王霏，肖迎珂，宣旭嫻，張曉雯，劉菲，查紫仙，代夢(mèng)瞳，王西成，吳偉民，房經(jīng)貴，王晨

VvmiR164s-作用模塊鑒定及其在葡萄子房發(fā)育過(guò)程中響應(yīng)赤霉素的表達(dá)分析

王霏1，肖迎珂1，宣旭嫻1，張曉雯1，劉菲1，查紫仙1，代夢(mèng)瞳1，王西成2，吳偉民2，房經(jīng)貴1，王晨

1南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京 210095；2江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南京 210014

【目的】鑒定葡萄miR164s（VvmiR164a/b/c/d）及其靶基因，明確VvmiR164s及其靶基因應(yīng)答外源赤霉素在葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中的調(diào)控作用。【方法】以‘魏可’葡萄（L. Wink）為試材，利用miR-RACE、PCR、RLM-RACE與PPM-RACE、qRT-PCR及生物信息學(xué)等技術(shù)，分析VvmiR164s-模塊應(yīng)答外源赤霉素在葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中的時(shí)空表達(dá)特征及其潛在功能?！窘Y(jié)果】赤霉素在花前處理‘魏可’葡萄，可誘導(dǎo)其單性結(jié)實(shí)，導(dǎo)致葡萄的無(wú)核。克隆鑒定了VvmiR164a/b/c/d的精確序列，預(yù)測(cè)到其4條靶基因，結(jié)合匹配程度與前期數(shù)據(jù)，在此重點(diǎn)分析靶基因，并將其命名為?？寺¤b定靶基因，驗(yàn)證其裂解位點(diǎn)，并對(duì)其開(kāi)展蛋白進(jìn)化、染色體定位及結(jié)構(gòu)分析。裂解位點(diǎn)位于miRNA 5′端的第9位與第11位，裂解頻度為17/20與11/20，定位于葡萄的Chr14上，編碼363個(gè)氨基酸，含有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，且其定位于細(xì)胞核。VvNAC100蛋白與其他物種氨基酸序列保守性較高，功能相似，其中與辣椒、煙草等物種親緣關(guān)系較近。的啟動(dòng)子與其靶基因的啟動(dòng)子均包含多種激素作用元件，表明其可能通過(guò)響應(yīng)不同的激素來(lái)參與葡萄生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。RT-qPCR結(jié)果顯示，隨著葡萄子房的發(fā)育，VvmiR164b的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，其靶基因在子房發(fā)育前期呈上升的表達(dá)趨勢(shì)，具有一定的負(fù)相關(guān)，而VvmiR164a/c/d與表達(dá)模式相似，呈現(xiàn)一定的正相關(guān)；GA處理后，VvmiR164a/c/d在葡萄子房單性結(jié)實(shí)過(guò)程中的表達(dá)極顯著地上升，進(jìn)而也顯著抑制了在這一時(shí)期的表達(dá)，從而促進(jìn)了VvmiR164a/c/d-表達(dá)水平的負(fù)相關(guān)；但VvmiR164b在GA處理后表現(xiàn)出下降的趨勢(shì)，且其與的表達(dá)水平呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，表明GA處理增強(qiáng)了VvmiR164a/c/d對(duì)的負(fù)調(diào)控，減弱了VvmiR164b對(duì)的負(fù)調(diào)控作用。【結(jié)論】是VvmiR164 家族VvmiR164a/b/c/d的真實(shí)靶基因；在葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中，赤霉素誘導(dǎo)了VvmiR164a/c/d對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用，抑制了VvmiR164b對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族參與赤霉素誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)的主效因子。

