算：利用PASS 15 軟件，雙側(cè)檢驗，設(shè)α=0.05，OR=2，power=90%，計算得到肝癌組織和癌旁組織各49 例，考慮可能有失訪人數(shù)，按20%算，肝癌組織、癌旁組織至少需要61 例。前瞻性隨機選取2014 年2 月至2016 年5 月在滄州市第三醫(yī)院接受手術(shù)治療的HBV 相關(guān)肝癌病人65例，男43 例，女22 例，年齡范圍29～67 歲，年 齡（46.32±9.47）歲，術(shù)中取病人肝癌組織及癌旁組織（距腫瘤邊緣3 cm 以上）。本研究對象或其近親屬簽署知情同意書，且經(jīng)滄州市第三醫(yī)院倫理委員會審核、批準后實施（批號20140105）。

納入標準：①確診肝癌前有HBV 感染史，血清乙型肝炎表面抗原陽性；②均符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》中相關(guān)標準［12］；③術(shù)前未接受過化、放療及激素治療等；④臨床資料齊全。排除標準：①合并其他惡性腫瘤；②感染其他型肝炎病毒者；③酒精性肝病、藥物性肝損傷者；④合并心血管疾病、自身免疫疾??；⑤隨訪過程中失訪者。

1.2 方法

1.2.1樣本采集 于術(shù)中收集HBV 相關(guān)肝癌病人的癌組織及癌旁組織，新鮮的肝組織立即置于液氮中冷凍，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR）法檢測肝組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 水平 將肝組織研磨成組織勻漿，采用TRIzol試劑（德國默克公司，貨號MFCD00213058）提取總RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（德國Qiagen 公司，貨號205110）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA，并以所得互補DNA 為模板，在Taq DNA 聚合酶作用下進行qRT-PCR 反應(yīng)。miR-125a-5p 反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃30 s，72 ℃ 30 s，30 個循環(huán)；VDR mRNA 反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)。miR-125a-5p、VDR mRNA 及相應(yīng)內(nèi)參U6、三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的引物序列見表1。

表1 miR-125a-5p、VDR mRNA及相應(yīng)內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列

采 用2-ΔΔCt法計算miR-125a-5p、VDR mRNA水平。

1.2.3靶向關(guān)系預(yù)測 使用TargetScan 數(shù)據(jù)庫（http：∕∕www.targetscan.org∕vert_72∕），預(yù)測miR-125a-5p與VDR的結(jié)合位點。

1.3 隨訪對所有HBV 相關(guān)肝癌病人于手術(shù)結(jié)束當天開始進行隨訪，采取門診、電話或微信等方式，隨訪結(jié)束日期為病人死亡日期或至2021 年5 月31日。

1.4 統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 處理。計量資料均服從正態(tài)分布，如miR-125a-5p、VDR mRNA水平等以描述，采用配對樣本或獨立樣本t檢驗；以例（%）描述計數(shù)資料，行χ2檢驗；Pearson 法分析肝癌組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 的相關(guān)性；Kaplan-Meier 法繪制HBV 相關(guān)肝癌病人生存曲線，行Log-rank 檢 驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同肝組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 水平比較肝癌組織miR-125a-5p 水平低于癌旁組織（P＜0.05），VDR mRNA水平高于癌旁組織（P＜0.05）。見表2。

表2 不同肝組織中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、維生素D受體（VDR）mRNA水平比較∕

表2 不同肝組織中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、維生素D受體（VDR）mRNA水平比較∕

2.2 miR-125a-5p、VDR mRNA 水平與HBV 相關(guān)肝癌病人臨床病理特征的關(guān)系不同年齡、性別、腫瘤長徑的HBV 相關(guān)肝癌病人miR-125a-5p、VDR mRNA 水平比較，均差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；門靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中高分化及TNM 分期Ⅲ期病人miR-125a-5p水平低于門靜脈無侵襲、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移、低分化及TNM 分期Ⅰ～Ⅱ病人（P＜0.05），VDR mRNA水平高于門靜脈無侵襲、淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移、低分化及TNM分期Ⅰ～Ⅱ病人（P＜0.05）。見表3。

