張 英 劉 冰 張海波 楊娟妮 張 田 陳國瑛 馬亞琴

（陜西省種子工作總站，西安 710018）

能力驗(yàn)證是通過檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)間的檢測結(jié)果，來判定其出具檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性、可靠性是否符合規(guī)定要求的合格評定活動(dòng)[1]。農(nóng)作物種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)能力驗(yàn)證，是了解掌握種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)工作開展情況的重要渠道，也是評價(jià)種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)技術(shù)水平高低的重要依據(jù)。能力驗(yàn)證樣品制備是能力驗(yàn)證工作正常開展的重要保障。

陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站近年來多次承擔(dān)各類不同轉(zhuǎn)基因成分檢測能力驗(yàn)證和比對樣品的制備，用于考核通過的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的能力驗(yàn)證、檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)能力考評和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)/間的儀器比對。工作中，陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站科學(xué)合理地設(shè)計(jì)樣品制備方案和測試方案，通過符合性驗(yàn)證、均勻度測試、嚴(yán)格質(zhì)量控制等手段，保質(zhì)保量、科學(xué)高效地完成了樣品制備和測試工作，為評價(jià)檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)轉(zhuǎn)基因成分檢測能力提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

1 工作開展情況

陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站從2014 年開始承擔(dān)各類轉(zhuǎn)基因成分檢測樣品的制備工作，共計(jì)制備樣品2800 余份。制備的樣品涉及玉米、棉花、油菜、大豆、水稻等5 種作物，檢測參數(shù)涵蓋CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、Cp4-epsps基因、Bt基因、Bar/pat基因、Bt11 轉(zhuǎn)化體、MOM810 轉(zhuǎn)化體、TC1507 轉(zhuǎn)化體、BT176 轉(zhuǎn)化體、NK603 轉(zhuǎn)化體、NK603×TC1507 轉(zhuǎn)化體、DBN9936 轉(zhuǎn)化體、TT51-1 轉(zhuǎn)化體、GTS40-3-2 轉(zhuǎn)化體、GT73 轉(zhuǎn)化體、RF3 轉(zhuǎn)化體、抗蟲棉等，共計(jì)2 個(gè)調(diào)控元件、3 個(gè)目的基因、12 個(gè)轉(zhuǎn)化體，基本覆蓋了國內(nèi)常見的轉(zhuǎn)基因作物及常見的轉(zhuǎn)化體。

表1 列舉了陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站每年轉(zhuǎn)基因成分檢測樣品的制備情況。從表1 可以看出，轉(zhuǎn)基因成分檢測制備樣品的轉(zhuǎn)基因含量從最初的0 和1.0% 2 個(gè)梯度，增加到0、0.5%和1.0% 3 個(gè)梯度，樣品份數(shù)從最初2014 年的100 份，增加到2022 年的400 份，說明參與轉(zhuǎn)基因成分檢測能力驗(yàn)證的種子質(zhì)量檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)數(shù)量有所增加，能力驗(yàn)證樣品的需要也在穩(wěn)步增加，這與“十三五”期間對各省種子質(zhì)量檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)加大資金投入和能力建設(shè)密切相關(guān)。

表1 2014-2022 年轉(zhuǎn)基因成分檢測能力驗(yàn)證樣品制備匯總

2 主要做法

2.1 樣品設(shè)計(jì)陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站綜合考慮了目前國內(nèi)外轉(zhuǎn)基因作物的商業(yè)化情況、不同轉(zhuǎn)基因作物的分子特征以及近幾年違規(guī)轉(zhuǎn)基因的檢出情況，確定樣品類型、檢測參數(shù)和轉(zhuǎn)基因含量。樣品選擇粉末形態(tài)，以保證均勻性。檢測參數(shù)選擇實(shí)際檢測工作中常見的調(diào)控元件、目的基因和轉(zhuǎn)化體。轉(zhuǎn)基因含量方面，0 和1.0% 2 個(gè)梯度用于測試檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)正確檢出全部參數(shù)的基本能力，0.5%梯度用于測試檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的能力水平。一般情況下，轉(zhuǎn)基因植物及產(chǎn)品成分檢測標(biāo)準(zhǔn)中定性PCR 陽性對照轉(zhuǎn)基因含量為0.1%～1.0%，檢出限一般在0.05%～0.10%之間；且已報(bào)道的轉(zhuǎn)基因檢測方法，如依賴于凝膠電泳的PCR、多重PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR、數(shù)字PCR 等，檢出限一般在0.01%～0.50%[2]。為確保能力合格的檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)能夠按照檢測標(biāo)準(zhǔn)檢出陽性樣品，且考慮到樣品制備和運(yùn)輸過程中產(chǎn)生的小量誤差，2014年將能力驗(yàn)證中陽性樣品轉(zhuǎn)基因含量水平設(shè)置為1.0%，2016 年考慮到參加轉(zhuǎn)基因成分檢測能力驗(yàn)證的種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)數(shù)量增加，且檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)能力水平不斷提升，為了更有效地區(qū)分不同檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的能力水平，增設(shè)了0.5%的轉(zhuǎn)基因含量梯度。