葡萄；赤霉素；單性結(jié)實(shí)；VvmiR164s；

0 引言

【研究意義】葡萄（L.）是一種世界性廣泛種植的多年生果樹(shù)，也是我國(guó)栽培的重要經(jīng)濟(jì)果樹(shù)之一。無(wú)核是葡萄的一種重要優(yōu)良品質(zhì)性狀[1-2]，無(wú)核葡萄因其食用簡(jiǎn)便、風(fēng)味與口感佳，備受消費(fèi)者喜愛(ài)。因此，葡萄無(wú)核化是一個(gè)重要的發(fā)展趨勢(shì)和育種目標(biāo)[3]。赤霉素（GA）是誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)的關(guān)鍵激素[4]，花前GA處理誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)是生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的一種重要無(wú)核化技術(shù)，但其分子機(jī)制尚不甚清楚。因此，開(kāi)展葡萄無(wú)核分子機(jī)制的研究對(duì)無(wú)核葡萄育種具有重要意義。microRNA（miRNA）是一種長(zhǎng)度一般在20 bp左右的小分子RNA，其在植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及逆境脅迫中起著重要作用[5-6]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)miRNA參與GA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，介導(dǎo)植物花的發(fā)育，從而影響育性與單性結(jié)實(shí)[7-9]。其中，miR164家族在很多植物中都被發(fā)現(xiàn)與鑒定[10]，據(jù)報(bào)道，miR164在植物細(xì)胞分化、生長(zhǎng)、花的發(fā)育以及脅迫具有一定的作用[11-13]。NAC家族是存在于植物中的一個(gè)龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，并且其作為miR164的靶基因參與了植物發(fā)育中的多種生理過(guò)程，如花發(fā)育[14]、胚發(fā)育[15]、促進(jìn)側(cè)根形成[16]，果實(shí)成熟[17-18]以及衰老等過(guò)程。另有研究發(fā)現(xiàn)，NAC轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控主要通過(guò)結(jié)合NACRS或者NACBS來(lái)實(shí)現(xiàn)，且NAC也會(huì)受到GA的誘導(dǎo)并參與代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)從而影響果實(shí)的成熟，但具體的機(jī)制尚不清楚[19]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，葡萄miR164s（VvmiR164s）在花期能夠強(qiáng)烈響應(yīng)外源GA處理，且可能靶向NAC轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合GA在葡萄果實(shí)單性結(jié)實(shí)方面的顯著調(diào)節(jié)效果，推測(cè)VvmiR164s可能應(yīng)答GA參與葡萄單性結(jié)實(shí)的調(diào)控，但是相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制有待研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】鑒定‘魏可’葡萄中VvmiR164a/b/c/d的成熟體與前體基因的精確序列，驗(yàn)證其真實(shí)靶基因，通過(guò)生物信息學(xué)分析其進(jìn)化保守性和潛在功能，綜合分析其應(yīng)答GA在葡萄單性結(jié)實(shí)期的時(shí)空表達(dá)特征及其應(yīng)答GA的時(shí)空表達(dá)模式，為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)VvmiR164s-作用模塊在葡萄單性結(jié)實(shí)中的調(diào)控機(jī)制提供重要信息，也為從表觀遺傳學(xué)角度揭示GA調(diào)控?zé)o核果實(shí)的分子機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院葡萄實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行。

1.1 材料及試驗(yàn)處理

選用葡萄有核品種‘魏可’作為試材。在花前5 d隨機(jī)選取生長(zhǎng)勢(shì)基本一致的花序，用50 mg·L-1GA3浸蘸30 s，其對(duì)照則采用清水處理30 s。選取生長(zhǎng)情況較為一致的葡萄花蕾，于處理后的0、1、3、5、7和10 d分別采集后用液氮立即速凍，存于-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2 VvmiR164s成熟體序列比較分析及前體序列克隆與鑒定

在miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)搜索并下載葡萄miR164家族的成熟體與前體序列。在NCBI上根據(jù)前體的序列預(yù)測(cè)其基因序列，并設(shè)計(jì)用于進(jìn)行PCR擴(kuò)增的引物（表1）。產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收，送公司測(cè)序。VvmiR164s成熟體相關(guān)染色體的定位通過(guò)MapInsepet（http://mg2c.iask.in/ mg2c_v2.0/）預(yù)測(cè)，VvmiR164a/b/c/d的莖環(huán)結(jié)構(gòu)則利用RNA Folding Form進(jìn)行分析。

表1 VvmiR164s PCR 擴(kuò)增引物序列

1.3 VvmiR164s靶基因預(yù)測(cè)及其生物信息學(xué)分析

VvmiR164s靶基因利用在線網(wǎng)站PSRNA Target（https://www.zhaolab.org/psRNATarget/）預(yù)測(cè)VvmiR164s的靶基因，除maximum expectation設(shè)置為3.0外，其余運(yùn)行參數(shù)均為默認(rèn)值。利用在線軟件ExPASy（https://web.expasy.org/protparam/）分析的相關(guān)特性；在線軟件CDD分析靶基因的蛋白保守結(jié)構(gòu)；Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant-multi/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。MIR164s與的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)在MEGA 5.0中選擇鄰近法進(jìn)行構(gòu)建，并且運(yùn)用chiplot（https://www.chiplot.online/）對(duì)進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行優(yōu)化；作用元件motif分析與基因結(jié)構(gòu)構(gòu)建則分別利用在線軟件MEME（https://meme-suite.org/ meme/tools/meme）與GSDS（http://gsds.gao-lab.org/）進(jìn)行。

