王江浩，王立偉，張動敏，郭瑞，張全國，李興華，魏劍鋒，宋煒，王寶強，李榮改

基于分子標記技術玉米抗粗縮病種質(zhì)資源的篩選與應用

王江浩，王立偉，張動敏，郭瑞，張全國，李興華，魏劍鋒，宋煒，王寶強，李榮改

河北省農(nóng)林科學院糧油作物研究所/河北省作物遺傳育種實驗室，石家莊 050035

【目的】利用與3個玉米抗粗縮病位點、和緊密連鎖的分子標記篩選高抗玉米粗縮病自交系，并進行雜種優(yōu)勢類群分類和配合力分析，為玉米抗粗縮病品種的快速高效選育提供依據(jù)和方法?！痉椒ā繉⒖共∽越幌礙36與感病自交系S221雜交，從F2開始，采用單粒傳的方法構(gòu)建一個包括263個F9家系的重組自交系（recombinant inbred lines，RILs）群體；在不同種植環(huán)境下，對RILs進行抗病性鑒定，同時，采用與3個抗病位點、和緊密連鎖的分子標記5FR、6W53和IDP25K進行基因型分型，篩選出抗病且農(nóng)藝性狀優(yōu)良家系；利用Maize56K SNP芯片對包括優(yōu)良家系在內(nèi)的24份玉米自交系進行基因型分型，根據(jù)Roger’s算法計算優(yōu)良家系與其他骨干自交系之間的遺傳距離，并在構(gòu)建聚類圖的基礎上進行雜種優(yōu)勢類群劃分；同時利用優(yōu)良家系與不同類群的自交系測交配制雜交組合，在田間進行配合力測定和抗病性鑒定，篩選出抗病且雜種優(yōu)勢強的組合?！窘Y(jié)果】自交系K36在、和等3個抗性位點處均為抗病性純合基因型，自交系S221均為感病性純合基因型。RILs群體的263個家系在粗縮病抗性遺傳組成上分為21種基因型，3個位點均為抗性純合基因型家系的病情指數(shù)（DSI）最小（0.281），均為感病性純合基因型家系的DSI最大（0.776），這與抗、感性親本的DSI表現(xiàn)一致（0.257和0.623）；2個位點為感病性純合基因型時，1個位點為抗病性純合基因型的DSI由小到大的位點是（0.396）、（0.478）和（0.654），結(jié)果表明，抗病性最強，次之，最弱。篩選出的3個抗性位點純合基因型家系JR2136與其他23份自交系的遺傳距離變化范圍為0.2234—0.2895，平均值為0.2612，與之遺傳距離最小的自交系是C413，最大的是Chang7-2。根據(jù)聚類分析結(jié)果，將JR2136劃分在瑞德群，與屬于黃改群的自交系H92和H521配制出抗病強的優(yōu)勢組合，分別比鄭單958增產(chǎn)7.01%和7.80%，表明JR2136與屬于黃改群的自交系之間具有良好的配合力?！窘Y(jié)論】玉米自交系K36對粗縮病的抗性由、和等3個基因控制、呈數(shù)量遺傳特征且具有基因累加效應，具有3個抗性純合基因型的玉米品種抗病性最強。開發(fā)的與3個位點緊密連鎖的分子標記在抗病品種選育和抗性種質(zhì)資源篩選上具有實用價值，利用分子標記進行輔助選擇和基因聚合的方法選育抗病性強的優(yōu)勢組合應用于生產(chǎn)切實可行。

