吳華莉,張鶯鶯,黃 濟(jì),王洪洋,曹建國,涂尾龍,范 春,談永松*

(1 上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,上海 201106;2 上海種豬工程技術(shù)研究中心,上海 201302;3 上海實(shí)驗(yàn)動物研究中心,上海 201302)

生長因子受體結(jié)合蛋白7(Growth factor receptor-bound protein7,GRB7)是重要的信號銜接蛋白,介導(dǎo)來自FAK 和EphB1 受體的信號通路,在細(xì)胞腫瘤遷移、增殖等過程中發(fā)揮重要作用[1-3]。 GRB7 蛋白含535 個(gè)氨基酸殘基,結(jié)構(gòu)上有3 個(gè)保守區(qū)域,分別為富含脯氨酸的N 末端、GM 結(jié)構(gòu)域和C 末端SH2 結(jié)構(gòu)域。 GRB7 與GRB10、GRB14 序列同源性較高,共同構(gòu)成GRB7∕10∕14 家族蛋白,其主要是通過C 端的SH2結(jié)構(gòu)域識別胞膜酪氨酸激酶受體,參與級聯(lián)酶促反應(yīng)[4]。 人的GRB7 基因位于17q21[5]。 豬GRB7 基因定位于12 號染色體,包含15 個(gè)外顯子,長度為2 191 個(gè)核苷酸[6]。 楊金娥[7]研究發(fā)現(xiàn)豬GRB7 存在兩個(gè)突變位點(diǎn)(理論上可產(chǎn)生9 個(gè)合并基因型),突變位點(diǎn)對應(yīng)基因片段的163 bp 和243 bp 處。 楊述林等[8]研究發(fā)現(xiàn),豬GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)與背膘厚顯著相關(guān)(P＜0.05)。 本試驗(yàn)通過檢測GRB7 基因163 突變位點(diǎn)和243 突變位點(diǎn)在上海地區(qū)5 個(gè)豬群體中的多態(tài)分布,旨在為豬遺傳育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料采集

于上海祥欣畜禽有限公司采集92 個(gè)杜洛克豬、148 個(gè)大白豬和69 個(gè)長白豬豬耳組織塊,于上海豬狀元畜牧綜合場采集79 個(gè)梅山豬豬耳組織塊,于上海富民農(nóng)場采集74 個(gè)申農(nóng)豬豬耳組織塊,共計(jì)462 個(gè)樣品。 將其放入預(yù)先加入1.0 mL 75%酒精的1.5 mL 離心管內(nèi),儲存在冰盒里運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

組織DNA 提取試劑盒采購于上海軒略科技發(fā)展有限公司,PCR 引物在生工生物工程(上海)股份有限公司合成,2 ×Taq PCR Master Mix 和DL 2000 DNA Marker 采購于寶生物工程(大連)有限公司;BstUⅠ內(nèi)切酶采購于上海朝瑞生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取

利用AXYGEN 組織DNA 提取試劑盒提取基因組DNA,并將其統(tǒng)一稀釋至50.0 ng∕mL,分裝后將樣品保存在-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為20 μL:DNA 模板1.0 μL,2 ×Taq PCR Master Mix 11.0 μL,上游引物0.5 μL,下游引物0.5 μL,RNase-Free ddH2O 補(bǔ)至20 μL。 擴(kuò)增上游引物序列為5’-GTCTCATCTCAGCAGCTCC-3’,下游引物序列為5’-GAGCATCTCGCACACGTAG-3’[7]。 反應(yīng)條件為:94 ℃5 min;94 ℃30 s,63 ℃30 s,72 ℃30 s,32 個(gè)循環(huán);72 ℃10 min。 利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物。

