王志銀,王世巖,劉京碩,宋琛,張海光

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 a.檢驗(yàn)科;b.婦產(chǎn)科,河南 衛(wèi)輝 453100)

傳染性單核細(xì)胞增多癥(infectious mononucleosis,IM)是由EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染后引發(fā)的常見血液系統(tǒng)疾病類型,兒童和青少年由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完全是EBV感染的高危人群[1-2]。EBV感染B淋巴細(xì)胞后可在一定條件下激活并釋放EBV病毒顆粒,進(jìn)而激發(fā)機(jī)體免疫應(yīng)答,人體免疫系統(tǒng)在殺傷病毒的同時(shí)對機(jī)體造成免疫破壞,是IM發(fā)病的主要原因和機(jī)制[3-4]。IM的癥狀多表現(xiàn)為發(fā)熱、淋巴結(jié)炎癥等,多數(shù)預(yù)后良好,但也有少數(shù)患兒會合并急性或慢性并發(fā)癥,如肝損傷、腎損傷、嚴(yán)重扁桃體增大伴氣道阻塞等,其中肝損傷是較為常見的類型。相關(guān)研究提示,EBV感染后免疫破壞的程度可能與并發(fā)肝損傷及預(yù)后具有一定相關(guān)性,但尚未有明確結(jié)論[5]?；诖?本研究擬通過檢測IM患兒外周血T淋巴細(xì)胞亞群及肝臟損傷標(biāo)志物水平,分析IM患兒EBV感染后的病毒載量及免疫狀態(tài)與肝臟損傷程度的相關(guān)性,從而為臨床預(yù)后評估提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象40例IM患兒來自2021年1月至2022年12月在新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院兒科就診的患兒(IM組),其中男25例,女15例;年齡11～131個(gè)月,平均(56.4±30.3)個(gè)月。入組標(biāo)準(zhǔn)[6]:(1)有發(fā)熱、咽峽炎、頸部淋巴結(jié)或肝脾大等典型的臨床特征;(2)抗EBV衣殼抗原IgM和IgG抗體陽性等;(3)外周血淋巴細(xì)胞絕對值>5.0×109L-1和異型淋巴細(xì)胞比率≥10%;(4)首次確診,且年齡≤14歲;(5)未接受系統(tǒng)性治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)有除EBV以外的其他微生物感染證據(jù);(2)合并EBV感染相關(guān)的嗜血細(xì)胞綜合征、淋巴瘤等血液系統(tǒng)疾病及重大的免疫缺陷性疾病;(3)長期服用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑等藥物;(4)有既往EBV感染史。另隨機(jī)選擇同期來院體檢的40例健康兒童為對照組,其中男25例,女15例,年齡19～132個(gè)月,平均(62.5±29.8)個(gè)月。兩組兒童在性別及年齡上比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究經(jīng)受試者監(jiān)護(hù)人同意及新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 標(biāo)本采集采集每位IM患兒及健康兒晨起空腹外周靜脈血10 mL,其中乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗凝3管,每管2 mL,分別用于血常規(guī)、T淋巴細(xì)胞亞群及EBV核酸定量檢測;普通促凝管4 mL,用于肝功能指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase,ALT)及谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的檢測。

1.3 主要試劑和儀器流式細(xì)胞儀(DxFlex型)、流式熒光單抗試劑CD4-FITC、CD8-PE、CD3-ECD、CD45-PC7、單克隆同型對照IgG1-FITC/PE/ECD/PC7、自動(dòng)生化分析儀(AU-5800型)、ALT、AST檢測試劑盒均為美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn);EBV核酸檢測試劑盒及Smart全自動(dòng)核酸提取儀(廣州達(dá)安基因股份有限公司);Mx3000熒光定量PCR儀(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司); XN-2000型全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及血常規(guī)檢測相關(guān)試劑(希森美康醫(yī)用電子有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T淋巴細(xì)胞亞群 取流式專用試管2支,分別標(biāo)記為A管、B管,A管中加入CD45-PC7、CD4-FITC、CD8-PE、CD3-ECD各20 μL,然后加入充分混勻后的抗凝全血100 μL,震蕩混勻,室溫孵育15 min,加入溶血素500 μL,震蕩混勻,孵育10 min,加入2 mL磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS),200g離心5 min,棄上清,加入500 μL PBS重懸;B管使用單克隆同型對照抗體重復(fù)上述步驟,樣本制備完成后,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測。