1.4 靶基因VvNAC100的亞細(xì)胞定位

構(gòu)建含有GFP報(bào)告基因的super1300雙元表達(dá)載體。在super1300載體上選擇I和I雙酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)帶有重組臂的擴(kuò)增引物。將經(jīng)過(guò)I和I雙酶切后的super1300載體片段與帶有重組臂的片段進(jìn)行重組，構(gòu)建驗(yàn)證正確的載體后，菌液大搖活化至OD600=1.0。離心后，使用對(duì)應(yīng)的緩沖液（10 mmol?L-1MgCl+10 mmol?L-1MES+0.15 mmol?L-1AS）重懸并調(diào)整OD600=0.2后靜置4 h。選擇本式煙草植株從煙草葉片背面注射，確保葉片被浸透。注射后的煙草植株置于25℃黑暗條件下3 d，以上海翊圣生物公司的DAPI染液為核染料，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行GFP信號(hào)與DAPI信號(hào)的觀察。

1.5 VvmiR164s靶基因裂解及其驗(yàn)證

利用筆者實(shí)驗(yàn)室前期改良的RLM-RACE和開(kāi)發(fā)的PPM-RACE技術(shù)[9]，鑒定VvmiR164s的靶基因，驗(yàn)證其剪切靶基因位點(diǎn)，并通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)化組織學(xué)染色對(duì)其進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.5.1 表達(dá)載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草瞬時(shí)轉(zhuǎn)化 在去除報(bào)告基因（GUS）的二元載體pBI121上連接VvmiR164a/c/d，將靶基因和不含裂解位點(diǎn)的靶片段與GUS報(bào)告基因融合，使用的引物見(jiàn)表1。在含有利福平（50 μg?mL-1）和卡那霉素（50 μg?mL-1）的LB固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)根癌農(nóng)桿菌GV3101的單菌落（包含重組質(zhì)粒）。離心收集菌體后，將細(xì)菌沉淀并重懸于懸浮緩沖液（10 mmol?L-1MES，10 mmol?L-1MgCl2，pH 5.6），并調(diào)整OD600=0.2后靜置4 h，加入100 μmol?L-1AS后進(jìn)行浸潤(rùn)，室溫靜置4 h。利用注射器針頭將細(xì)菌懸浮液注入6周齡煙草植物的葉片中，然后將滲透的幼苗移回25 ℃溫室，并在黑暗中保持3 d。

1.5.2 GUS組織化學(xué)染色 在煙草葉片上打孔，取小圓片進(jìn)行染色。X-Gluc（上海翊圣生物公司）的工作濃度為 2 mmol?L-1，使用適量的DMA將X-Gluc溶解后，加入GUS組織染色緩沖液（pH7.2的PBS 50 mmol?L-1+Triton X-100 0.1%+鐵氰化鉀2 mmol?L-1+亞鐵氰化鉀2 mmol?L-1+EDTA 10 mmol?L-1）（建議現(xiàn)配現(xiàn)用）。將葉圓片浸于配置好的染色液中，37 ℃培養(yǎng)箱中避光放置過(guò)夜后將葉圓片取出，洗凈表面染液后，放在75%乙醇溶液中脫色，水浴加熱可直至葉片脫色完全，將脫色完全的葉片貼標(biāo)簽拍照。

1.6 VvmiR164s與VvNAC100啟動(dòng)子順式作用元件分析

利用葡萄基因組CRIBI數(shù)據(jù)庫(kù)與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，確定VvmiR164a/b/c/d及的啟動(dòng)子序列，并用在線軟件PlantCARE進(jìn)行分析。

1.7 VvmiR164s及其靶基因在葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中的表達(dá)分析

采用CTAB法提取不同時(shí)期的葡萄花組織的RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，內(nèi)參基因?yàn)?，設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，對(duì)VvmiR164a/b/c/d及進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)，數(shù)據(jù)整理采用Excel，SPSS進(jìn)行差異顯著性分析，GraphPad Prism軟件繪制圖表。

2 結(jié)果

2.1 GA處理對(duì)‘魏可’葡萄單性結(jié)實(shí)的影響

為了闡明GA對(duì)‘魏可’葡萄單性結(jié)實(shí)的影響，比較GA處理（GA）與未處理對(duì)照（CK）葡萄的花序、果實(shí)及其縱切和種子的形態(tài)（圖1-A、B）。結(jié)果表明，相比于對(duì)照，GA處理的葡萄花序更長(zhǎng)和更松散，且具有深黃色花藥和大子房，同時(shí)呈現(xiàn)早花特性；從圖1-A與圖1-B可以看出，CK中胚珠可以發(fā)育為成熟種子，而GA組中胚珠逐漸退化、消失，導(dǎo)致單性結(jié)實(shí)，并且在種子區(qū)域有一條明顯的細(xì)線。此外，GA處理明顯減小橫徑，增加果?？v徑（圖1-C、D）。與CK植株相比，GA處理明顯抑制了種子發(fā)育，改變果實(shí)形狀，導(dǎo)致果實(shí)單性結(jié)實(shí)，形成無(wú)核果實(shí)。

