吳波，袁麗萍，朱德發(fā)

作者單位：1中國科學技術大學附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）急診醫(yī)學科，安徽 合肥 230001；2安徽醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，a兒科，b老年內分泌科，安徽 合肥230022

急性胰腺炎的西醫(yī)治療手段包括藥物和手術治療，其中藥物治療以抑制胰酶、維持循環(huán)和內環(huán)境、預防感染等為主。結合傳統(tǒng)中醫(yī)藥可以提高對該病治療的有效率、改善病人的臨床癥狀、降低并發(fā)癥的發(fā)生［1-2］。其中治療該病常用的中藥主要有大黃、芒硝等，但是其作用機制尚未明確。

因為網(wǎng)絡藥理學可廣泛應用于中藥活性化合物發(fā)掘、整體作用機制闡釋等方面［3］；分子對接技術可將化合物配體與蛋白受體模擬結合，預測其作用模式及結合能，進而實現(xiàn)藥物的篩選與設計［4-5］。所以，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法和分子模擬對接技術，探討中藥大黃在急性胰腺炎治療中產生作用的有效成分和可能的分子作用機制。

1 資料與方法

1.1 檢索大黃活性成分和藥物靶標2021 年10 月至2022 年2 月，以“大黃”為檢索詞，在中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：∕∕old.tcmsp-e.com∕）檢索，以OB≥30%、DL≥0.18 為切點篩選有效成分［3，6］。隨后在該平臺汲取有效成分相映射的基因靶標，通過比對Universal Protein 平臺數(shù) 據(jù)（https：∕∕www.uniprot.org∕），得到靶標基因簡稱。

1.2 檢索疾病靶標從Genecards（https：∕∕www.genecards.org∕）、DisGeNET（https：∕∕www.disgenet.org∕）、OMIM（https：∕∕www.omim.org∕）、pharmGKB（https：∕∕www.pharmgkb.org∕）數(shù)據(jù)庫中以“Acute pancreatitis”為檢索詞檢索。

1.3 獲取大黃-急性胰腺炎交集靶標通過上述步驟得到藥物靶標與疾病靶標取交集，繪制可視化的韋恩（Venn）圖。

1.4 PPI 網(wǎng)絡的構建和關鍵靶標的獲取于String（https：∕∕string-db.org∕）平臺中，導入交集靶標，物種選擇人類，得到蛋白質-蛋白質相互作用網(wǎng)絡（PPI）。然后通過Cytoscape（3.8.2 版）插件CytoNCA 進行拓撲分析，計算網(wǎng)絡中各節(jié)點的度中心性（DC）、接近中心性（CC）、介數(shù)中心性（BC）、特征向量中心性（EC）、局部連通性（LAC）、網(wǎng)絡中心性（NC），找出關鍵靶標［7］。

1.5 藥物成分-疾病靶標網(wǎng)絡的構建Cytoscape 程序中輸入前面得到的藥物成分及交集靶標，構建“大黃活性成分-疾病靶標”網(wǎng)絡，并剔除孤項，后選擇插件CytoNCA 計算節(jié)點度值，找出關鍵有效成分。

1.6 基因富集分析及可視化交集基因本位（GO）功能富集分析、京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，通過R 軟件“Annotation-Hub”“ggplot2”數(shù)據(jù)包運行并可視化。

1.7 分子對接及可視化從PubChem 平臺（https：∕∕pubchem.ncbi.nlm.nih.gov∕）檢索下載大黃成分的2D結構文件。運用ChemOffice2014 處理后導出3D 結構。從PDB數(shù)據(jù)平臺（http：∕∕www.rcsb.org）獲取關鍵蛋白HSP90AA1（PDB ID 5J27）、caspase-3（PDB ID 1CP3）、CASP8（PDB ID 1F9E）、PTGS2（PDB ID 5F19）的3D 結構文件，利用Pymol 軟件對3D 結構去水分子等處理。再用Autodock Tools 4.0 軟件中“add hydrogen”命令對3D 結構進行加氫處理。以Autodock Vina將處理后的藥物3D結構與蛋白3D結構進行分子模擬對接，計算結合能。取結合能最低構象結果，導入Pymol進行可視化。

