葉露,張明芳,姜明強(qiáng),張園園,孫萍,葛新

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 乳腺外三科,河南 鄭州 450052)

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤,隨著近些年發(fā)病率逐漸升高,乳腺癌已經(jīng)成為女性癌癥死亡的主要原因,嚴(yán)重威脅患者生命健康[1]。盡管隨著手術(shù)、放化療結(jié)合靶向治療等手段的綜合運(yùn)用,近20年乳腺癌患者的生存獲益和生活質(zhì)量有了較大提高,但由于乳腺癌分型的特殊性,其治療預(yù)后仍不盡如人意?！禖SCO乳腺癌診療指南(2022版)》[2]提示目前中國(guó)乳腺癌患者總體5 a生存率已超過(guò)80%,其中北京、上海、廣州等城市三甲醫(yī)院早期乳腺癌的5 a生存率達(dá)到了90%以上。20年來(lái),我國(guó)總患者數(shù)雖然在增加,但晚期患者比率在下降,早期患者的比率在增高[3]。因此尋找乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的根本原因,進(jìn)一步探討乳腺癌發(fā)病的分子學(xué)機(jī)制,確定新的預(yù)測(cè)性標(biāo)志物及潛在的治療靶點(diǎn)仍是提高乳腺癌治療的重要研究方向。

銅離子是生物體中必不可少的輔助因子,當(dāng)其水平超過(guò)一定閾值時(shí),就會(huì)對(duì)機(jī)體產(chǎn)生毒害作用[4]。過(guò)量的銅離子可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但其機(jī)制尚不清楚。銅死亡是近幾年研究者新發(fā)現(xiàn)的一種新的細(xì)胞死亡形式,區(qū)別于其他的細(xì)胞程序性死亡(如鐵死亡、細(xì)胞凋亡等),銅死亡依賴(lài)于線粒體呼吸,其特征是細(xì)胞內(nèi)游離銅積累,導(dǎo)致其蛋白質(zhì)脂化,從而誘發(fā)細(xì)胞毒性應(yīng)激,最終誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[5-6]。目前已報(bào)道與銅死亡相關(guān)的基因有10余個(gè),其中腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白1(ferredoxin 1,FDX1)是發(fā)現(xiàn)的最重要的正向調(diào)控因子[7]。FDX1是一種編碼強(qiáng)效銅離子載體(elesclomol)的靶向蛋白,已知可將Cu2+還原為更具有毒性的Cu+。當(dāng)FDX1基因被敲除后,能夠賦予細(xì)胞更強(qiáng)的對(duì)銅誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的免疫力[8]。此研究說(shuō)明銅與線粒體代謝的緊密關(guān)系,目前有關(guān)FDX1在腫瘤中的研究較少。本研究通過(guò)腫瘤基因表達(dá)圖譜(the Cancer Genome Atlas,TCGA)公共數(shù)據(jù)集乳腺癌在線數(shù)據(jù)并對(duì)其進(jìn)行分析,明確FDX1基因在乳腺癌中的表達(dá)情況,分析其對(duì)乳腺癌預(yù)后生存的影響,探討FDX1作為銅死亡重要調(diào)控基因,是否可以作為潛在的預(yù)后預(yù)測(cè)因子和治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集收集采用Bioconductor中的TCGABiolinks函數(shù)包(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/TCGAbiolinks.html)[9]和TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://tcga-data.nci.nih.gov./Tcga/)[10]下載乳腺癌數(shù)據(jù)庫(kù)mRNA表達(dá)的RNAseqTPM數(shù)據(jù)。分析整理臨床資料及樣本分型信息,最終收集TCGA數(shù)據(jù)集1 083例。