2.2 VvmiR164s序列鑒定及其進(jìn)化分析

2.2.1 VvmiR164s序列鑒定與分析 以‘魏可’葡萄總DNA為模板，對(duì)VvmiR164s的前體基因進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳后獲得4條長(zhǎng)度不同的特異性條帶（圖2-A）。通過(guò)測(cè)序與序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，克隆鑒定的 VvmiR164a/b/c/d前體基因分別為561、498、543和435 bp。VvmiR164家族的成熟體序列比較分析顯示（圖2-B），其序列長(zhǎng)度均為21 bp，其中，VvmiR164a/c/d成熟體序列相同，它們與VvmiR164b成熟體存在兩個(gè)堿基不同（G-A與A-U）。VvmiR164 家族成員分別位于葡萄的Chr7、Chr9、Chr8和Chr14等4條染色體上，且它們的前體均可折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，表明VvmiR164s能夠在葡萄中穩(wěn)定存在（圖2-C）。

圖1 GA處理對(duì)‘魏可’葡萄單性結(jié)實(shí)的影響

2.2.2 VvmiR164s的成熟體進(jìn)化分析 利用MEGA5.0軟件對(duì)16種植物的miR164家族進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析與成熟體序列比對(duì)（圖3-A）。結(jié)果表明，不同物種中的miR164家族成員數(shù)量不同，如煙草、番茄與擬南芥中miR164家族成員僅有2個(gè)，但也有物種含有11個(gè)miR164家族成員，如大豆；除gma-miR164b/c/成熟體序列含有20個(gè)堿基外，其余物種miR164家族成員成熟體序列為21個(gè)堿基。通過(guò)進(jìn)化樹(shù)與和成熟體序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，VvmiR164a/d與番木瓜cpa-miR164d/e親緣關(guān)系最近，成熟體序列相同；VvmiR164b與甜瓜cme-miR164b親緣關(guān)系最近且成熟體序列相同；而VvmiR164c與水稻osa-miR164e和高粱sbi-miR164親緣關(guān)系近。雖然不同物種的miR164家族成員序列差異較小，但還是有個(gè)別物種間存在一定的差異。

2.3 VvmiR164s的靶基因克隆、鑒定及其序列特征分析

2.3.1 靶基因預(yù)測(cè)及匹配程度分析 利用在線軟件psRNATarget預(yù)測(cè)VvmiR164s的靶基因（表2）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，VvmiR164家族不同成員有相同的靶基因、。對(duì)VvmiR164a/b/c/d與其靶基因的匹配程度進(jìn)一步分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，VvmiR164a/c/d、VvmiR164b與預(yù)測(cè)靶基因的匹配程度存在一定的差異，其中，VvmiR164a/c/d與的匹配程度最高，錯(cuò)配率為0.5；與、的匹配程度相同，錯(cuò)配率為1.5，而的錯(cuò)配率最高，為1.8；相比之下，VvmiR164b與的匹配程度最高，錯(cuò)配率為1.0，與的錯(cuò)配率為1.8，與、的匹配程度相同，且其匹配程度低，錯(cuò)配率為2.5，表明VvmiR164家族成員與靶基因間的作用強(qiáng)度存在差異。通過(guò)對(duì)匹配程度與前期數(shù)據(jù)綜合分析，本文重點(diǎn)研究靶基因，將其命名為，并分析VvmiR164s-作用模塊鑒定及其應(yīng)答赤赤霉素調(diào)控葡萄單性結(jié)實(shí)的表達(dá)水平。

A：VvmiR164s的前體基因擴(kuò)增；B：VvmiR164家族的成熟體序列比較；C：VvmiR164a/b/c/d染色體定位及莖環(huán)結(jié)構(gòu)

表2 葡萄VvmiR164s及靶基因相關(guān)信息

ath：擬南芥Arabidopsis thaliana；cme：甜瓜Cucumis melo；cpa：番木瓜Carica papaya；csi：柑橘Citrus sinensis；fve：草莓Fragaria vesca；gma：大豆Glycine max；mdm：蘋(píng)果Malus domestica；nta：煙草Nicotiana tabacum；osa：水稻Oryzasativa；ppe：桃Prunus persica；ptc：毛果楊 Populus trichocarpa；sbi：高粱Sorghum bicolor；sly：番茄Solanum lycopersicum；mes：木薯Manihot esculenta；zma：玉米Zea mays；vvi：葡萄Vvtis vinifera

