王一宇

（杭州三式化妝品有限公司，浙江 杭州 310011）

目前，越來(lái)越多的人受到敏感性肌膚的困擾。美國(guó)的一項(xiàng)調(diào)查表明，敏感性肌膚全球總體流行率約為44%[1]。皮膚敏感是指皮膚暴露于某些物理或化學(xué)刺激時(shí)會(huì)出現(xiàn)不愉快的感覺(jué)（如瘙癢、灼熱、刺痛等），而健康皮膚不會(huì)被這些刺激所困擾[1-2]。導(dǎo)致皮膚敏感的因素有很多，包括遺傳因素、內(nèi)分泌失衡、環(huán)境和生活方式的改變、不恰當(dāng)?shù)钠つw護(hù)理等。研究者普遍認(rèn)為皮膚敏感是一種涉及皮膚屏障-神經(jīng)血管-免疫炎癥的復(fù)雜過(guò)程[3]。因此，具有舒緩及修護(hù)皮膚屏障功效的護(hù)膚品是解決皮膚敏感問(wèn)題的有效措施。

目前，市售化妝品活性原料往往只具有舒緩或修護(hù)功效，解決敏感性肌膚問(wèn)題的效果不夠理想。因此該文致力于開(kāi)發(fā)同時(shí)具有舒緩、修護(hù)功效的植物提取物，以期高效解決敏感性肌膚問(wèn)題。該研究分析了含辣木（Moringa oleifera）籽提取物的復(fù)合植物提取液（命名為新解憂精粹2.0）的制備方法及其舒緩、修護(hù)功效評(píng)價(jià)結(jié)果，為研發(fā)舒緩修護(hù)化妝品提供新思路。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

III 型ZTC 1+1 天然澄清劑，北京正天成澄清技術(shù)有限公司；中性蛋白酶，夏盛（北京）生物科技開(kāi)發(fā)有限公司；甘油，化妝品級(jí)，寶潔化工；D101 大孔吸附樹(shù)脂，西安瀚宇樹(shù)脂科技有限公司；RPMI 培養(yǎng)基，HyClone；FBS，Gibco；地塞米松（Dex）、佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯（PMA）、脂多糖（LPS）、十二烷基硫酸鈉（SLS），Sigma；白介素6（IL-6）ELISA Kit，欣博盛生物科技有限公司；前列腺素E2（PGE-2）ELISA Kit，Cayman。

Avanti J-E 離 心 機(jī)，Beckman；DMi1 倒 置 顯 微 鏡，Leica；Bio-II-A 生物安全柜，Telstar；371 二氧化碳培養(yǎng)箱，Thermo Fisher；SPARK 酶標(biāo)儀，TECAN；MPA6 多功能皮膚測(cè)試儀、MX18 和色素和紅色素測(cè)試儀，CK；VapoMeter，Delfin；移液槍，Brand；斑試器，北京百億怡達(dá)科技開(kāi)發(fā)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

前期研究發(fā)現(xiàn)，由小白菊（Chrysanthemum parthenium）花提取物、兩面針（Zanthoxylum nitidum）根提取物、蛇床（Cnidium monnieri）果提取物組成的復(fù)合提取液（命名為新解憂精粹1.0）具有明顯的舒緩、修護(hù)功效。但新解憂精粹1.0 的穩(wěn)定性欠佳，室溫下長(zhǎng)期放置會(huì)有少量沉淀析出。而添加一定比例辣木籽提取液后的復(fù)合提取液的穩(wěn)定性得到改善且修護(hù)功效有進(jìn)一步提升。

1.2.1 Ⅲ型ZTC 1+1天然澄清劑的配制

ZTC 1+1 澄清劑Ⅲ型A 組分溶液的配制：將A 組分粉末10g 置于燒杯中，沿?zé)瓋?nèi)壁緩慢加入990g 水，攪拌均勻。置于55℃水浴中保溫30min 后，在室溫下過(guò)夜溶脹，備用。

ZTC 1+1 澄清劑Ⅲ型B 組分溶液的配制：將B 組分粉末10g 置于燒杯中，沿?zé)瓋?nèi)壁緩慢加入980g 水、10g 冰醋酸，攪拌均勻。置于55℃水浴中保溫30min 后，在室溫下過(guò)夜溶脹，備用。