1.2FDX1表達(dá)與臨床病理表征和預(yù)后的關(guān)系根據(jù)FDX1表達(dá)(中位數(shù))將腫瘤樣本分為高表達(dá)和低表達(dá)兩組,分別分析FDX1表達(dá)與T(tumor)分級(jí)、N(nearby lymph nodes)分級(jí)、M(metastasis)分級(jí)、病理分級(jí)、組織學(xué)分型、雌激素受體(estrogen receptor,ER)表達(dá)、孕激素受體(progesterone receptor,PR)表達(dá)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2,HER2)表達(dá)、PAM50、解剖腫瘤部位、放射治療的相關(guān)性。PR、ER、HER2根據(jù)患者病理分級(jí)分為陰性(<1%)、中間(1%～9%)、陽(yáng)性(≥10%)。Bc-GeExminer 3.0(http://bcgenex.ico.unicancer.fr/)[11]數(shù)據(jù)庫(kù)在免疫組化水平上分析FDX1表達(dá)與ER表達(dá)、PR表達(dá)與HER2表達(dá)狀態(tài)的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(kù)(https://kmplot.com/analysis/)[12]進(jìn)行在線生存分析。

1.3 免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性分析采用Timer 2.0(http://timer.cistrome.org/)[13]在線分析FDX1表達(dá)與CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及樹(shù)突細(xì)胞免疫浸潤(rùn)相關(guān)性,Rho代表相關(guān)系數(shù),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 基因介導(dǎo)通路預(yù)測(cè)及富集分析采用LinkedOmic(http://www.linkedomics.org/login.php)[14]在線分析系統(tǒng),分析TCGA-BRCA(Firehose_RSEM_log2)數(shù)據(jù)集,皮爾森相關(guān)性檢測(cè),在LinkInterpreter中尋找Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)分析工具,參照缺省參數(shù)設(shè)置進(jìn)行富集分析,隨機(jī)組合次數(shù)為1 000次,錯(cuò)誤發(fā)生率(false discovery rate,FDR)<0.05的基因集被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 免疫組織化學(xué)免疫組織化學(xué)采用SP法染色。制作組織石蠟切片,烤片后行脫蠟、水化、枸櫞酸鹽高壓抗原修復(fù)、過(guò)氧化氫去除內(nèi)源性過(guò)氧化酶以及室溫孵育10 min。加入一抗(FDX1,proteintech,稀釋比例1∶200),4 ℃孵育過(guò)夜。第2天,PBS沖洗切片3次,每次5 min,加入山羊抗兔二抗,室溫孵育45 min,PBS沖洗切片3次,每次5 min,配制足夠的DAB顯色液,顯微鏡下觀察,顯色1～3 min,再行蘇木精復(fù)染,脫水,封固處理。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析FDX1表達(dá)與臨床病理信息的關(guān)系。生存分析采用log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1FDX1表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系在TCGA數(shù)據(jù)集中,相對(duì)比癌旁組織,FDX1在乳腺腫瘤組織中低表達(dá)。Bc-GeExminer 3.0數(shù)據(jù)庫(kù)免疫組化結(jié)果提示FDX1在ER、PR、HER2陰性組高表達(dá),見(jiàn)圖1。進(jìn)一步收集20例乳腺癌和正常乳腺組織,采用免疫組化的方法檢測(cè)FDX1在乳腺組織中的蛋白表達(dá)水平,高倍鏡下觀察,FDX1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有表達(dá),FDX1陽(yáng)性表達(dá)部位主要定位于細(xì)胞核周?chē)募?xì)胞質(zhì)中。20例乳腺組織中,18例FDX1高表達(dá),高表達(dá)率90%。腫瘤組織中未見(jiàn)FDX1陽(yáng)性表達(dá),見(jiàn)圖2?；赥CGA數(shù)據(jù)庫(kù)中臨床資料,構(gòu)建基線數(shù)據(jù)表,FDX1表達(dá)與ER表達(dá)、PR表達(dá)、PAM50表達(dá)情況有關(guān)(P<0.001),而與年齡、T分級(jí)、N分級(jí)、M分級(jí)、病理分級(jí)、HER2表達(dá)、組織學(xué)分型、解剖腫瘤部位、是否接受放射治療均無(wú)關(guān)(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 FDX1表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系分析 (TCGA數(shù)據(jù)集)