玉米粗縮??；抗病基因；分子標記輔助選擇；優(yōu)勢類群劃分；配合力

0 引言

【研究意義】玉米粗縮?。╩aize rough dwarf disease，MRDD）是一種由灰飛虱（）傳播的世界性病毒病，1949年，在意大利首次發(fā)現(xiàn)，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，導致MRDD的病毒有4種，均屬于呼腸孤病毒家族中的斐濟病毒屬（，）[1]。病毒種類因地區(qū)不同而異，在中國流行的主要是水稻黑條矮縮病毒（rice black streaked dwarf virus，RBSDV）[2-3]，近年來，在長江流域及山東濟寧地區(qū)也發(fā)現(xiàn)了感南方水稻黑條矮縮病毒（southern rice black streaked dwarf virus，SRBSDV）的玉米粗縮病株[4-5]。病毒由灰飛虱傳播，小麥、玉米、水稻及禾本科的雜草是灰飛虱的寄主植物，因此，由于灰飛虱在中國黃淮海地區(qū)小麥收獲前后遷飛，導致此時期播種的玉米粗縮病發(fā)生尤為嚴重，一般造成30%以上的產(chǎn)量損失，發(fā)病嚴重的地塊甚至絕收，嚴重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)[6-8]。近年來，MRDD有向北蔓延的趨勢，對中國東北玉米的生產(chǎn)構(gòu)成重大威脅[9-10]。因此，篩選抗病種質(zhì)、挖掘抗病基因及選育抗病品種對防治粗縮病的發(fā)生尤顯重要?！厩叭搜芯窟M展】近年來，國內(nèi)外加大了對玉米抗粗縮病的遺傳研究，盡管未發(fā)現(xiàn)免疫的材料，但也篩選出少量的抗性種質(zhì)，如X178、Qi319、黃早四等自交系，它們分別屬于衍生自美國雜交種P78599的PB亞群和國內(nèi)唐四平頭亞群[11-13]。遺傳分析表明，玉米對粗縮病的抗性多呈數(shù)量性狀特征，且包含主效基因[8, 14-17]。利用連鎖分析和全基因組關聯(lián)分析的方法對抗性基因（位點）進行挖掘，發(fā)現(xiàn)在玉米的每條染色體上均有與粗縮病抗性相關的位點，遺傳背景不同的材料具有不同的抗性位點[18]。目前，中國應用的抗源主要來自美國雜交種P78599，其抗病性由位于玉米第2和第8染色體上的2個抗性主效位點和控制，呈部分顯性遺傳，而呈隱性遺傳，并已開發(fā)出緊密連鎖的分子標記[14, 19-22]。【本研究切入點】鑒于目前中國生產(chǎn)上應用的抗源單一且遺傳效應低，不能滿足玉米抗粗縮病育種與生產(chǎn)的需求。因此，發(fā)掘新的抗性種質(zhì)、利用新的抗性基因成為玉米抗粗縮病育種的重要任務。前期通過對不同遺傳背景的種質(zhì)資源進行多年抗病性鑒定，發(fā)現(xiàn)了一個高抗玉米粗縮病的自交系K36，在第6染色體bin6.02區(qū)域存在一個抗性位點，命名為，其抗性遺傳與和不同，呈顯性遺傳模式[23]。【擬解決的關鍵問題】本研究利用與3個抗性位點、和緊密連鎖的分子標記對K36衍生的重組自交系群體（recombinant inbred lines，RILs）的遺傳組成進行分析，并對篩選出的抗性優(yōu)良家系進行雜種優(yōu)勢類群分類和配合力分析，為后期抗性基因分離和分子標記應用于抗病育種的輔助選擇奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 重組自交系 2014年利用多年抗性鑒定篩選出的高抗玉米粗縮病自交系K36為父本，與高感玉米粗縮病的自交系S221雜交獲得F1代。結(jié)合南繁加代，從F2代開始采用單粒傳的方法構(gòu)建了一個包括263個F9家系的重組自交系群體（RILs）。

1.1.2 24份玉米自交系的類群劃分 選取包括本單位20份已知系譜來源的骨干自交系和4份從RILs篩選出的攜帶的抗病家系共24份材料進行類群劃分（電子附表1）。