圖4 VvmiR164s與靶基因的匹配程度

2.3.2 靶基因克隆鑒定、亞細(xì)胞定位與序列分析 對(duì)CRIBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的同源序列一致，鑒定其真實(shí)序列（圖5-B）；對(duì)其染色體定位發(fā)現(xiàn)，其位于葡萄的Chr14染色體上（圖5-A）。利用Plant-mPLoc分析預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核，并進(jìn)一步通過(guò)農(nóng)桿菌注射煙草對(duì)亞細(xì)胞定位進(jìn)行驗(yàn)證（圖5-C）。以細(xì)胞核染料DAPI（4′,6-二氨基-2-苯吲哚）作為參照，在顯微鏡視野下，DAPI熒光的位置與GFP熒光的位置一致，驗(yàn)證了定位于細(xì)胞核。在線預(yù)測(cè)分析顯示，共編碼363個(gè)氨基酸（圖5-D），含有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，蛋白分子式C1812H2791N487O567S20，理論等電點(diǎn)5.70；含有20個(gè)氨基酸，其中，含量最高的為絲氨酸，占11.3%，色氨酸與半胱氨酸含量最低，僅占2.9%。VvNAC100是一種不穩(wěn)定性蛋白，其不穩(wěn)定指數(shù)為44.45；此外，VvNAC100還是親水性蛋白，其總平均輸水指數(shù)為-0.697。

A：VvNAC100的染色體定位；B：VvNAC100克??；C：VvNAC100的亞細(xì)胞定位；D：VvNAC100結(jié)構(gòu)域分析

2.3.3 蛋白進(jìn)化、motif元件及保守結(jié)構(gòu)域分析 通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)VvNAC100蛋白序列進(jìn)行BLAST，獲得了不同植物的相關(guān)序列。對(duì)不同物種進(jìn)行同源比較，并利用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖6-A）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，煙草、辣椒與VvNAC100蛋白親緣關(guān)系較近，而楊樹(shù)、番木瓜、甜櫻桃、梅花、蘋(píng)果等與其關(guān)系較遠(yuǎn)。通過(guò)對(duì)不同物種的基因結(jié)構(gòu)與motif作用元件分析發(fā)現(xiàn)，它們之間都存在著一定的差異性（圖6-A、B）。在基因結(jié)構(gòu)方面，的內(nèi)含子數(shù)量主要是2，外顯子數(shù)量是3，并且葡萄與梅花、蘋(píng)果、白梨、荷花、榴蓮與辣椒每個(gè)外顯子與內(nèi)含子的長(zhǎng)度和分布都相似；而在蛋白motif元件方面，VvNAC100和與大多數(shù)物種的NAC蛋白motif元件的數(shù)量和排列順序相同，表明VvNAC100蛋白與其他物種氨基酸序列保守性較高，功能相似。在線軟件CDD對(duì)結(jié)構(gòu)域分析表明，VvNAC100蛋白有1個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域（14—141位氨基酸），不同物種的NAC蛋白均有一個(gè)NAM結(jié)構(gòu)域，且它們大部分位于同一個(gè)位置，只有CsNAC、CpNAC與PtNAC位于不同的位置（圖6-C）。

圖6 NAC蛋白進(jìn)化分析（A）、保守基序分析（B）與作用元件分析（C）

2.4 VvmiR164s-VvNAC100裂解作用驗(yàn)證

利用5′-RLM-RACE和3′-PPM-RACE技術(shù)驗(yàn)證VvmiR164s的靶基因。結(jié)果表明（圖7-A），VvmiR164a/c/d均可裂解，裂解位點(diǎn)位于miRNA5′端的第9位與第11位，裂解頻度為17/20與11/20；而PPM-RACE的裂解位點(diǎn)與RLM-RACE相同，只是裂解頻度存在差異，其裂解頻度為5/22與1/22，低于RLM-RACE的結(jié)果。證實(shí)了VvmiR164s均可裂解靶基因，后者是前者的真實(shí)靶基因。

基于上述VvmiR164家族成員與靶基因表達(dá)的匹配分析結(jié)果，推測(cè)VvmiR164a/c/d可能是VvmiR164的主效成員，因此進(jìn)一步利用煙草瞬時(shí)表達(dá)共轉(zhuǎn)化體系對(duì)VvmiR164a/c/d-模塊的裂解作用開(kāi)展活體驗(yàn)證。將VvmiR164a/c/d連接到去除（GUS）報(bào)告基因的載體pBI121上，而靶基因和靶片段不含裂解位點(diǎn)p與GUS報(bào)告基因融合，載體構(gòu)建圖譜如圖7-B所示，同時(shí)以pBI121- GUS作為陽(yáng)性對(duì)照，而缺乏GUS的pBI121作為陰性對(duì)照（圖7-C），再把構(gòu)建的載體VvmiR164a/c/d分別與和p混合瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草葉片，通過(guò)組織化學(xué)染色證明靶裂解對(duì)轉(zhuǎn)化煙草葉片中GUS活性水平的影響（圖7-C）。結(jié)果顯示，煙草葉片中pBI121-GUS、pBI121-VvNAC100-GUS、pBI121-VvNAC100p-GUS均顯著變藍(lán)，而在pBI121- VvmiR164a-GUS、pBI121-VvmiR164c-GUS、pBI121- VvmiR164d-GUS轉(zhuǎn)化的葉片中未觀察到顏色的變化。此外，pBI121-VvNAC100-GUS與pBI121- VvmiR164a/ c/d-GUS共轉(zhuǎn)的葉片中藍(lán)色程度與pBI121-VvNAC100- GUS相比明顯減弱，而pBI121-VvNAC100p-GUS和pBI121-VvmiR164a/c/d-GUS共轉(zhuǎn)的葉片中藍(lán)色也有所減弱，但減弱程度不及pBI121-VvNAC100- GUS和pBI121-VvmiR164a/c/d-GUS共轉(zhuǎn)化的葉片。VvmiR164a/c/d與混合轉(zhuǎn)化煙草的GUS活性明顯下降，證實(shí)了VvmiR164a/c/d對(duì)的裂解作用。