2 結果

2.1 大黃活性成分及作用靶標共篩選活性成分16種（表1）。數(shù)據(jù)庫預測、刪除重復項后，共得到62個大黃潛在作用靶標。包括：雄激素受體（AR），B細胞淋巴瘤基因2（BCL2），BCL2相關X蛋白（BAX），乙酰膽堿M3 受 體（CHRM3），乙酰膽堿M1 受 體（，CHRM1），乙酰膽堿M4 受體（CHRM4），尼古丁性乙酰膽堿受體α7 亞型（CHRNA7），半胱氨酸蛋白酶9（CASP9），胱天蛋白酶-3（caspase-3），CASP8，凝血因子X（F10），凝血酶原（F2），PTGS2，凝血因子Ⅶ（F7），雌激素受體2（ESR2），二肽酰胺酶4（DPP4），HSP90AA1，胰蛋白酶原1（PRSS1），核受體共激活因子2（NCOA2），DNA 拓撲異構酶Ⅱα（TOP2A），鈣∕鈣調素依賴激酶MT（CAMKMT），鈉離子通道α亞單位5（SCN5A），血管內皮生長因子受體2（KDR），過氧化物酶體素H2 合酶1（PTGS1），醛糖還原酶1（AKR1B1），JUN，雌激素受體1（ESR1），檢查點激酶1（CHEK1），蛋白激酶Aα催化亞單位（PRKACA）微管相關蛋白2（MAP2），蛋白激酶抑制劑α（PKIA），免疫球蛋白G1（IGHG1），CDKN1A，真核翻譯起始因子6（EIF6），腫瘤壞死因子α 誘導蛋白6（TNFAIP6），TP53，脂肪酸合酶（FASN），蛋白激酶Cε（PRKCE），細胞周期蛋白依賴性激酶1（CDK1），蛋白質紫外線過度表達誘導因子（PCNA），MYC，白細胞介素（IL）-1β，蛋白激酶Cδ（PRKCD），細胞周期蛋白B1（CCNB1），二肽酶1（DPEP1），過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG），一氧化氮合酶2（NOS2），克魯伯因樣因子7（KLF7）。

表1 大黃活性成分表

2.2 急性胰腺炎疾病相關靶標篩選了急性胰腺炎的相關基因靶標，其中Genecards、DisGeNET、OMIM、DragBank、PharmGkb 數(shù)據(jù)庫分別得到6 989、435、69、6、121 個靶標，合并去重后共得到7 111 個作用靶標。

2.3 大黃-急性胰腺炎交集靶標綜合分析藥物和疾病靶標，發(fā)現(xiàn)大黃與急性胰腺炎相關交集靶標共55 個，包 括NOS2，AR，F(xiàn)10，PTGS2，F(xiàn)7，TOP2A，ESR2，DPP4，HSP90AA1，PRSS1，NCOA2，F(xiàn)2，SCN5A，KDR，PPARD，PTGS1，AKR1B1，JUN，ESR1，CHEK1，PRKACA，PGR，KCNH2，DRD1，CHRM3，CHRM1，ADRA1A，CHRM2，ADRB2，CHRNA2，SLC6A4，OPRM1，CHRNA7，BCL2，BAX，CASP9，caspase-3，CASP8，PRKCA，PON1，MAP2，CDKN1A，EIF6，TNFAIP6，TP53，F(xiàn)ASN，PRKCE，CDK1，PCNA，MYC，IL-1β，PRKCD，CCNB1，DPEP1，PPARG3。見圖1。

圖1 大黃與急性胰腺炎靶標交集韋恩圖

2.4 PPI 構建STRING 庫中導入55 個交集靶標生成的PPI 包含55 個節(jié)點288 條邊，見圖2A。通過計算得到各節(jié)點的相關參數(shù)，其中BC中位數(shù)為13.50，CC 中位數(shù)為0.46，DC 中位數(shù)為16，EC 中位數(shù)為0.08，LAC 中位數(shù)為8.5，NC 中位數(shù)為9.21。篩選出參數(shù)均大于中位數(shù)的節(jié)點并定義為核心基因靶點，隨后進行拓撲分析，共提取到節(jié)點18 個（見圖2B 黃色部分）。然后以上述方法再次拓撲分析，提取核心節(jié)點8 個，分別為CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2.以此作為下一步分析的核心靶標（圖2C）。

圖2 大黃與疾病交集靶標蛋白作用拓撲網(wǎng)絡：A為交集靶標拓撲網(wǎng)絡；B為初篩核心靶標拓撲網(wǎng)絡；C為最終核心靶標拓撲網(wǎng)絡

2.5 “大黃有效成分-交集靶標”網(wǎng)絡度值分值高的潛在有效活性成分為β-谷甾醇（MOL000358）、蘆薈大黃素（MOL000471）、澤蘭黃醇（MOL002235），見圖3。

圖3 “大黃有效成分-交集靶標”網(wǎng)絡

2.6 富集分析GO 分析結果包括3 項：生物過程（BP）結果1 626 條、細胞組分（CC）結果64 條、分子功能（MF）結果160 條，以P.adjust＜0.01 篩選差異結果，每項可視化差異顯著的前10 位結果。KEGG 結果119 條，以P.adjust＜0.01 篩選差異結果，并可視化前30條結果?？梢暬詶l形圖表示。

GO 分析提示，其參與的生物過程包括：細胞對藥物的反應、節(jié)律過程、對氧水平的反應等；細胞組分包括膜筏、膜微區(qū)、膜區(qū)等；分子功能包括：核受體活化、轉錄因子活化，直接配體調控序列特異性脫氧核糖核酸（DNA）結合、乙酰膽堿受體活化等，見圖4。KEGG 富集通路包括p53 信號通路、乙型肝炎、小細胞肺癌等，見圖5。