2.2 方案制定樣品制備需要制定科學(xué)且詳細(xì)的方案、程序和工作計(jì)劃，一方面確保樣品制備的各個(gè)環(huán)節(jié)按照程序規(guī)范開展，另一方面確保各環(huán)節(jié)在計(jì)劃時(shí)間內(nèi)完成，從而保質(zhì)保量、按時(shí)完成樣品制備。與常規(guī)的轉(zhuǎn)基因成分檢測工作相比，能力驗(yàn)證樣品的獲取來源、制備方法、制備要求、預(yù)期效果的驗(yàn)證、分裝包裝、運(yùn)輸保存都有特殊的要求[2]，需要制定專門的方案。

2.3 設(shè)施和環(huán)境的準(zhǔn)備

2.3.1 設(shè)置工作區(qū)域?yàn)榱藴p少污染，選擇與分子檢測區(qū)域不同樓層的種子常規(guī)質(zhì)量檢測室用于能力驗(yàn)證樣品的粉碎、分裝和包裝。樣品核酸提取、擴(kuò)增和電泳分析則使用原有的PCR 檢測功能區(qū)。不同工作區(qū)配備專用的儀器、設(shè)備、試劑、耗材和實(shí)驗(yàn)服等。各工作區(qū)嚴(yán)格按照單向流動(dòng)的原則工作，避免不同樣品間的交叉污染[3]。

2.3.2 選擇原始樣品按照制備樣品的檢測對象、檢測參數(shù)、轉(zhuǎn)基因含量、樣品組合、樣品數(shù)量等要求，選擇經(jīng)過反復(fù)檢測驗(yàn)證的樣品作為制備材料，確保樣品質(zhì)量穩(wěn)定可靠。

2.3.3 購置設(shè)備耗材能力驗(yàn)證樣品需要對能力驗(yàn)證輪次、樣品編號、作物種類、重量等內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)識(shí)。為了高效、高質(zhì)量地完成樣品的分裝及包裝工作，陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站專門購置了鋁箔封口機(jī)、標(biāo)簽打印機(jī)及塑料分裝瓶、封口膜、標(biāo)簽打印紙、自封袋等配套耗材，用于樣品瓶口的封裝和標(biāo)簽的設(shè)計(jì)打印。

2.4 樣品制備制備過程中要按照制備程序規(guī)范操作，保證制備工作嚴(yán)謹(jǐn)精確，自始至終堅(jiān)持無污染原則。

2.4.1 樣品粉碎樣品粉碎按照轉(zhuǎn)基因含量從低到高的順序，先粉碎陰性樣品再粉碎陽性樣品。粉碎機(jī)的配件要做到“一樣一杯一刀座”，粉碎陰性樣品的配件清洗后可繼續(xù)使用，為避免污染，粉碎陽性樣品的配件使用后應(yīng)丟棄。

2.4.2 樣品稱量將粉碎后的陽性樣品按照比例與陰性樣品混合，制備成不同轉(zhuǎn)基因含量的陽性對照和陽性樣品。混合過程中可使用混勻儀等設(shè)備充分混合，確保均勻度，同時(shí)避免不同樣品間的交叉污染和對工作環(huán)境的污染。

2.4.3 樣品分裝和標(biāo)識(shí)樣品分裝封口過程應(yīng)盡量減少污染。標(biāo)簽標(biāo)注時(shí)應(yīng)做到及時(shí)準(zhǔn)確，不能將樣品混淆。按照陰性樣品、陰性對照、陽性樣品、陽性對照的順序分裝與標(biāo)識(shí)。采取分裝一批、封口一批、標(biāo)識(shí)一批的方法進(jìn)行，分裝每一批樣品之前要對環(huán)境進(jìn)行充分徹底地清理。標(biāo)識(shí)的標(biāo)簽應(yīng)包括作物種類名稱、驗(yàn)證輪次、樣品編號、重量等內(nèi)容。

2.5 樣品測試樣品測試是樣品制備工作最重要的質(zhì)量控制手段，包括3 個(gè)階段，分別是制樣前原材料質(zhì)量測試、封裝前均勻性測試、封裝后符合性測試。

2.5.1 原材料質(zhì)量測試用于樣品制備的原材料，使用前應(yīng)進(jìn)行質(zhì)量測試。原材料粉碎后隨機(jī)取3～5個(gè)樣品，進(jìn)行符合性檢測和轉(zhuǎn)基因含量測定，符合預(yù)期結(jié)果的材料方可用于樣品制備。

2.5.2 封裝前均勻性測試樣品研磨完成后，在封裝前應(yīng)對樣品進(jìn)行均勻性測試。均勻性測試采用實(shí)時(shí)熒光PCR 法。每個(gè)陽性樣品隨機(jī)取5 份粉末，進(jìn)行轉(zhuǎn)基因含量測試。對于轉(zhuǎn)基因含量為1%的樣品，重復(fù)間的差異應(yīng)小于0.2%，平均值與預(yù)期值的差異應(yīng)小于0.1%。對于轉(zhuǎn)基因含量為0.5%的樣品，重復(fù)間的差異應(yīng)小于0.1%，平均值與預(yù)期值的差異應(yīng)小于0.05%。超差的樣品應(yīng)重新進(jìn)行混合，直至符合預(yù)期結(jié)果。符合預(yù)期結(jié)果的材料方可用于樣品封裝。