A為T(mén)CGA數(shù)據(jù)集中FDX1在乳腺癌和癌旁的表達(dá);B～D為Bc-Geminer 3.0檢測(cè)FDX1表達(dá)與ER、PR、HER2表達(dá)的關(guān)系。

A為FDX1在正常乳腺組織中陽(yáng)性表達(dá);B為FDX1在乳腺癌組織中陰性表達(dá)。

2.2FDX1表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系采用Kaplan-Meier Plotter對(duì)TCGA進(jìn)行生存分析,包括總生存期(overall survival,OS)、無(wú)復(fù)發(fā)生存期(relapse-free survival,RFS)、無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移生存期(distant metastasis-free survival,DMFS)。在TCGA數(shù)據(jù)集中(n=943),根據(jù)FDX1表達(dá)中位數(shù),將樣本分為FDX1高表達(dá)及低表達(dá)組,FDX1低及高表達(dá)組乳腺癌患者的中位OS為69.7個(gè)月和136.8個(gè)月,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.6,95% CI:0.43～0.86,P=0.004)。TCGA數(shù)據(jù)集中(n=2 032),FDX1低及高表啊組乳腺癌患者的中位RFS為30個(gè)月和44個(gè)月,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.68,95% CI:0.58～0.79,P<0.001)。TCGA數(shù)據(jù)集中(n=2 765),FDX1低及高表達(dá)組乳腺癌患者的中位DMFS為222.8個(gè)月和236.2個(gè)月,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.68,95% CI:0.58～0.79,P=0.007)。見(jiàn)圖3A～C。進(jìn)一步分析了FDX1對(duì)三陰性乳腺癌預(yù)后的影響,結(jié)果如圖3D～F結(jié)果所示,TCGA數(shù)據(jù)集中(n=201),兩組中位OS差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.5,95% CI:0.27～0.84,P=0.028),見(jiàn)圖3D。TCGA數(shù)據(jù)集中(n=534),FDX1低及高表達(dá)組乳腺癌患者的中位RFS為32.1個(gè)月和28.2個(gè)月,兩組差異無(wú)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.97,95% CI:0.72～1.32,P=0.862),見(jiàn)圖3E。TCGA數(shù)據(jù)集中(n=424),FDX1低及高表達(dá)組乳腺癌患者的中位DMFS為27.1個(gè)月和48.1個(gè)月,兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(HR=0.6,95% CI:0.42～0.87,P=0.006)。見(jiàn)圖3F。

A為OS;B為RFS;C為DMFS;D為三陰性O(shè)S;E為三陰性RFS;F為三陰性DMFS。

2.3FDX1與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)性的分析進(jìn)一步使用Timer 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)在線分析FDX1對(duì)免疫細(xì)胞浸潤(rùn)性的影響,結(jié)果顯示,FDX1表達(dá)與免疫細(xì)胞CD8+T細(xì)胞(Rho=0.157,P<0.001)、CD4+T細(xì)胞(Rho=0.105,P<0.001)、B細(xì)胞(Rho=0.114,P<0.001),巨噬細(xì)胞(Rho=0.103,P<0.001)、單核細(xì)胞(Rho=0.238,P<0.001)、中性粒細(xì)胞(Rho=0.323,P<0.001)及樹(shù)突狀細(xì)胞(Rho=0.118,P<0.001)免疫浸潤(rùn)呈正相關(guān)。通過(guò)使用GSVA R語(yǔ)言包分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)24種免疫細(xì)胞亞型在FDX1高表達(dá)和低表達(dá)組中乳腺癌患者的腫瘤免疫微環(huán)境中的差異。結(jié)果顯示,FDX1高、低表達(dá)組間的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK細(xì)胞、T helper細(xì)胞、Th1細(xì)胞、Th2細(xì)胞、TFH細(xì)胞、Treg細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