2.5 VvmiR164s及其靶基因VvNAC100的潛在功能分析

2.5.1 VvMIR164s及的啟動(dòng)子作用元件 利用在線軟件Plant CARE對(duì)及的啟動(dòng)子作用元件分析發(fā)現(xiàn)（圖8-A），主要包括光響應(yīng)作用元件、激素響應(yīng)作用元件、脅迫響應(yīng)作用元件與組織特異性元件等。在靶基因的啟動(dòng)子作用元件中，光響應(yīng)作用元件數(shù)量最多，類別最多；而脅迫相關(guān)作用元件是厭氧誘導(dǎo)ARE作用元件；在激素相關(guān)響應(yīng)元件中，其僅含有赤霉素響應(yīng)元件（P-box），由此推測(cè)可能響應(yīng)赤霉素信號(hào)（圖8-B）。而對(duì)啟動(dòng)子作用元件分析發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子作用元件的數(shù)量和類型不同，在元件總體數(shù)量上，最多，而次之，與最少。在作用元件類型上，只有、含有組織特異性應(yīng)答元件，而含有3種作用元件。所有啟動(dòng)子中都含有激素響應(yīng)的作用元件，其應(yīng)答的激素類型主要有赤霉素（GA）、生長(zhǎng)素（IAA）、水楊酸（SA）、脫落酸（ABA）及茉莉酸甲酯（MeJA）（圖8-B），但是不同類型激素作用元件的組成和數(shù)量存在較大的差異。及不同類型的作用元件類型多樣性表明，它們不僅應(yīng)答光、脅迫等外界環(huán)境的信號(hào)，還可能通過(guò)響應(yīng)不同的激素信號(hào)參與調(diào)控葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育。

A：VvmiR164s對(duì)靶基因VvNAC100的裂解位點(diǎn)示意圖；B：載體構(gòu)建示意圖；C：煙草共轉(zhuǎn)化葉片GUS染色

圖8 VvmiR164s及VvNAC100的啟動(dòng)子順式作用元件

2.5.2 VvmiR164s-在葡萄子房發(fā)育過(guò)程中的模式分析 對(duì)VvmiR164家族不同成員的表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)（圖9），VvmiR164b在葡萄子房發(fā)育過(guò)程中基本不表達(dá)，VvmiR164a/c/d的表達(dá)量在子房發(fā)育過(guò)程中呈現(xiàn)倒“V”趨勢(shì)；同樣地，靶基因在子房發(fā)育過(guò)程中也呈現(xiàn)出相似的變化趨勢(shì)。

對(duì)比VvmiR164s和的表達(dá)模式（圖9），發(fā)現(xiàn)VvmiR164a/c/d與之間呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，其中，VvmiR164d的相關(guān)系數(shù)最高。此外，還發(fā)現(xiàn)在子房發(fā)育過(guò)程中，的表達(dá)量顯著高于VvmiR164s，并且VvmiR164a/c/d與均在花前2 d有高表達(dá)，表明它們可能參與坐果過(guò)程的調(diào)控。

圖9 VvmiR164s和VvNAC100在葡萄子房發(fā)育過(guò)程中的模式

2.5.3 VvmiR164s-在葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中應(yīng)答GA的表達(dá)模式分析 赤霉素處理可誘導(dǎo)葡萄的單性結(jié)實(shí)，為了解葡萄miR164家族及其靶基因在葡萄單性結(jié)實(shí)發(fā)育過(guò)程中應(yīng)答赤霉素的模式，分析它們?cè)诔嗝顾靥幚砗蟮谋磉_(dá)水平。結(jié)果表明（圖10-A），赤霉素處理促進(jìn)了VvmiR164家族的表達(dá)，與對(duì)照相比，其表達(dá)水平在花期上升，尤其VvmiR164a/ c/d的差異表達(dá)更為明顯，而赤霉素處理對(duì)VvmiR164b表達(dá)的影響不大。此外，赤霉素處理顯著抑制了靶基因的表達(dá)。