1.2 玉米粗縮病抗性的鑒定

2019年5月，將抗病親本K36、感病親本S221及其衍生的RILs，分別種植于山東濟寧、河南原陽和河北藁城3個粗縮病高發(fā)試驗點，進行田間抗病性鑒定。試驗點鄰近地塊均為小麥田，玉米出苗后恰逢灰飛虱遷飛高峰期。玉米苗期不使用任何殺蟲劑，水肥按常規(guī)管理措施進行。每個試驗點田間試驗采用隨機區(qū)組設計，設3次重復，每份材料單行區(qū)種植，行長5 m，行距0.6 m，每行播種18穴，雙粒點播，出苗后每穴定苗留1株。此外，在河北藁城試驗點增設一個6月下旬播種的重復試驗，以鑒別植株在非感病狀態(tài)的表型。在灌漿期調(diào)查每份材料的發(fā)病情況，按單株詳細記錄。參照苗洪芹等[24]提出的0—4級抗性等級標準進行病情嚴重程度調(diào)查。在分級調(diào)查的基礎上，計算每份材料的病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)將抗病性劃分為免疫、高抗（high resistance，HR）、抗（resistance，R）、感（susceptibility，S）和高感（high susceptibility，HS）5級。病情指數(shù)（disease severity index，DSI）=∑（發(fā)病級值×各級病株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高發(fā)病級值）。

1.3 DNA的提取

在玉米苗期，采用改良的CTAB法提取植株幼葉基因組DNA，去除RNA。利用瓊脂糖電泳和NanoDrop 2000型分光光度計分別檢測DNA的質(zhì)量和濃度。DNA樣品在瓊脂糖電泳中顯示條帶單一、完整無降解，分光光度計檢測DNA樣品A260/280介于1.8—2.0、A260/230介于1.8—2.0，無蛋白、RNA污染及鹽離子濃度低，提取的DNA樣品質(zhì)量滿足后續(xù)PCR擴增要求，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 分子標記檢測

SSR標記檢測：利用與連鎖及和的功能性SSR標記引物（電子附表2），對RILs群體進行基因型分型并篩選抗病家系。IDP25K和GMS分別由中國農(nóng)業(yè)大學徐明良教授團隊和中國農(nóng)業(yè)科學院作物研究所李新海教授團隊開發(fā)的位點功能基因特異性引物[19-20, 25]；IDP25K在B73（感病）、X178（抗病）品種的擴增產(chǎn)物分別為360和290 bp，并且已在玉米育種中用于分子標記輔助選擇[25]。5FR引物是由李新海教授團隊友情提供，與緊密連鎖標記的引物，D829-0和D1347是山東農(nóng)業(yè)大學劉保申教授團隊開發(fā)利用，與連鎖標記的引物[21]；利用K36、S221測序深度30×的重測序（北京百邁客生物科技有限公司）結(jié)果，與B73的參考基因組序列比對，采用SSRHunter軟件在定位區(qū)間開發(fā)在K36、S221兩者之間具有多態(tài)性的SSR標記，并根據(jù)定位區(qū)間連鎖遺傳圖譜（QTL IciMapping version 3.2）確定與抗性位點緊密連鎖的SSR標記，利用（https://primer3.ut.ee/）軟件設計引物，并在MaizeGDB（https://maizegdb.org/）網(wǎng)站進行比對，選擇單拷貝的SSR引物。6W53和6W19-95是精細定位區(qū)間內(nèi)連鎖標記的引物，其中，6W53為緊密連鎖標記的引物。在PCR擴增時，將DNA樣品濃度統(tǒng)一用ddH2O稀釋至30 ng·μL-1，在EasyCycler擴增儀上進行擴增。以50或100 bp DNA片段為分子量標準，PCR產(chǎn)物用1.5%—2.0%瓊脂糖凝膠法或10%變性聚丙烯酰胺凝膠分離并用銀染法顯示產(chǎn)物條帶，拍照讀帶型。

SNP標記檢測：利用中玉金標記（北京）生物技術股份有限公司開發(fā)的Maize56K SNP芯片對24份自交系進行SNP基因分型用于后續(xù)類群劃分。該芯片是針對國內(nèi)玉米育種而研發(fā)的芯片，基于玉米B73 RefGen_v4版本基因組設計，所有標記有物理位置信息，包含56 000個SNP位點，均勻覆蓋了玉米全基因組。樣品核酸準備、核酸擴增在Backman自動工作站上完成；核酸標記與芯片雜交、洗滌、掃描等步驟在GeneTitan上完成。最后，利用Affymetrix (Thermo Fisher) AxiomAnalysisSuite軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.5 雜交組合配制與鑒定