1.2.2 新解憂精粹2.0的制備

取75g 辣木籽，用物理壓榨的方式脫去油脂。脫脂辣木籽與750g 水混合，在45℃~50℃下攪拌提取2h（該溫度可提取出辣木籽蛋白，同時(shí)避免淀粉糊化，利于后續(xù)的分離純化）后，用Avanti J-E 離心機(jī)以8000r/min離心15min，收集上清液。利用鹽酸將上清液pH 調(diào)至辣木籽蛋白等電點(diǎn)附近（4.0~4.2）。室溫下靜置4h~5h 后，辣木籽蛋白沉淀析出，用Avanti J-E 離心機(jī)以8000r/min離心15min，收集固體（辣木籽蛋白）。辣木籽蛋白與500g水混合，調(diào)節(jié)pH 至6.3~6.5，邊攪拌邊升溫至45℃~50℃，直至形成澄清透明的溶液。向溶液中加入0.03g 中性蛋白酶，在45℃~50℃下酶解6h 后加熱至75℃~80℃，滅酶30min。在該溫度下，中性蛋白酶及殘留的辣木籽蛋白會(huì)變性為難溶于水的微小固體顆粒，而辣木籽蛋白的酶解產(chǎn)物（主要是肽類）溶解于水中。用0.1μm 聚丙烯膜過(guò)濾，濾液與500g 甘油混合，攪拌均勻，可得辣木籽提取液。

將75g 小白菊花、70g 兩面針根、60g 蛇床果混合，用3kg 水在90℃~95℃下攪拌提取2h 后用5μm 聚丙烯膜過(guò)濾。向?yàn)V液中加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑B 組分溶液，攪拌20min，再加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑A 組分溶液，攪拌20min。靜置1h~2h 后，蛋白、鞣質(zhì)被沉淀出來(lái)。用Avanti J-E 離心機(jī)以8000r/min 離心15min，收集上清液。上清液用250gD101 大孔吸附樹(shù)脂攪拌吸附1.5h，棄去液體。樹(shù)脂先用500g 水?dāng)嚢柘疵?0min，棄去水洗液。再用上文制備的辣木籽提取液攪拌洗脫2h。收集辣木籽提取液洗脫部位，用0.1μm 聚丙烯膜過(guò)濾，即得新解憂精粹2.0。

1.2.3 新解憂精粹1.0的制備

將75g 小白菊花、70g 兩面針根、60g 蛇床果混合，用3kg 水90℃~95℃攪拌提取2h 后用5μm 聚丙烯膜過(guò)濾。向?yàn)V液中加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑B 組分溶液，攪拌20min，再加入50g Ⅲ型ZTC 1+1 天然澄清劑A 組分溶液，攪拌20min。靜置1h~2h 后，蛋白、鞣質(zhì)被沉淀出來(lái)。用Avanti J-E 離心機(jī)以8000r/min 離心15min，收集上清液。上清液用250g 的D101 大孔吸附樹(shù)脂攪拌吸附1.5h，棄去液體。樹(shù)脂先用500g 水?dāng)嚢柘疵?0min，棄去水洗液。再用1kg50%甘油-水溶液洗脫，收集50%甘油洗脫部位，用0.1μm 聚丙烯膜過(guò)濾，即得新解憂精粹1.0。

1.2.4 穩(wěn)定性考察

將新解憂精粹1.0、新解憂精粹2.0 分裝于容積為60mL的玻璃瓶?jī)?nèi)（每瓶裝樣55mL）。然后分別置于-18℃、4℃、45℃、室溫避光和室溫光照環(huán)境下考察樣品的穩(wěn)定性。考察指標(biāo)包括顏色、外觀和pH 值，考察周期3 個(gè)月?？疾熘芷趦?nèi)，每隔一周記錄一次樣品的顏色、外觀和pH 值。