通過(guò)對(duì)比GA處理后VvmiR164家族及其靶基因的表達(dá)變化相關(guān)性發(fā)現(xiàn)（圖10-B），VvmiR164家族的表達(dá)在一定水平上與其靶基因的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)，但它們的相關(guān)系數(shù)存在差異，其中，VvmiR164c與的負(fù)相關(guān)性最強(qiáng)。進(jìn)一步對(duì)比赤霉素處理與對(duì)照樣品中VvmiR164s和靶基因表達(dá)水平的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)赤霉素的處理改變了VvmiR164s對(duì)靶基因的調(diào)控方式，其誘導(dǎo)了VvmiR164a/c/d對(duì)的負(fù)調(diào)控，抑制了VvmiR164b對(duì)的負(fù)調(diào)控（圖9、10），表明赤霉素處理增強(qiáng)了VvmiR164a/c/d對(duì)的負(fù)調(diào)控作用，VvmiR164a/c/d可能是VvmiR164家族中應(yīng)答赤霉素介導(dǎo)葡萄子房單性結(jié)實(shí)的主要調(diào)控因子。

3 討論

3.1 VvmiR164s及其真實(shí)靶基因參與葡萄單性結(jié)實(shí)

據(jù)報(bào)道，外源赤霉素對(duì)葡萄的作用十分典型，它能夠影響葡萄的生長(zhǎng)發(fā)育[20]，改變果穗的穗形[21]，誘導(dǎo)葡萄的無(wú)核化[22]與改善果實(shí)品質(zhì)[23]，但到目前為止，GA參與調(diào)控葡萄無(wú)核化的分子機(jī)制還不清晰。近些年，miRNA被鑒定為基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子[8,24]，其主要通過(guò)調(diào)節(jié)一系列與生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因來(lái)參與植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、器官的形成、脅迫環(huán)境下的應(yīng)答能力，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[25-26]。另有研究表明，miRNA還可能參與調(diào)控開(kāi)花時(shí)間與器官的發(fā)育形成，影響花器官的形成。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，外源赤霉素誘導(dǎo)miRNA參與葡萄花果發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控，如miR156[27]、miR159[28]、miR172[29]與miR397[30]。本研究發(fā)現(xiàn)外源GA可介導(dǎo)VvmiR164s-模塊參與葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程的調(diào)控。

圖10 VvmiR164s和VvNAC100在葡萄花發(fā)育過(guò)程中應(yīng)答赤霉素的模式

3.2 VvmiR164a/c/d-VvNAC100可能是GA誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)的主效模塊

前人首先在擬南芥中鑒定了miR164家族，之后通過(guò)高通量測(cè)序、同源比對(duì)、克隆測(cè)序等方法，陸續(xù)在不同植物中發(fā)現(xiàn)了眾多序列相似或相同的miR164s，它們共同構(gòu)成了miR164家族。本研究在葡萄中鑒定了VvmiR164的4個(gè)成員，其和多數(shù)物種的成員數(shù)量相同，但也與一些物種存在差異，如高粱miR164有5個(gè)成員，水稻、毛果楊等有6個(gè)成員，番茄有2個(gè)成員等，表明miR164家族成員在不同物種中存在差異。研究認(rèn)為，miR164可以通過(guò)其靶基因NAC起作用。目前植物中發(fā)現(xiàn)的NAC轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)目有8 133種，存在多個(gè)物種中[31]，其有多種生物學(xué)功能，如調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、參與脅迫應(yīng)答、調(diào)控植物體內(nèi)激素等。其中，作為NAC家族的成員，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中也起著重要作用；而在本研究中首次發(fā)現(xiàn)它被VvmiR164a/c/d介導(dǎo)，參與葡萄單性結(jié)實(shí)的調(diào)控，影響無(wú)核果實(shí)的形成。