1.4.2測定EBV核酸定量 血液樣品處理后提取DNA,使用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)-熒光探針法進(jìn)行EBV DNA定量分析,操作按照試劑盒說明書進(jìn)行:將提取出的DNA加入到預(yù)混的反應(yīng)體系中,再進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為:93 ℃ 2 min,93 ℃ 45 s,55 ℃ 60 s,共10個(gè)循環(huán);93 ℃ 30 s,55 ℃ 45 s,共30個(gè)循環(huán);而后25 ℃ 10 s冷卻。反應(yīng)結(jié)束后,依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線儀器自動(dòng)讀取EBV拷貝數(shù)并顯示結(jié)果。

1.4.3白細(xì)胞及肝功能指標(biāo)檢測 采用全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀檢測兩組兒童的白細(xì)胞計(jì)數(shù)并分類:白細(xì)胞計(jì)數(shù)(white blood cells count,WBC)、中性粒細(xì)胞百分比(Net%)、淋巴細(xì)胞百分比(LYM%)及單核細(xì)胞百分比(Mon%),采用全自動(dòng)生化分析儀檢測肝功能指標(biāo)ALT及AST。

2 結(jié)果

2.1 IM組與對照組兒童白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)比較IM組患兒WBC、LYM%高于對照組,Net%低于對照組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);兩組間Mon%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 IM組與對照組白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)比較

2.2 IM組與對照組兒童T淋巴細(xì)胞亞群的比較IM組患兒外周血CD3+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞比率均高于對照組,CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞比率及CD4+/CD8+的比值均低于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表2。

表2 IM組與對照組T淋巴細(xì)胞亞群分布比較

2.3 IM組與對照組兒童肝損傷標(biāo)志物比較IM組患兒的肝功能標(biāo)志物ALT、AST水平均高于對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表3。

表3 IM組與對照組肝損傷標(biāo)志物比較

2.4 IM組患兒病毒載量與肝臟損傷標(biāo)志物的相關(guān)性IM組患兒EBV DNA載量水平為(70.95±1.03)×103copies·mL-1,對照組兒童EBV DNA載量水平低于最低檢測值(0.5×103copies·mL-1)。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,IM組患兒的EBV DNA載量水平與ALT和AST水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。

2.5 IM患兒T淋巴細(xì)胞亞群與肝損傷標(biāo)志物的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,CD3+T細(xì)胞比率與ALT及AST水平均呈正相關(guān)(P<0.05),CD3+CD4+T細(xì)胞比率與AST呈正相關(guān)(P<0.05)。CD3+CD4+T細(xì)胞比率與ALT、CD3+CD8+T細(xì)胞比率及CD4+/CD8+比值與ALT、AST間均未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性(P>0.05)。

3 討論

兒童及青少年由于免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善,免疫功能較弱,易受EBV感染并引起IM的發(fā)病[7-8]。雖然IM屬于自限性疾病,大部分患兒預(yù)后較好,但是由于免疫力個(gè)體差異的原因,部分患兒可出現(xiàn)腦膜炎、周圍神經(jīng)病變、肝功能損傷等并發(fā)癥,對患兒造成一定損傷及后遺癥[9-10]。因此,密切監(jiān)測患兒病情進(jìn)展并及時(shí)預(yù)防相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生對于改善患兒預(yù)后、提高生存質(zhì)量具有重要意義。ALT及AST是用于評估肝損傷的最主要標(biāo)志物。EB病毒雖然為非嗜肝病毒類型,但其引起的急慢性感染依然為肝功能帶來了許多不良影響[11]。本研究結(jié)果顯示,與健康兒相比,IM組患兒肝功能指標(biāo)ALT及AST存在一定程度的升高,提示IM患兒發(fā)生肝損傷的機(jī)率較大。通過病毒DNA載量與ALT及AST相關(guān)性的分析發(fā)現(xiàn),病毒載量越高,ALT及AST水平也相對升高,提示以病毒載量為指征的病情嚴(yán)重程度與引起的免疫性肝臟損傷的風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)性。因此,提示臨床在檢驗(yàn)結(jié)果顯示病毒載量過高時(shí)應(yīng)適當(dāng)給予預(yù)防性肝損傷治療。