2.5.3 封裝后符合性測試樣品封裝完成后，將每類分裝好的樣品規(guī)則擺放，每類樣品隨機(jī)取3～5 個(gè)樣品，依據(jù)能力驗(yàn)證作業(yè)指導(dǎo)書要求，對每個(gè)檢測參數(shù)進(jìn)行符合性測試。結(jié)果須與預(yù)期一致。若不一致，要查找原因并及時(shí)改正，重新測試一致后方可放行。

2.6 樣品包裝與運(yùn)輸樣品一般采用加厚塑料小瓶包裝，鋁箔封口。每組樣品包括驗(yàn)證樣品、陽性對照和陰性對照。每組樣品用自封袋雙層包裝，外層自封袋標(biāo)注組號，在降低樣品損壞和污染可能性的同時(shí)，方便能力驗(yàn)證的組織實(shí)施單位查詢樣品檢測結(jié)果[2]。

2.7 樣品信息保密樣品編號隨機(jī)生成，至少保證每10 年內(nèi)樣品編號不重復(fù)。每次能力驗(yàn)證活動(dòng)結(jié)束前，嚴(yán)格保密樣品編號、檢測結(jié)果、制備單位等相關(guān)信息，任何人不得向能力驗(yàn)證組織實(shí)施單位以外的單位及個(gè)人透漏信息[4]。

3 經(jīng)驗(yàn)及建議

3.1 采用可靠的原始樣品原始樣品的符合性和轉(zhuǎn)基因含量是樣品制備工作的基礎(chǔ)。原材料須經(jīng)過轉(zhuǎn)基因成分檢測，并使用歐洲標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)局（IRMM）認(rèn)證的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因含量的測定。符合性測試和轉(zhuǎn)基因含量測定均符合預(yù)期的原材料方可作為原始樣品制備能力驗(yàn)證樣品。

3.2 始終堅(jiān)持防污染原則防污染是轉(zhuǎn)基因檢測的重點(diǎn)，可以有效避免假陽性或假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。為了有效區(qū)分不同檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的能力水平，能力驗(yàn)證設(shè)計(jì)的陽性樣品數(shù)量遠(yuǎn)大于日常的轉(zhuǎn)基因檢測任務(wù)。為避免大量陽性樣品粉碎時(shí)產(chǎn)生的粉末污染PCR 檢測功能區(qū)的工作環(huán)境，造成假陽性，制備能力驗(yàn)證樣品時(shí)最好選擇與分子檢測不同的樣品粉碎區(qū)。粉碎時(shí)要注意及時(shí)清理工作環(huán)境，充分清洗粉碎機(jī)配件。

3.3 嚴(yán)格進(jìn)行質(zhì)量控制在檢測環(huán)節(jié)設(shè)置對照樣品是對檢測質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控的最有效方式。制備的樣品在測試過程中應(yīng)設(shè)置空白對照、陰性對照和陽性對照，在保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的同時(shí)，也能檢測反應(yīng)體系是否污染、反應(yīng)體系是否有效擴(kuò)增[3]。

3.4 采用籽粒形態(tài)的樣品作為以后的能力驗(yàn)證樣品為了確保樣品的均勻性，避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果，能力驗(yàn)證樣品一直采用粉末形態(tài)，而種子檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)日常工作中接受委托的樣品，一般都是籽粒形態(tài)的。為了適應(yīng)這一實(shí)際情況，且保證能力驗(yàn)證樣品的均勻性，陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站已經(jīng)進(jìn)行了相應(yīng)的研究摸索，具有了一定的技術(shù)儲(chǔ)備。

能力驗(yàn)證是考核實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果一致性和準(zhǔn)確性、監(jiān)督實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理過程、識(shí)別實(shí)驗(yàn)室存在問題的一種驗(yàn)證活動(dòng)[2]。隨著我國轉(zhuǎn)基因技術(shù)商業(yè)化的不斷推進(jìn)，轉(zhuǎn)基因生物安全監(jiān)管的范圍和難度日益增加。種子質(zhì)量檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)作為農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全監(jiān)管的技術(shù)支撐，通過能力驗(yàn)證評價(jià)其技術(shù)能力和質(zhì)量管理水平十分重要。

樣品制備的穩(wěn)定可靠、均勻一致則是能力驗(yàn)證活動(dòng)有效開展的前提保障[4]。近年來陜西省農(nóng)作物種子檢驗(yàn)站多次承擔(dān)了轉(zhuǎn)基因成分檢測樣品的制備工作，在工作中獲取了很多關(guān)于樣品制備的經(jīng)驗(yàn)與教訓(xùn)，并為以后能力驗(yàn)證制備工作的進(jìn)一步提高做了相關(guān)研究和儲(chǔ)備，為能力驗(yàn)證樣品制備工作更為科學(xué)、規(guī)范地開展提供參考。