1.2.3 基因型檢測

選擇只有一條目的條帶的樣品PCR 產(chǎn)物,進(jìn)行限制性內(nèi)切酶試驗(yàn)。 反應(yīng)體系為:PCR 產(chǎn)物4.0 μL,10 ×Buffer 2.0 μL,BstUⅠ內(nèi)切酶0.5 μL,ddH2O 9.5 μL,總體積為16.0 μL。 反應(yīng)溫度37 ℃,時(shí)間2 h,利用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因型。

1.3 基因型統(tǒng)計(jì)

PCR 擴(kuò)增序列片段存在兩處T∕C 多態(tài),分別位于GRB7 基因第2 內(nèi)含子和第3 外顯子[7]。 理論上PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過BstUⅠ酶切后可產(chǎn)生9 種基因型[7](表1)。

表1 GRB7 基因酶切后的基因型Table 1 Genotypes of GRB7 gene after enzyme digestion

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

根據(jù)參考文獻(xiàn)[9]中方法計(jì)算GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變在5 個(gè)豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率以及合并基因型頻率。 采用GENEPOP 3.1 軟件計(jì)算基因雜合度(Heterozygosity,He)、純合度(Homozygosity,Ho)、有效等位基因數(shù)(Effective number of alleles,Ne)和多態(tài)信息含量(Polymorphism information content,PIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬GRB7 基因PCR 擴(kuò)增

由圖1 可知,以各樣本DNA 為模板,PCR 產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后,獲得的目的條帶均為626 bp。 該片段包含2 個(gè)突變位點(diǎn),可用于后續(xù)的酶切試驗(yàn)。

圖1 GRB7 基因PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.1 PCR products of agarose gel electrophoresis of GRB7 gene

2.2 PCR-RFLP 瓊脂糖凝膠電泳檢測

豬GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)經(jīng)過內(nèi)切酶BstUⅠ消化后,檢測出6 種合并基因型(圖2,圖3):(1)CCTT 型:463 bp、163 bp; (2) CCTC 型: 463 bp、 383 bp、 163 bp、83 bp;(3)CCCC 型:383 bp、163 bp、83 bp;(4)CTTT 型:626 bp、463 bp、163 bp;(5)CTCT 型:626 bp、383 bp、163 bp、83 bp;(6)TTTT 型:626 bp。

圖2 豬GRB7 基因PCR-RFLP 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 PCR-RFLP result of agarose gel electrophoresis of GRB7 gene

圖3 豬GRB7 基因PCR-RFLP 瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR-RFLP result of agarose gel electrophoresis of GRB7 gene

2.3 GRB7 基因在5 個(gè)豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳結(jié)構(gòu)

由表2 所示,163 位點(diǎn)在杜洛克豬群體內(nèi)CC 基因型為優(yōu)勢基因型,只有1 個(gè)樣品為TT 基因型,無CT基因型;在長白豬和大白豬群體內(nèi)CC 基因型和CT 基因型呈中態(tài)分布,只有少量TT 基因型;在申農(nóng)豬群體內(nèi)CC 基因型少于CT 基因型和TT 基因型;在梅山豬群體內(nèi)TT 基因型最多,CT 基因型較少,未檢測出CC 基因型。 在等位基因頻率方面,163 位點(diǎn)在梅山豬群體內(nèi)T 等位基因比例較高,在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內(nèi)C 等位基因比例高,在申農(nóng)豬群體內(nèi)C 和T 等位基因呈現(xiàn)均勻分布。 163 位點(diǎn)突變PIC 值在長白豬、大白豬和申農(nóng)豬群體內(nèi)為0.25—0.50,表現(xiàn)為中度多態(tài),在杜洛克和梅山豬群體內(nèi)的PIC 值低于0.25,表現(xiàn)為低度多態(tài)。

表2 GRB7 基因在5 個(gè)豬群體內(nèi)的基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳結(jié)構(gòu)Table 2 Genotype and gene frequency and population genetic structure indices of GRB7 gene in five pig populations