利用與、和緊密連鎖的標記，從RILs群體篩選出含有3個抗性位點的家系，于2020年冬季種植在海南三亞南繁基地，與不同類群的優(yōu)良自交系測交配制雜交組合。2021年5月，在石家莊藁城試驗站進行田間鑒定并篩選出抗粗縮病的優(yōu)勢組合，并在2022年參加小區(qū)對比試驗，小區(qū)為6行區(qū)，行長5 m，行距0.6 m，每行20株，對照品種為鄭單958，成熟后取中間2行考種測產(chǎn)。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用軟件Bio-R計算24份玉米自交系兩兩之間的MRD（modified Roger’s distance）遺傳距離，利用MEGA11軟件構(gòu)建UPGMA（unweighted pair-group method with arithmetic means）聚類圖，進行雜種優(yōu)勢群劃分；采用Excel 2010軟件和SPSS 25.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果

2.1 RILs群體的粗縮病抗性鑒定

參照抗性等級標準，對雙親及RILs群體在3個不同環(huán)境下的自然發(fā)病情況進行調(diào)查分析。因在河南原陽試點田間自然發(fā)病率極低，高感病親本S221未表現(xiàn)發(fā)病癥狀，因此，未對此試點進一步分析。263個RILs家系的平均病情指數(shù)結(jié)果顯示，河北藁城有235個家系對玉米粗縮病具有一定抗性，其中43個家系表現(xiàn)高抗，占比為16.3%；28個家系表現(xiàn)感病，其中僅2個家系表現(xiàn)高感，占比為0.8%。山東濟寧有133個株系表現(xiàn)具有一定抗性，其中28個家系表現(xiàn)高抗，占比為10.8%；130個家系表現(xiàn)感病，其中53個家系表現(xiàn)高感，占比為20.8%（表1）。自然抗病鑒定結(jié)果表明，不同的環(huán)境對病害的發(fā)生有一定的影響。

通過對山東、河北2個環(huán)境下粗縮病發(fā)病總體情況對比分析（表1和表2），發(fā)現(xiàn)雙親及RILs群體在2個試點的發(fā)病趨勢一致，平均病情指數(shù)均是感病親本S221＞RILs群體＞抗病親本K36，山東濟寧試點的病情指數(shù)高于河北藁城試點，表明山東濟寧地區(qū)比河北藁城地區(qū)粗縮病的發(fā)生更嚴重。

用SPSS 25.0軟件對2個環(huán)境下的雙親及RILs群體的病情指數(shù)進行正態(tài)分布檢驗，均符合正態(tài)分布（圖1），具有數(shù)量遺傳的特征，表明K36對粗縮病的抗性由多基因控制。

表1 263個RILs家系的抗病性鑒定結(jié)果

DSI：病情指數(shù)；HR：高抗；R：抗；S：感；HS：高感。下同

DSI:disease severity index; HR: High resistance; R: Resistantce; S: Susceptibility; HS: High susceptibility. The same as below

表2 2019年度山東、河北玉米粗縮病發(fā)病情況對比表

圖1 河北、山東2個環(huán)境下RILs群體的病情指數(shù)分布圖

2.2 雙親基因型檢測

利用與3個抗性位點、和緊密連鎖的分子標記，對S221、K36、JR2136、B73、X178、Ye478和Qi319等7份玉米自交系進行基因型分型（圖2）。結(jié)果顯示，在位點，特異性引物IDP25K與引物GMS檢測的結(jié)果相同，K36、JR2136與抗病對照品種X178同為抗病性純合基因型，而S221、Ye478和Qi319與感病對照品種B73同為感病性純合基因型（圖2-A—B）；在位點，引物5FR檢測到K36、JR2136、X178與抗病對照Qi319同為抗病性純合基因型，而S221和B73與感病對照品種Ye478一致，為感病性純合基因型（圖2-C）；在位點，引物6W53和6W19-95標記檢測到JR2136和X178與抗病對照K36一致，都是抗病性純合基因型，而B73、Qi319和Ye478與感病對照S221同為感病性純合基因型（圖2-D—E）。以上結(jié)果表明，在3個位點上，K36為抗病性純合基因型，而S221為感病性純合基因型。