表3 miR-125a-5p、VDR mRNA水平與HBV相關(guān)肝癌病人臨床病理特征的關(guān)系∕

表3 miR-125a-5p、VDR mRNA水平與HBV相關(guān)肝癌病人臨床病理特征的關(guān)系∕

注：miR-125a-5p為微RNA-125a-5p，VDR為維生素D受體，HBV為乙型肝炎病毒。

2.3 肝癌組織中miR-125a-5p、VDR mRNA 的相關(guān)性分析經(jīng)TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，miR-125a-5p與VDR存在相應(yīng)的結(jié)合位點，見圖1。

圖1 微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）與維生素D受體（VDR）靶向關(guān)系預(yù)測

HBV 相關(guān)肝癌病人肝癌組織中miR-125a-5p 與VDR mRNA呈負相關(guān)（r=-0.44，P＜0.001），見圖2。

圖2 乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)肝癌病人肝癌組織中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）與維生素D受體（VDR）mRNA的相關(guān)性分析

2.4 miR-125a-5p、VDR mRNA 表達與HBV 相關(guān)肝癌病人生存率的關(guān)系分別以miR-125a-5p、VDR mRNA 中位數(shù)（0.67、1.71）為界將病人分為miR-125a-5p 高表達組（32 例）、低表達組（33 例），VDR mRNA 高表達組（32 例）、低表達組mRNA（33例）。65例HBV 相關(guān)肝癌病人5年生存率為52.31%（34∕65），其中miR-125a-5p 高表達組5 年生存率為65.63%（21∕32），miR-125a-5p 低表達組為39.39%（13∕33），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=4.39，P=0.036），見圖3。VDR mRNA 高表達組5 年生存率為37.50%（12∕32），VDR mRNA低表達組為66.67%（22∕33），兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=6.48，P=0.011），見圖4，5。

圖3 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌65例中微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）高表達組和低表達組的生存曲線

圖4 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌65例中維生素D受體（VDR）mRNA高表達組和低表達組的生存曲線

將miR-125a-5p 高表達+VDR mRNA 低表達定義為A 組，miR-125a-5p 低表達+VDR mRNA 高表達定義為B 組，miR-125a-5p 高表達+VDR mRNA 高表達定義為C 組，miR-125a-5p 低表達+VDR mRNA 低表達為D 組，A 組、B 組、C 組、D 組5年生存率分別為69.57%、23.81%、63.64%、60.00%，四組比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.96，P=0.008），見圖6。

圖5 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌65例中不同時間點miR-125a-5p、VDR mRNA高低表達組人數(shù)

圖6 乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌65例中不同微RNA-125a-5p（miR-125a-5p）、維生素D受體（VDR）mRNA表達病人的生存曲線

3 討論

肝癌是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均呈上升趨勢［13］。盡管肝癌的致病原因不同，但幾乎50% 的肝癌與HBV 感染有關(guān)［14-15］。研究表明，HBV X 蛋白是一種多功能調(diào)節(jié)蛋白，可通過調(diào)節(jié)細胞因子參與轉(zhuǎn)錄激活、表觀遺傳調(diào)控、病毒復(fù)制和DNA 修復(fù)等過程，從而在肝細胞癌變中發(fā)揮關(guān)鍵作用［16-17］。HBV 相關(guān)性肝癌發(fā)病機制復(fù)雜，臨床上尚無特效藥物［18］，探尋HBV 相關(guān)性肝癌的發(fā)病機制，尋找相關(guān)生物標志物，對該病的診治有重要意義。