圖4 大黃疾病交集靶標基因本位功能富集分析

圖5 大黃與疾病交集靶標京都基因與基因組百科全書通路富集分析

2.7 分子對接選取有效成分度值最高的β-谷甾醇、蘆薈大黃素及與之對應的關鍵蛋白通過Autodock Vina 計算結合能（表2），可視化結果見圖6。

圖6 大黃有效成分與分子對接結合能最低的關鍵靶蛋白分子對接三維圖：A為蘆薈大黃素與熱休克蛋白90α；B為蘆薈大黃素與前列腺素內過氧化物合酶2；C為蘆薈大黃素與胱天蛋白酶3；D為β-谷甾醇與胱天蛋白酶3；E為β-谷甾醇與熱休克蛋白90α；F為β-谷甾醇與胱天蛋白酶8

表2 大黃活性成分與關鍵蛋白結合能∕kcal∕mol

3 討論

大黃是治療急性胰腺炎的傳統(tǒng)中醫(yī)藥物，既可以單獨使用，也可以聯(lián)合使用。大黃進行口服或鼻飼可以縮短病人的腹部癥狀的持續(xù)時間、大便再通時間以及血和尿淀粉酶恢復時間，并降低IL-8、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平以及死亡率［1-2］。

大黃用以治療胰腺炎時發(fā)揮治療效果的活性成分，可能包括蘆薈大黃素，澤蘭黃醇、大黃酸、β-谷甾醇、決明內脂、兒茶素等［8］。其中，蘆薈大黃素可下調AP 大鼠血清中血小板激活因子、IL-6、TNF-α濃度；調節(jié)Treg∕Th17 免疫細胞比例發(fā)揮治療作用［2，9］。β-谷甾醇作為植物甾醇，具有降低血脂水平、退熱消炎、抗氧化應激、抗腫瘤、增強免疫系統(tǒng)等作用［10-11］。決明內脂能抑制細菌中遺傳物質的生物合成，對孢子菌、地絲菌等真菌有較強的抑制作用，同時可降血壓、調血脂［12］。兒茶素可產生H2O2，上調katB、sodM 等基因，減輕氧化應激和DNA 受損對細胞的損傷［12］。澤蘭黃醇具有明顯的抗炎及神經細胞保護作用［13］。大黃酸可通過抑制核因子κB信號通路降低血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 等炎性因子的濃度，抑制炎癥活化因子轉錄，改善炎癥反應引起的血管并發(fā)癥［14］。

本研究進一步通過GO和KEGG分析后發(fā)現(xiàn)，大黃活性成分可能與分布在細胞不同部位的受體相互作用，進而參與多種生物過程、調控多種通路發(fā)揮作用。通過PPI，我們發(fā)現(xiàn)CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2 可能是大黃治療急性胰腺炎的關鍵蛋白。其中蘆薈大黃素可 能與CASP8、HSP90AA1、MYC、CDKN1A、JUN、PTGS2 受體蛋白相互作用；β-谷甾醇可能與CASP8、HSP90AA1、caspase-3、TP53、JUN 受體蛋白相互作用；且二者的分子對接能均＜-5 kcal∕mol。結合能表示蛋白受體與化合物結合是否穩(wěn)定，結合能越低，結合活性越強。熱休克蛋白（HSP）廣泛存在各種生物細胞當中，當應激發(fā)生時，HSP 可大量表達、起到抗炎、抗細胞凋亡及抗氧化作用。急性胰腺炎中HSP90 的升高是誘發(fā)應激性潰瘍的危險因素［15］。HSP90AA1 可以調節(jié)TNF-α 和IL-6 水平，且有研究提示，抑制HSP90AA1表達，可降低小鼠體內巨噬細胞炎癥小體活性，減少炎性因子分泌［16］。PTGS2又稱環(huán)氧合酶2（COX-2），調控其表達的水平可以改善疾病的炎癥癥狀［17］。COX-2高表達與急性胰腺炎發(fā)生相關，COX-2 抑制劑可降低炎癥細胞因子水平，進而減輕全身炎癥反應并預防重癥胰腺炎的發(fā)生［18］。JUN 參與激活蛋白-1 復合物的形成，后者可被大黃抑制，進而減少炎性因子TNF-α、IL-6 生成，發(fā)揮治療作用［19］。Tp53 基因參與細胞凋亡，AP可致胰腺TP53表達量上調，加速了胰腺細胞壞死凋亡［20］。胱天蛋白酶8 是TNF 超家族成員，可與細胞膜表面的死亡受體信號通路結合形成多蛋白死亡誘導信號復合物，進而激活下游的凋亡執(zhí)行因子caspase-3、誘導外源性刺激所致的細胞凋亡。AP 小鼠腸道中caspase-3 表達升高，大黃素可以下調該蛋白的表達，參與調節(jié)AP引起的腸道損傷［21］。

綜上所述，大黃治療AP 的作用機制可能與其活性成分蘆薈大黃素、β-谷甾醇等與靶蛋白（HSP90AA1、PTGS2、CASP8、caspase-3 等）相互結合，進而通過多種途徑發(fā)揮生物學作用。