A：IDP25K；B：MGS；C：5FR；D：6W53；E：6W19-95；1—8：100 bp DNA marker、S221、K36、JR2136、B73、X178、Ye478、Qi319。F：IDP25K；G：5FR；H：6W53；1—39：50 bp DNA marker、C1—C36、S221、K36

2.3 RILs群體基因型與抗病性分析

進一步利用與3個抗性位點緊密連鎖或功能性分子標記，對RILs群體的263個家系進行基因型分型，并進行田間抗病性鑒定（圖2-F—H，表3）。結(jié)果顯示，抗病親本K36和感病親本S221的DSI分別為0.257和0.623。RILs群體含有21種基因型，家系的基因型不同，其DSI也不同。

在RILs群體中，3個位點均為抗病性純合基因型家系的DSI（0.281）小于3個位點均為感病性純合基因型家系的DSI（0.776），這與抗、感性親本的DSI表現(xiàn)一致（0.257和0.623）。在2個位點為抗病性純合基因型、一個位點為感病性純合基因型情況下，位點為感病性純合型的DSI（0.454）小于位點為感病性純合型的DSI（0.622），表明當位點為感病基因型時，粗縮病的嚴重程度大于位點為感病基因型的品種。

2個位點為感病性純合基因型時，一個位點為抗病性純合基因型的DSI由小到大的位點是（0.396）、（0.478）、（0.654），結(jié)果表明，在抗病性上位點最強，次之，最弱；另外，在2個位點為感病性純合基因型時，第三個位點為抗病性純合基因型與雜合基因型家系的DSI比較結(jié)果顯示，位點抗病性純合型家系（0.478）明顯小于雜合型家系（0.799），位點抗病性純合型家系（0.396）略小于雜合型家系（0.475），而位點抗病性純合型家系（0.654）與雜合型家系（0.625）差異甚小。結(jié)果表明，位點呈隱性遺傳，雜合狀態(tài)下表現(xiàn)感病；、位點呈顯性遺傳，并且位點的抗病性強于位點。

2.4 24份玉米自交系聚類分析

根據(jù)RILs群體263個家系的基因型分型和抗病性鑒定結(jié)果，篩選出一個3個位點均為抗性純合基因型且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的家系JR2136。利用包括JR2136在內(nèi)的24份玉米自交系兩兩之間的遺傳距離構(gòu)建了UPGMA聚類圖（圖3）。24份自交系間遺傳距離的變化范圍為0.0958—0.3012，平均值為0.2463，遺傳距離最小的2個自交系是Ji603和Zheng58，遺傳距離最大的2個自交系是Chang7-2和PBA3。JR2136與其他23份自交系的遺傳距離變化范圍為0.2234— 0.2895，平均值為0.2612，與之遺傳距離最小的自交系是C413，而最大的自交系是Chang7-2。

R：抗病純合型；S：感病純合型；H：雜合型

R: disease resistant homozygote; S: disease susceptible homozygote; H: heterozygote