1.2.5 舒緩功效評(píng)價(jià)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人單核白血病細(xì)胞（THP-1 細(xì)胞）以適當(dāng)?shù)拿芏冉臃N到96 孔板中。然后每孔加入100μL 的PMA（終濃度為50ng/mL），孵育48h 后棄去細(xì)胞培養(yǎng)上清，每孔再加入100μL 濃度為1μg/mL 的LPS（只含PMA 和LPS，不含待測(cè)樣品的孔為模型組）。然后向測(cè)試孔中加入100μL不同濃度的新解憂精粹2.0（終濃度為0.03%~3.0%）或10μm 的Dex，繼續(xù)培養(yǎng)24h。加入新解憂精粹2.0 的測(cè)試孔為受試物組，添加10μm Dex 的測(cè)試孔為陽(yáng)性對(duì)照組。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清至新的96 孔板中，將細(xì)胞培養(yǎng)上清稀釋至合適的濃度，根據(jù)細(xì)胞因子ELISA 檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行細(xì)胞因子的含量測(cè)定。對(duì)測(cè)試結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用單因素方差分析，ANOVA 計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，并按照公式“抑制率（%）=100×（表達(dá)量模型組-表達(dá)量受試物組）/表達(dá)量模型組”計(jì)算新解憂精粹2.0 對(duì)細(xì)胞因子表達(dá)的抑制率。

1.2.6 修護(hù)功效評(píng)價(jià)

細(xì)胞模型的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，新解憂精粹2.0 修護(hù)UVB 導(dǎo)致細(xì)胞損傷的能力強(qiáng)于新解憂精粹1.0。該研究參考國(guó)標(biāo)及團(tuán)標(biāo)的方法[4-5]在人體上（30 例有效數(shù)據(jù)）評(píng)測(cè)新解憂精粹2.0 的修護(hù)功效，測(cè)試指標(biāo)包括經(jīng)表皮水分散失率（TEWL）和皮膚血紅素含量。

人體功效評(píng)測(cè)于恒溫恒濕實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。受試者在測(cè)試環(huán)境中適應(yīng)30min 后再進(jìn)行功效評(píng)測(cè)。將受試者手臂分為3 個(gè)區(qū)域，分別記作空白區(qū)、1%受試物區(qū)和5%受試物區(qū)。手臂用清水洗凈后吸取25μL 濃度為1.5%的SLS 溶液滴加于斑試器所附的濾紙片上，將斑試器貼敷于受試者手臂的3 個(gè)區(qū)域。24h 后去除斑試器，于室內(nèi)平衡30min。待壓痕消失后，使用VapoMeter 探頭檢測(cè)初始TEWL，使用MX18探頭檢測(cè)初始血紅素含量。每個(gè)區(qū)域重復(fù)測(cè)試3 次，取平均值作為最終測(cè)試結(jié)果。然后向1%受試物區(qū)涂抹15μL 濃度為1%的新解憂精粹2.0 溶液，向5%受試物區(qū)涂抹15μL濃度為5%的新解憂精粹2.0 溶液，空白區(qū)涂抹15μL 空白溶劑。每日涂抹2 次，連續(xù)涂抹3 天。3 天后測(cè)試各區(qū)域TEWL 和血紅素含量。測(cè)試數(shù)據(jù)采用雙尾檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 新解憂精粹2.0的制備

該研究制備的新解憂精粹2.0 為黃色透明液體，具有輕微特征性氣味。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道和定性分析的結(jié)果，新解憂精粹2.0 含有黃酮、生物堿、香豆素、肽類等成分[6]。這些成分是常見(jiàn)的舒緩、修護(hù)類活性物質(zhì)。其中的辣木籽蛋白酶解產(chǎn)物（肽類）既能增強(qiáng)復(fù)合提取液的修護(hù)功效，又能提高提取液的穩(wěn)定性，是較為關(guān)鍵的一類成分。因此，利用《中國(guó)藥典》2020 版4 部通則0731 中的第二法（福林酚法）測(cè)定新解憂精粹2.0 肽類的含量。制備的3 批樣品中，肽類的含量為0.3%~0.5%。

