閆隔,趙娜,張營(yíng)

(1.鄭州市第十五人民醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450041;2.鄭州市中心醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450000;3.河南電力醫(yī)院 病理科,河南 鄭州 450000)

神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤系起源于神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞腫瘤,可發(fā)生于身體任何部位,但最常見(jiàn)的是胃腸胰腺神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(gastrointestinal pancreatic neuroendocrine tumors,GEP-NENs)約占全部神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤2/3[1]。因GEP-NENs異質(zhì)性較強(qiáng),臨床中大多數(shù)生物標(biāo)志物的靈敏度、特異度及可重復(fù)性較差。因此,需尋找新型生物標(biāo)志物以期在GEP-NENs疾病診斷、治療及預(yù)后評(píng)估中起到關(guān)鍵作用[2]。糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)為一種保守絲氨酸/蘇氨酸激酶,可調(diào)節(jié)多種蛋白因子及參與多種信號(hào)通路傳導(dǎo),調(diào)控細(xì)胞分化、增殖與凋亡[3]。乳酸脫氫酶A(lactate dehydrogenase A,LDHA)為一種糖酵解關(guān)鍵酶,既能催化丙酸和L-乳酸的氧化還原反應(yīng),也能催化相關(guān)α-酮酸[4]。研究發(fā)現(xiàn),GSK-3β、LDHA在多種惡性腫瘤中存在異常表達(dá)情況,但關(guān)于二者在GEP-NENs中的表達(dá)及其與臨床病理特征關(guān)系報(bào)道較少。本研究回顧性分析了GSK-3β、LDHA在GEP-NENs中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系,旨在為GEP-NENs臨床防治提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象選取2021年6月至2022年6月收治的98例GEP-NENs患者。(1)納入標(biāo)準(zhǔn):①符合《中國(guó)胃腸胰神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤病理診斷共識(shí)(2020版)》[5]診斷標(biāo)準(zhǔn),且經(jīng)影像學(xué)檢查確診;②術(shù)前未接受任何治療;③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①合并心、肝、腎嚴(yán)重功能障礙;②合并除GEP-NENs外其他惡性腫瘤;③合并自身免疫病;④合并感染性疾病;⑤臨床資料不完整。

1.2 方法

1.2.1收集資料 收集所有患者性別、年齡、手術(shù)方式、腫瘤最大徑、腫瘤部位、TNM分期、病理分級(jí)、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況以及神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物突觸素(synaptophysin,Syn)、嗜鉻素A(chromogranin A,CgA)表達(dá)情況。

1.2.2標(biāo)本來(lái)源 術(shù)后留存新鮮(離體30 min內(nèi))癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤邊緣5 cm)標(biāo)本,置入EP管,液氮冷凍并于-80 ℃下冷藏待檢。

1.2.3主要試劑 兔抗人GSK-3β多克隆抗體、兔抗人LDHA多克隆抗體(美國(guó)Cell Signaling Technology公司),免疫組化SP-9000試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、10%山羊血清封閉液、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2.4檢測(cè)方法 采用免疫組化SP法檢測(cè)GEP-NENs癌組織及癌旁正常組織中的GSK-3β、LDHA表達(dá)情況,具體步驟如下。

1.2.4.1GSK-3β (1)取組織石蠟包塊,常規(guī)切片(4 μm)、脫蠟處理;(2)高壓修復(fù)抗原;(3)阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;(4)滴加羊血清封閉;(5)滴加采用PBS稀釋至1∶200兔抗人GSK-3β一抗,PBS沖洗;(6)滴加經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗;(7)滴加鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶;(8)DAB顯色;(9)蘇木精復(fù)染;(10)脫水、透明、封固、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.4.2LDHA (1)取組織石蠟包塊,常規(guī)切片(4 μm)、脫蠟處理;(2)高壓修復(fù)抗原;(3)阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;(4)滴加羊血清封閉;(5)滴加采用PBS稀釋至1∶300兔抗人LDHA一抗,PBS沖洗;(6)滴加經(jīng)辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗;(7)滴加鏈霉素抗生素蛋白-過(guò)氧化物酶;(8)DAB顯色;(9)蘇木精復(fù)染;(10)脫水、透明、封固、鏡檢。設(shè)置PBS代替一抗為陰性對(duì)照。

1.2.5結(jié)果判讀 由2位經(jīng)驗(yàn)豐富病理醫(yī)生雙盲法單獨(dú)閱片,并隨機(jī)選擇高倍光學(xué)顯微鏡下(200×)的5處視野,每處視野選取100個(gè)細(xì)胞,以陽(yáng)性細(xì)胞占比與染色強(qiáng)度之和判定GSK-3β表達(dá)情況,以陽(yáng)性細(xì)胞占比與染色強(qiáng)度乘積判定LDHA表達(dá)情況,具體標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件處理。計(jì)數(shù)資料采用頻數(shù)和百分?jǐn)?shù)(%)表示,組間差異行χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 GSK-3β、LDHA表達(dá)判定標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 GSK-3β、LDHA在GEP-NENs組織中的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示,98例癌組織中GSK-3β高表達(dá)高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);98例癌組織中LDHA高表達(dá)高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 GSK-3β、LDHA在GEP-NENs組織中的表達(dá)[n(%)]

2.2 GSK-3β、LDHA表達(dá)與GEP-NENs患者臨床病理特征的關(guān)系GSK-3β、LDHA表達(dá)均與GEP-NENs患者的TNM分期、病理分級(jí)、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)(P<0.05),而與GEP-NENs患者的性別、年齡、手術(shù)方式、腫瘤最大徑、腫瘤部位、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Syn、CgA表達(dá)情況無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表3、4。