miR-125a-5p在多種癌癥中發(fā)揮抑癌作用，其通過調(diào)節(jié)細胞增殖、遷移、轉(zhuǎn)移、侵襲、凋亡參與癌癥的發(fā)生發(fā)展［19-20］。研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細胞株中miR-125a-5p 水平低于正常卵巢細胞，過表達miR-125a-5p 可抑制卵巢癌細胞增殖、遷移和侵襲，miR-125a-5p 可能通過下調(diào)ras 癌基因家族成員Rab3D 表達從而抑制卵巢癌的疾病進展［21］。此外，miR-125a-5p在腎癌組織和細胞中表達下降，其可通過靶向信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活因子3 調(diào)控細胞凋亡相關(guān)蛋白表達，從而促進腎癌細胞株A498 的凋亡［22］。有關(guān)miR-125a-5p 在肝癌中的研究逐漸增加，研究表明，在肝細胞癌中，miR-125a-5p 可通過靶向造血底物1 相關(guān)蛋白并同時調(diào)節(jié)抑癌基因p53、血管內(nèi)皮生長因子及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標志物的表達來抑制肝癌生長［23］。Li 等［24］研究發(fā)現(xiàn)，miR-125a-5p 在HBV 相關(guān)肝細胞癌中明顯下調(diào)，miR-125a-5p過表達可顯著抑制細胞增殖并誘導細胞凋亡，并降低乙型肝炎表面抗原和乙型肝炎e抗原的分泌。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，miR-125a-5p 在HBV 相關(guān)肝癌病人組織中表達水平低于癌旁組織，提示miR-125a-5p 表達受抑制，其調(diào)節(jié)的相關(guān)腫瘤基因表達升高，從而參與肝癌的發(fā)生發(fā)展。且miR-125a-5p 水平與病人門靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM 分期有關(guān)，提示miR-125a-5p 水平可能對于預(yù)測病人疾病嚴重程度有一定的作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，維生素D與惡性腫瘤的增殖、分化相關(guān)，具有抗腫瘤作用，而維生素D 必須通過VDR 發(fā)揮作用，維生素D 可上調(diào)多種細胞、組織中的VDR 蛋白水平，但其對VDR mRNA 水平的調(diào)節(jié)較為復(fù)雜，存在組織細胞特異性［25-27］。VDR 為類固醇激素∕甲狀腺激素受體超家族的一員，在機體中廣泛分布，VDR 可誘導基因調(diào)控和細胞信號傳導，抑制細胞增殖、促進細胞凋亡和自噬、調(diào)控免疫系統(tǒng)等，從而參與調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展［28-29］。研究發(fā)現(xiàn)，肝細胞癌病人癌組織VDR mRNA 水平高于癌旁組織，提示VDR 與肝細胞癌密切相關(guān)［30］。上述結(jié)果與本研究結(jié)果基本一致，且本研究還發(fā)現(xiàn)，VDR mRNA 水平與HBV 相關(guān)肝癌病人的門靜脈侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度及TNM 分期有關(guān)，提示VDR mRNA 表達與肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。此外，有研究表明，miR-125a-5p 與VDR 存在靶向關(guān)系，miR-125a-5p 過表達可抑制阿司咪唑誘導的VDR 增加和增強維生素D 的抗腫瘤作用［31］。本研究經(jīng)TargetScan 數(shù)據(jù)庫預(yù)測，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p 與VDR 存在相應(yīng)的結(jié)合位點，且相關(guān)性分析顯示，HBV 相關(guān)肝癌病人miR-125a-5p 與VDR mRNA 呈負相關(guān)，提示二者可能相互作用，共同影響肝癌的疾病進展。本研究對miR-125a-5p 和VDR mRNA 與肝癌病人生存率的關(guān)系進行了探討，結(jié)果顯示miR-125a-5p 高表達組5 年生存率高于miR-125a-5p 低表達組，VDR mRNA 高表達組5年生存率低于VDR mRNA 低表達組，miR-125a-5p 高表達+VDR mRNA 低表達病人5年生存率最低，miR-125a-5p 低表達+VDR mRNA 高表達病人5 年生存率最高，提示miR-125a-5p 與VDR mRNA 表達變化與HBV 相關(guān)肝癌病人預(yù)后有一定關(guān)系，監(jiān)測miR-125a-5p 與VDR mRNA 水平可能有助于預(yù)測肝癌病人預(yù)后狀況，從而能夠早期介入治療，改善病人預(yù)后。

綜上所述，HBV 相關(guān)肝癌病人肝癌組織中miR-125a-5p 表達降低，VDR mRNA 水平增加，二者與病人臨床病理特征有關(guān)，監(jiān)測miR-125a-5p 與VDR mRNA水平對于預(yù)后評估有一定價值。

（本文圖3～6見插圖6-9）