A為T(mén)IMER數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)FDX1表達(dá)與免疫細(xì)胞(CD4+T,CD8+T,B細(xì)胞,單核細(xì)胞,中性粒細(xì)胞,樹(shù)突狀細(xì)胞)免疫浸潤(rùn)的相關(guān)性;B為FDX1高、低表達(dá)組中24種免疫細(xì)胞亞型比率。

2.4FDX1的功能富集性分析進(jìn)一步分析FDX1對(duì)相關(guān)功能機(jī)制的影響,結(jié)果提示FDX1對(duì)諸多生物學(xué)過(guò)程有影響,變化影響位于前3位的分別是核糖體(FDR<0.001,NES=2.35),氧化磷酸化(FDR<0.001,NES=2.19),帕金森病(FDR<0.001,NES=2.09)。見(jiàn)圖5。

A為L(zhǎng)inkedOmics分析結(jié)果;B為核糖體;C為氧化磷酸化;D為帕金森病。

3 討論

銅是一種常見(jiàn)的金屬元素,位于元素周期表第29位,是一種過(guò)渡性元素,具有氧化還原性,在自然界中常以Cu2+復(fù)合物存在,在常規(guī)化合物反應(yīng)下,還原型Cu+可氧化為氧化型Cu2+[3]。二價(jià)銅離子可與多種酶結(jié)合,作為輔助因子參與蛋白的功能,調(diào)控機(jī)體的線粒體代謝、氧化還原反應(yīng)等多種生理過(guò)程[13]。此外,機(jī)體內(nèi)銅離子水平的動(dòng)態(tài)失衡將導(dǎo)致細(xì)胞自噬功能異常,從而誘發(fā)銅離子介導(dǎo)的相關(guān)疾病的發(fā)生。因此說(shuō)銅離子的穩(wěn)定對(duì)于機(jī)體至關(guān)重要。2022年,Tsvetkov等[8]首次提出了“銅死亡(cuprotosis)”的概念,這是一種銅離子依賴(lài)的,新的細(xì)胞死亡方式,區(qū)別于現(xiàn)有的細(xì)胞死亡方式,包括細(xì)胞凋亡(apoptosis)、細(xì)胞焦亡(pyroptosis)和細(xì)胞壞死(necroptosis),銅死亡是一種金屬離子誘導(dǎo)的調(diào)節(jié)性細(xì)胞死亡,現(xiàn)有的調(diào)節(jié)機(jī)制是Cu2+通過(guò)與三羧酸循環(huán)的脂?；煞种苯酉嘟Y(jié)合,導(dǎo)致脂?；鞍拙奂丸F硫簇蛋白的丟失,進(jìn)而引發(fā)蛋白質(zhì)發(fā)生毒性應(yīng)激,從而發(fā)生依賴(lài)于銅離子調(diào)控的細(xì)胞死亡[14]。

FDX1編碼一種小的鐵硫蛋白,它通過(guò)鐵氧還蛋白還原酶將電子從NAPDH轉(zhuǎn)移到線粒體細(xì)胞色素P450,并參與類(lèi)固醇激素的合成、維生素D和膽汁酸的代謝[15-16]。Tsvetkov等[8]的研究中,首次發(fā)現(xiàn)FDX1是銅死亡的關(guān)鍵調(diào)控因子,它可將Cu2+還原為更具有毒性的Cu+,并且它同時(shí)還是蛋白質(zhì)脂酰化的上游調(diào)節(jié)因子。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),FDX1在多種腫瘤中表達(dá)異常,如在肺癌、肝癌、腎癌及結(jié)直腸癌等[17-19],但FDX1在乳腺癌中的表達(dá)尚未被闡明。盡管多數(shù)研究提示FDX1與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),但其表達(dá)與生存預(yù)后及調(diào)控機(jī)制仍不清楚,需要進(jìn)一步探索。本研究首次通過(guò)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行相關(guān)分析,發(fā)現(xiàn)FDX1在乳腺癌組織中低表達(dá),其表達(dá)與腫瘤中的ER、PR、HER2表達(dá)以及PAM50密切相關(guān),作為潛在的抑癌基因,其表達(dá)程度越高,相應(yīng)的乳腺癌患者生存水平越好,該研究結(jié)果提示FDX1表達(dá)有望成為預(yù)測(cè)乳腺癌臨床預(yù)后的指標(biāo)。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),FDX1在腫瘤微環(huán)境同樣發(fā)揮著重要作用[20],然而FDX1在乳腺癌中與腫瘤免疫浸潤(rùn)細(xì)胞的關(guān)系鮮有報(bào)道,因此本研究利用TIMER數(shù)據(jù)庫(kù)檢測(cè)FDX1表達(dá)與乳腺癌中免疫細(xì)胞浸潤(rùn)間的關(guān)系,結(jié)果顯示FDX1表達(dá)與多種免疫細(xì)胞如CD8+T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞浸潤(rùn)呈正相關(guān)。該結(jié)果顯示,在乳腺癌中FDX1與腫瘤細(xì)胞免疫浸潤(rùn)之間存在潛在的相關(guān)性,其具體調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