同一個(gè)miRNA家族不同的成員具有不同的時(shí)空表達(dá)模式及不同的調(diào)控作用[32]。研究表明，在玉米中，miR164a-途徑參與調(diào)節(jié)花生種子生長(zhǎng)與膨大；番茄中SlmiR164通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控果實(shí)發(fā)育和成熟的時(shí)間[33]；擬南芥中miR164通過(guò)靶向參與介導(dǎo)生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑從而調(diào)控正常發(fā)育[34]；而水稻中miR164通過(guò)靶向調(diào)控其干旱脅迫[13]。本研究也在葡萄中鑒定了VvmiR164a/b/c/d均可通過(guò)裂解靶基因參與調(diào)控葡萄子房的發(fā)育。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，在對(duì)照樣品中VvmiR164a/c/d與靶基因表達(dá)呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，而在赤霉素誘導(dǎo)葡萄子房單性結(jié)實(shí)過(guò)程中，它們的表達(dá)水平呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，結(jié)合前面靶裂解作用驗(yàn)證結(jié)果，推測(cè)赤霉素通過(guò)誘導(dǎo)VvmiR164a/c/d對(duì)靶基因的裂解作用參與葡萄單性結(jié)實(shí)的調(diào)控；另一方面，赤霉素減弱了VvmiR164b對(duì)的負(fù)調(diào)控，表明VvmiR164家族可能主要通過(guò)VvmiR164a/c/d介導(dǎo)靶基因的裂解在赤霉素誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中發(fā)揮作用，VvmiR164a/c/d可能是主要應(yīng)答GA介導(dǎo)單性結(jié)實(shí)的主要響應(yīng)調(diào)控因子。

4 結(jié)論

本研究鑒定了VvmiR164a/b/c/d 4個(gè)成員前體基因的精確序列，預(yù)測(cè)并驗(yàn)證了靶基因，并通過(guò)RLM-RACE與PPM-RACE技術(shù)驗(yàn)證了它們均可通過(guò)裂解靶基因參與調(diào)控葡萄單性結(jié)實(shí)的過(guò)程。在葡萄單性結(jié)實(shí)過(guò)程中，赤霉素誘導(dǎo)了VvmiR164a/c/d對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用，抑制了VvmiR164b對(duì)靶基因的負(fù)調(diào)控作用，VvmiR164a/c/d是VvmiR164家族參與赤霉素誘導(dǎo)葡萄單性結(jié)實(shí)調(diào)控的主效因子。

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Identification of the VvmiR164s-Action Module and Analysis of Their Expressions Responsive to Exogenous GA During Grape Ovary Development

1School of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095;2Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014

【Objective】The aim of this study was to identify grapevine miR164s (VvmiR164a/b/c/d) and their target genes, and to elucidate the regulatory roles of VvmiR164s and their target genes during exogenous GA-induced grape parthenocarpic process.【Method】Using ‘Wink’ grapes (L. Wink) as the test material, miR-RACE, PCR, RLM-RACE and PPM-RACE, qRT-PCR and bioinformatics were used to analyze the spatio-temporal expression of VvmiR164s-module in response to exogenous GA and its potential functions during grape parthenocarpic process. 【Result】Gibberellin application on ‘Wink’ grapes before flowering induced parthenocarpy, leading to seedless berries. The precise sequence ofwas cloned and identified, and four of its target genes were predicted, including,,,. Combining the degree of match with the comprehensive analysis of the previous data, this work focused on the analysis of the target gene, which was named as. Thecleavage site was located at position 9 and position 11 of the 5′ end of miRNA, with a cleavage frequency of 17/20 and 11/20, respectively, and was localized on Chr14, encoding 363 amino acids and containing a NAM. The VvNAC100 protein is highly conserved in amino acid sequence and functionally similar to other species, among which it is more closely related to species such as pepper and tobacco. The promoters ofand its target geneboth contain multiple hormone-acting elements, suggesting that it might be involved in the regulation of grape growth and development by responding to mult-hormones. The RT-qPCR results showed that the expression level of VvmiR164b tended to decrease as the grape ovary developed, while its target geneshowed an increasing expression trend in the early stage of ovary development with a certain negative correlation. On the other hand, VvmiR164a/c/d showed a similar expression pattern withwith a certain positive correlation. However, after GA treatment, the expression of VvmiR164a/c/d was highly significantly increased during parthenocarpy in the grape ovary, which also significantly suppressed the expression ofduring this period, promoting a negative correlation between VvmiR164a/c/d-their expression levels. VvmiR164b showed a decreasing trend after GA treatment, and it’s the expression levels showed some positive correlation with those of, indicating that GA treatment promoted the negative regulation of VvmiR164a/c/d on, but repressed the negative regulation of VvmiR164b on.【Conclusion】was the true target gene of VvmiR164 family. During grape parthenocarpy, GA induced the negative regulation of VvmiR164a/c/d on the target geneand suppressed that of VvmiR164b on the target gene. VvmiR164a/c/d were the main effectors of the VvmiR164 family involved in modulation of GA-induced grape parthenocarpy.

grape; gibberellin; parthenocarpy; VvmiR164;

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.012

2022-07-04；

2022-12-27

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2018YFD1000106）、國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31972373）、江蘇省種業(yè)振興“揭榜掛帥”項(xiàng)目（JBGS（2021）086）、江蘇省高等學(xué)校優(yōu)勢(shì)學(xué)科項(xiàng)目（PAPD）

王霏，E-mail：2020104031@stu.njau.edu.cn。通信作者王晨，E-mail：wangchen@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯 趙伶俐）