已有研究顯示,IM患兒EB病毒感染后的免疫狀態(tài)與預(yù)后及轉(zhuǎn)歸具有密切相關(guān)性[12-13]。T淋巴細(xì)胞亞群分布特征是機(jī)體免疫狀態(tài)的重要體現(xiàn),其中CD4+T細(xì)胞主要輔助B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體,當(dāng)患兒EBV病毒激活后B細(xì)胞的功能受到一定影響,此時(shí)機(jī)體的免疫功能受到抑制,導(dǎo)致CD4+輔助性T細(xì)胞的比率降低[14]。CD8+T細(xì)胞是殺傷病毒感染B細(xì)胞的主要細(xì)胞,當(dāng)EBV病毒開始復(fù)制時(shí),免疫系統(tǒng)會提高CD8+T細(xì)胞比率用于抑制病毒復(fù)制[15]。因此,CD4+及CD8+細(xì)胞比率是反映機(jī)體免疫狀態(tài)的指征之一,而CD4+/CD8+比值是判斷人體免疫功能平衡或紊亂的敏感指標(biāo)[16-17]。本研究結(jié)果顯示,IM患兒外周血WBC、LYM%均高于對照組,Net%低于對照組,CD3+、CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞水平高于對照組,CD4+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值低于對照組,提示IM患兒的細(xì)胞免疫功能處于抑制狀態(tài),與EBV感染后對免疫系統(tǒng)的攻擊有關(guān)。有研究顯示,EB感染后患兒除發(fā)熱、頭痛等,部分還合并表現(xiàn)出嚴(yán)重的疲勞、惡心、嘔吐和納差,體現(xiàn)其可能并發(fā)肝損傷或輕度肝炎[18]。有研究甚至發(fā)現(xiàn)在超過90%的EBV感染相關(guān)IM病例中合并肝臟受累[19],但通常是短暫性、輕度和自限性的,或僅通過支持治療即可控制,極少數(shù)病例合并由感染引起的嚴(yán)重或致命性肝炎,但多在免疫功能低下的病例中出現(xiàn),提示其發(fā)病與免疫反應(yīng)的相關(guān)性[20-21]。本研究結(jié)果顯示,IM患兒的CD3+T細(xì)胞比率與肝功能指標(biāo)ALT及AST、CD3+CD4+T細(xì)胞比率與AST均呈正相關(guān),提示IM患兒很可能由于CD3+T淋巴細(xì)胞的過度激活造成肝損傷,并由于機(jī)體的整體免疫失衡狀態(tài)加劇肝損傷狀態(tài)。臨床診療過程中應(yīng)對該方面進(jìn)行密切關(guān)注,以避免IM患兒預(yù)后不良。

綜上所述,IM患兒的病毒載量及外周血T淋巴細(xì)胞亞群分布特征可作為表征或預(yù)測肝損傷的指征,對于臨床檢測結(jié)果為高病毒載量、高CD3+T淋巴細(xì)胞水平的患兒應(yīng)密切監(jiān)測肝功能,并及時(shí)采取干預(yù)措施以降低患兒肝損傷的概率。本研究局限性在于收集病例周期短、樣本量較小,僅在肝功能損傷指征方面提出初步研究思路,在進(jìn)一步研究中,會繼續(xù)加大樣本量、延長觀察周期,以獲取更準(zhǔn)確的結(jié)論。