在本研究中,利用GSEA技術(shù)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)FDX1的表達(dá)與多種生物學(xué)功能密切相關(guān),其中包括較為重要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病阿爾茨海默病(Alzheirmer’s disease,AD)。腦是僅次于肝臟銅含量第2高的人體器官,在銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1與ATP7A轉(zhuǎn)運(yùn)下,銅離子可以穿過(guò)血腦屏障運(yùn)輸至不同腦區(qū)。在許多研究報(bào)道中,銅參與了神經(jīng)系統(tǒng)中髓鞘的形成,并調(diào)節(jié)突觸活動(dòng)、信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)以及神經(jīng)元壞死功能。銅離子穩(wěn)態(tài)失調(diào)可導(dǎo)致多種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生,包括阿爾茨海默病和帕金森病[20-23],其潛在的研究機(jī)制為血清中含量較高的游離銅離子過(guò)載引起β淀粉樣蛋白(amyloid-β,Aβ)沉積與Tau蛋白折疊異常[24]。Cu2+不僅可以促進(jìn)β淀粉樣蛋白無(wú)定形聚集體的形成,還可增強(qiáng)對(duì)該復(fù)合體神經(jīng)元的毒性,其毒性遠(yuǎn)高于β淀粉樣蛋白[25-26]。此外,多個(gè)研究證實(shí)銅代謝與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),與正常細(xì)胞相對(duì)比,癌細(xì)胞對(duì)銅離子的代謝能力更強(qiáng),對(duì)銅的需要更高[27-28]。乳腺癌患者表現(xiàn)出腫瘤組織銅金屬水平增高和全身銅分布的改變[29-30]。Wang等[31]研究發(fā)現(xiàn),阻斷Cu2+運(yùn)輸可引起細(xì)胞氧化應(yīng)激激活A(yù)MP活化蛋白激酶,從而導(dǎo)致脂肪生成降低,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。此外最近的研究表明,銅離子水平在新型冠狀病毒肺炎(corona virus disease 2019,COVID-19)患者預(yù)后中有一定參考價(jià)值。武漢COVID-19患者全血微量元素的檢測(cè)結(jié)果顯示病情較重患者血清銅水平普遍升高[31]。早期感染COVID-19患者,其血清中Cu2+水平增加,且Zn2+水平降低[32]。Hackler等[33]研究也發(fā)現(xiàn),COVID-19患者血清中銅離子和硒離子水平將有助于預(yù)測(cè)COVID-19患者預(yù)后指標(biāo)。

綜上所述,FDX1mRNA在乳腺癌中表達(dá)降低,其表達(dá)與乳腺癌多種臨床表現(xiàn)指征相關(guān),FDX1的表達(dá)也與乳腺癌的預(yù)后密切相關(guān)。此外,FDX1可以作為乳腺癌一種潛在的預(yù)后不良的腫瘤標(biāo)志物,并可能參與腫瘤免疫微環(huán)境的調(diào)控,可能成為調(diào)節(jié)免疫抑制的新靶點(diǎn),但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證與探索。