表3 GSK-3β表達(dá)與GEP-NENs患者臨床病理 特征的關(guān)系[n(%)]

表4 LDHA表達(dá)與GEP-NENs患者臨床病理特征的 關(guān)系[n(%)]

3 討論

國(guó)外研究顯示,GEP-NENs發(fā)病率正逐漸增高[6],但我國(guó)目前尚缺乏發(fā)病率數(shù)據(jù)。目前,尚不清楚GEP-NENs確切病因,且多數(shù)患者臨床表現(xiàn)無(wú)特異性,未能引起足夠重視,因而多數(shù)患者確診時(shí)疾病已進(jìn)展至中晚期,預(yù)后較差。因此,早期診斷并積極治療意義重大[7-8]。目前用于GEP-NENs診斷的生物標(biāo)志物多為疾病癥狀及神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞分泌產(chǎn)物,如胰高血糖素、促胃液素、胰島素、5-羥吲哚乙酸等,但此類標(biāo)志物多局限于特定神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤[9]。為尋找適用范圍更廣、診斷價(jià)值更高生物標(biāo)志物,本研究分析了GSK-3β、LDHA在GEP-NENs中表達(dá)及與臨床病理特征關(guān)系。

GSK-3β為一種具有多功能的胞漿蛋白,主要在細(xì)胞核及線粒體中表達(dá),且活性較高。研究表明,GSK-3β參與了多種惡性腫瘤細(xì)胞增殖、生長(zhǎng)、侵襲、轉(zhuǎn)移及凋亡過(guò)程,為關(guān)鍵的腫瘤治療靶點(diǎn);此外,研究還發(fā)現(xiàn)GSK-3β在不同類型惡性腫瘤中具有促癌及抑癌2種相反作用[10-11]。本研究結(jié)果表明,GSK-3β在GEP-NENs癌組織中呈高表達(dá),與胡媛等[12]研究結(jié)果一致,提示GSK-3β表達(dá)上調(diào)可能在GEP-NENs發(fā)生、發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。進(jìn)一步分析GSK-3β表達(dá)與患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn),TNM分期、病理分級(jí)更高、浸潤(rùn)程度更深以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GEP-NENs組織中GSK-3β表達(dá)水平更高,說(shuō)明GSK-3β參與了GEP-NENs發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。分析原因可能為:(1)GSK-3β以去磷酸化效用參與GEP-NENs細(xì)胞增殖及分化;(2)GSK-3β正性調(diào)節(jié)核轉(zhuǎn)錄因子-kB(NF-kB),激活B淋巴細(xì)胞瘤-2基因(BCL-2)、X連鎖凋亡抑制蛋白基因(XIAP)、細(xì)胞周期蛋白D1基因(cyclin D1)等多種靶基因表達(dá),從而促進(jìn)GEP-NENs細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移;(3)抑制GSK-3β表達(dá)可干擾Rac1亞細(xì)胞的定位,抑制基質(zhì)降解、驅(qū)使細(xì)胞遷移以及侵襲性板狀偽足生成,從而抑制GEP-NENs細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移。

腫瘤細(xì)胞一系列生物學(xué)行為都需要能量代謝支持。腫瘤細(xì)胞處于有氧環(huán)境中亦更多地以無(wú)氧糖酵解方式獲得能量,此效應(yīng)被稱為有氧糖酵解效應(yīng)(Warburg效應(yīng))[13]。LDHA為Warburg效應(yīng)中關(guān)鍵酶,被證實(shí)與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展息息相關(guān),同時(shí)也被認(rèn)為是一個(gè)極具希望的腫瘤治療靶點(diǎn)[14]。本研究結(jié)果表明,LDHA在GEP-NENs癌組織中呈高表達(dá),和鞏芮寧等[15]報(bào)道結(jié)果相同,提示LDHA表達(dá)上調(diào)可能在GEP-NENs發(fā)生、發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色。進(jìn)一步分析LDHA表達(dá)與患者臨床病理特征發(fā)現(xiàn),TNM分期、病理分級(jí)更高、浸潤(rùn)程度更深以及發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的GEP-NENs組織中LDHA表達(dá)水平更高,說(shuō)明LDHA參與了GEP-NENs發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程。分析原因可能為:(1)LDHA可促進(jìn)乳酸生成來(lái)改變腫瘤細(xì)胞內(nèi)部微環(huán)境,并抑制機(jī)體免疫監(jiān)測(cè),從而促進(jìn)GEP-NENs發(fā)生、發(fā)展;(2)抑制LDHA表達(dá)可促進(jìn)活性氧生成,使得肌動(dòng)蛋白重構(gòu)功能減弱,抑制腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移;(3)LDHA通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程促進(jìn)GEP-NENs細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

綜上所述,GSK-3β、LDHA在GEP-NENs中均呈過(guò)表達(dá),且其表達(dá)水平與GEP-NENs患者TNM分期、病理分級(jí)、浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)。本研究不足之處在于本研究為回顧性研究,選取樣本量較少,可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生一定偏倚。此外,本研究?jī)H分析了GSK-3β、LDHA表達(dá)與GEP-NENs臨床病理特征的關(guān)系,未分析與GEP-NENs患者預(yù)后的關(guān)系。以上不足有待進(jìn)一步研究完善。