243 位點(diǎn)在杜洛克豬群體內(nèi)CT 基因型最多,其次為CC 基因型,只有少量TT 基因型;在長白豬群體內(nèi)CT 基因型最多,TT 基因型略少,CC 基因型最少;在大白豬群體內(nèi)CC 基因型和CT 基因型呈中態(tài)分布,TT 基因型最少;在申農(nóng)豬群體內(nèi)TT 基因型最多,CT 基因型略少,CC 基因型最少;在梅山豬群體內(nèi)TT 基因型最多,CT 基因型很少,無CC 基因型。 243 位點(diǎn)在梅山豬和申農(nóng)豬群體內(nèi)T 等位基因比例較高,在長白豬群體內(nèi)T 等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因,在杜洛克豬和大白豬群體內(nèi)C 等位基因?yàn)閮?yōu)勢等位基因。 243位點(diǎn)突變PIC 值在杜洛克豬、長白豬和大白豬群體內(nèi)為0.25—0.50,表現(xiàn)為中度多態(tài),在申農(nóng)豬和梅山豬群體內(nèi)的PIC 值低于0.25,表現(xiàn)為低度多態(tài)。

2.4 GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變合并基因型頻率的分布

如表3 所示,在杜洛克豬群體內(nèi)GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變合并基因型有4 種,其中CCTC型為優(yōu)勢基因型,CCTT 型和CTCT 型頻率較低;在長白豬群體內(nèi)有6 種,其中CCTC 型為優(yōu)勢基因型,CCTT 型和TTTT 型頻率較低;在大白豬群體內(nèi)有6 種,其中CTCT 型為優(yōu)勢基因型,CCTT 型和CCTC 型頻率最低;在申農(nóng)豬群體內(nèi)有6 種,其中TTTT 型為優(yōu)勢基因型,CCTC 型和CCCC 型頻率較低;在梅山豬群體內(nèi)有3 種,其中TTTT 型為優(yōu)勢基因型,CTTT 型和CTCT 型頻率較低。

表3 GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變合并基因型頻率Table 3 The frequency distribution of GRB7 combined genotype

3 討論

GRB7 基因作為信號聯(lián)結(jié)蛋白,參與細(xì)胞增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移過程,在乳腺癌、食管癌和胃腸道間質(zhì)瘤組織中高度表達(dá),可以作為癌癥預(yù)后標(biāo)志物[10-13]。 有研究表明,小鼠和綿羊GRB7 基因在動物早期胚胎附植過程中發(fā)揮作用[14-15]。 楊金娥[7]研究發(fā)現(xiàn),豬GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變的CC 基因型個(gè)體的紅細(xì)胞數(shù)目比TC 基因型個(gè)體的紅細(xì)胞數(shù)目多。

合并基因型的效應(yīng)不是單個(gè)基因型效應(yīng)的簡單相加,群體的遺傳改良還受合并基因型頻率影響[16]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變所產(chǎn)生的優(yōu)勢基因型、等位基因頻率和合并基因型及頻率在5 個(gè)不同豬群體內(nèi)不一樣。GRB7 基因TTTT 合并基因型在申農(nóng)豬和梅山豬群體內(nèi)為優(yōu)勢基因型,在杜洛克豬和長白豬群體內(nèi)CCTC 合并基因型頻率較高,在大白豬群體內(nèi)CTCT 合并基因型頻率較高。 申農(nóng)豬是長白豬×(大白豬×二花臉豬)為基礎(chǔ)群構(gòu)建的母本新品系,含有中國地方豬種二花臉豬血統(tǒng),二花臉豬和梅山豬都屬于太湖豬,是仔數(shù)高產(chǎn)品種,但申農(nóng)豬和梅山豬的背膘厚比外來品種杜洛克、長白豬和大白豬高[17-22],可能與豬GRB7 基因163 位點(diǎn)和243 位點(diǎn)突變有關(guān)[8]。 下一步將檢測TTTT 合并基因型與申農(nóng)豬和梅山豬的背膘厚的關(guān)系。