圖3 24份玉米自交系基于Roger’s遺傳距離構(gòu)建的UPGMA聚類圖

根據(jù)自交系間遺傳距離和已知一些自交系所屬的類群，將24份玉米自交系劃分為5個類群。第Ⅰ類群由PHRKB、SW3-2和PH4CV組成，三者為先鋒公司的骨干自交系或其改良系，是中國東北地區(qū)利用的重要玉米種質(zhì)，可以歸為先鋒公司的NSS群。第Ⅱ類群包括K36、C24-6、C413、S221、C1-12和Qi319共6個自交系，K36和Qi319是分別從美國雜交種分離出來的自交系，C24-6、C413和C1-12是從K36與S221雜交選系而來（電子附表1），S221是冀15-22的變異家系，而冀15-22是本單位利用從美國商業(yè)雜交種分離出的自交系8112、掖107雜交選育出的優(yōu)良自交系。這個類群具有P78599、87001等美國雜交種的血緣，可以歸為P種群。第Ⅲ類群包括JR2136、Ji42、JH29-1、WL134、PBA3和PH6WC共6個自交系，其中Ji42、JH29-1、WL134和PBA3是從美國先鋒雜交種中選出的母本自交系，其遺傳組成偏向瑞德血緣，可以歸為先鋒公司的SS群或瑞德群。JR2136是從K36與S221雜交選系而來，但與具有瑞德血緣的自交系聚在同一群，間接證實S221是冀15-22開放授粉接受了具有瑞德血緣材料的花粉而產(chǎn)生的后代。第Ⅳ類群由Ji603、Zheng58、Z503和Ye478組成，Zheng58是Ye478的變異株，而Ji603、Z503是本單位從以Zheng58為母本的雜交種鄭單958構(gòu)建的母本選系群中選育的自交系，因此，四者之間血緣關系比較近，被劃分在同一類群，可稱為改良瑞德群。第Ⅴ類群包括Chang7-2、Ji1877、Ji2888、Ji2894和H521共5個自交系，除Chang7-2以外的4份材料是從以Chang7-2為父本的雜交種鄭單958構(gòu)建的父本選系群中選育的自交系，且血緣關系更傾向Chang7-2，可稱為黃改群或唐四平頭群。從第Ⅳ、Ⅴ兩類群包含的自交系可知，它們是以雜交種鄭單958為基礎選系材料，按系譜法分離選育出的一系列Zheng58或Chang7-2改良系。

2.5 3個抗性位點純合基因型家系JR2136的利用

利用JR2136與不同類群的優(yōu)良自交系廣泛測配，通過2年的田間測試，篩選出2個高抗粗縮病的優(yōu)勢組合JR2136×H92和JR2136×H521。自交系H92是由Chang7-2與自交系9801雜交2次后再與WK798-2（偉科702父本）雜交而獲得的改良系，與H521同屬于黃改群（電子附表1和圖3），表明JR2136所在的瑞德群（SS）與黃改群的自交系之間有很好的配合力。在河北石家莊地區(qū)夏播種植，種植密度為67 500株/hm2時，這兩個組合和鄭單958的生育期為106—107 d，株高2.92—2.95 m，穗位1.28—1.31 m；植株均表現(xiàn)半緊湊型，葉色濃綠，葉片寬大上舉，穗上部葉片葉尖下披，在農(nóng)藝性狀上差異不顯著；但2個組合的產(chǎn)量性狀優(yōu)于對照鄭單958，表現(xiàn)在果穗長5 cm左右，行粒數(shù)多8—10粒，畝產(chǎn)分別比對照增產(chǎn)7.01%和7.80%（表4）。2022年，在山東濟寧粗縮病鑒定圃種植進行抗病鑒定，這兩個組合均表現(xiàn)高抗粗縮病、無病株出現(xiàn)，而對照鄭單958表現(xiàn)感粗縮病、病株率為15%。

3 討論

3.1 玉米粗縮病的鑒定

對山東濟寧、河北藁城2個環(huán)境下RILs群體的病情指數(shù)對比分析得知，不同環(huán)境對病害的發(fā)生有一定的影響。山東濟寧地區(qū)每年5月中旬種植玉米，苗期正值小麥收獲期，同時受氣流影響，5月末到6月初大量灰飛虱遷入，加之當?shù)卦蕉x量較大，粗縮病發(fā)病較為充分。在缺少室內(nèi)接種抗病鑒定的條件下，在山東濟寧對抗病遺傳材料和新品系進行田間自然鑒定結(jié)果更可靠。