2.2 穩(wěn)定性考察

在考察周期內(nèi)，新解憂精粹2.0 在各條件下的顏色、外觀和pH 值均穩(wěn)定。新解憂精粹1.0 在第三周時(shí)，在45℃條件下有微量固體析出。穩(wěn)定性考察的結(jié)果表明，辣木籽提取物可以提升舒緩、修護(hù)復(fù)合植物提取液的穩(wěn)定性。原因可能是辣木籽蛋白經(jīng)酶解后，與超聲改性的結(jié)果類似，分子間聚集程度加強(qiáng)，結(jié)構(gòu)更加致密，乳化能力增強(qiáng)[7]，增強(qiáng)了與其他成分之間的作用力，同時(shí)也增加了其他成分的溶解度，可避免復(fù)合植物提取液析出固體。

2.3 舒緩功效評(píng)價(jià)

樣品的舒緩功效測(cè)試結(jié)果如圖1 所示。10μm Dex 對(duì)IL-6、PGE-2 表達(dá)的抑制率分別為93.97%和89.17%。0.3%~3.0%的新解憂精粹2.0 對(duì)IL-6、PGE-2 表達(dá)的抑制率均大于77%。1%以上濃度的新解憂精粹2.0 對(duì)IL-6、PGE-2 表達(dá)的抑制率接近100%，具有明顯的劑量依賴性和顯著性差異，說(shuō)明新解憂精粹2.0 具有舒緩功效。

圖1 新解憂精粹2.0 的舒緩測(cè)試結(jié)果

2.4 修護(hù)功效評(píng)價(jià)

TEWL 測(cè)試結(jié)果表明，涂抹新解憂精粹2.0 的3 天后，經(jīng)表皮水分流失率有所下降，1%及5%的新解憂精粹2.0使TEWL 分別降低了6.0%和9.3%，而空白組的TEWL 幾乎沒(méi)有變化。

新解憂精粹2.0 也可減緩血紅素含量的增加。各區(qū)域血紅素含量測(cè)試結(jié)果見(jiàn)表1，血紅素含量增加量如圖2 所示。結(jié)果表明，3 天后，手臂各測(cè)試區(qū)域血紅素的含量均有增加（表1）。但涂抹1%和5%新解憂精粹2.0 的區(qū)域的血紅素含量增加較少（圖2）。TEWL 和血紅素含量測(cè)試結(jié)果說(shuō)明，新解憂精粹2.0 具有一定的修護(hù)功效。在測(cè)試過(guò)程中，所有受試者均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

圖2 3 天后血紅素含量增加值

表1 各測(cè)試區(qū)域的血紅素含量（30 位有效受試者平均值）

3 結(jié)論

根據(jù)前期研究結(jié)果，該文采用特定工藝制備了一種植物復(fù)合提取液，全成分INCI 名為甘油、水、辣木（Moringaoleifera）籽提取物、小白菊（Chrysanthemum parthenium）提取物、兩面針（Zanthoxylum nitidum）提取物、蛇床（Cnidium monnieri）果提取物，命名為新解憂精粹2.0。

穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，在4℃、45℃、室溫避光和室溫光照條件下，新解憂精粹2.0 的顏色、外觀和pH 值在3 個(gè)月考察期內(nèi)均穩(wěn)定。辣木籽蛋白經(jīng)酶解后有提升植物復(fù)合提取液穩(wěn)定性的作用。原因可能是辣木籽蛋白經(jīng)酶解后，與超聲改性的結(jié)果類似，分子間聚集程度加強(qiáng)，結(jié)構(gòu)更加致密，乳化能力增強(qiáng)，可增加其他成分的溶解度，進(jìn)而避免復(fù)合植物提取液析出固體。

體外舒緩功效評(píng)測(cè)結(jié)果表明，新解憂精粹2.0 可抑制THP-1 細(xì)胞分泌IL-6 和PEG-2。人體修護(hù)功效評(píng)測(cè)結(jié)果表明，涂抹1%和5%的新解憂精粹2.0 可降低經(jīng)表皮水分流失率，減緩血紅素的合成。在測(cè)試過(guò)程中，所有受試者均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。該文的研究結(jié)果表明，新解憂精粹2.0具有舒緩、修護(hù)功效，可作為舒緩、修護(hù)原料添加到化妝品中，以解決敏感性肌膚問(wèn)題。