表4 雜交組合重要農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀比較對照表

3.2 K36的遺傳組成和利用前景

利用與、和位點緊密連鎖或功能性分子標記，對K36衍生的RILs群體的抗病性遺傳組成的分析表明K36的抗性由多基因控制、且具有基因累加效應。3個位點之間，位點抗病性最強，位點次之，位點最弱，并且在抗性上呈顯性、為不完全顯性而為隱性，這與前人的研究結(jié)果一致[14, 22-23]，顯示在育種中利用價值更突出。最近已被克隆，是一個編碼囊泡運輸關鍵Rab GDP解離抑制因子基因[20]。研究發(fā)現(xiàn)，RBSDV侵染玉米后，病毒的P7-1蛋白與ZmGDI外顯子10和C端區(qū)域緊密結(jié)合以招募病毒。利用玉米ZmGDI的囊泡運輸功能幫助P7-1蛋白在胞內(nèi)移動，從而有利于病毒的復制和通過胞間連絲通道在細胞間移動，導致玉米植株感病。通過基因編輯對ZmGDI敲除，顯著提高了對玉米粗縮病的抗性，為培育抗粗縮病玉米品種提供了新的途徑[26]。也已被精細定位并對其候選基因的功能正進行解析[21-22]。利用以K36為抗性供體和S221為受體構(gòu)建的染色體片段代換系群體，對的精細定位也取得了很好進展，這對該基因的分離、功能分析和育種應用奠定了基礎。

自交系K36不僅高抗粗縮病，而且對玉米蚜、玉米螟等害蟲也具有良好的抗性[27]。利用K36衍生的RILs群體遺傳組成比較豐富，為今后解析抗病的遺傳關系，以及通過基因聚合改良優(yōu)良自交系的抗病性提供了優(yōu)異的遺傳材料。目前，中國玉米生產(chǎn)上應用的粗縮病抗源主要來自美國雜交種P78599，抗源單一且抗性強度不高，制約了中國的玉米抗粗縮病育種與生產(chǎn)。利用與3個抗性位點緊密連鎖的分子標記篩選具有抗性等位變異的優(yōu)異材料，豐富玉米抗粗縮病種質(zhì)資源，有望改善中國玉米抗性遺傳來源單一的狀況，減弱粗縮病潛在的威脅。

3.3 抗玉米粗縮病新系JR2136在育種中的應用

根據(jù)遺傳進化分類分析指導玉米新自交系的雜交配組，可以增加測配的目的性，提高自交系的利用效率。從遺傳進化分類樹分析結(jié)果可以看出，選育的3個抗性位點純合新系JR2136遺傳組成偏向瑞德血緣，與屬于黃改群的自交系H92、H521組配出了高抗粗縮病的優(yōu)勢組合，表明JR2136與黃改群的自交系之間具有較強的配合力，并且JR2136與劃分在黃改群的其他5個自交系間遺傳距離值（0.2728—0.2895）比與其他類群的數(shù)值大（0.2234—0.2795），但本研究所用自交系之間遺傳距離值與前人研究的自交系間的值相比偏低[28]，親緣關系較近和遺傳基礎狹窄，因此，今后加強JR2136與黃改群自交系廣泛配組篩選更強優(yōu)勢組合。

近年來，利用新育成的美國玉米雜交種和國內(nèi)玉米雜交種鄭單958為基礎選系材料，創(chuàng)建了“新外雜選×國內(nèi)雜選”的新雜優(yōu)模式[29]。本研究選育的2個優(yōu)勢組合JR2136×H92、JR2136×H521和本單位自主選育的2個國審品種冀玉3421（WL34×H521）和冀玉228（Ji42×Ji1877）均屬于此模式，將國外優(yōu)異新種質(zhì)的“多抗高產(chǎn)”與國內(nèi)黃改群種質(zhì)的“廣適穩(wěn)產(chǎn)”相結(jié)合，拓寬了遺傳物質(zhì)基礎。本研究選育的JR2136既遺傳了K36的抗粗縮病有利基因，又保留了S221的高配合力和優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，利用其組配的雜交組合JR2136×H92表現(xiàn)抗病力強、雜種優(yōu)勢明顯，期望在生產(chǎn)上發(fā)揮出較大的抗病和增產(chǎn)效應。

4 結(jié)論

源自玉米自交系K36的粗縮病抗性由多基因控制、呈數(shù)量遺傳特征且具有基因累加效應。具有、和等3個抗性純合基因型的玉米品種抗病性最強。開發(fā)的分子標記在抗病品種選育和新抗性種質(zhì)資源篩選上具有實用價值，利用分子標記輔助選擇和基因聚合的方法選育抗病性強的優(yōu)勢組合應用于生產(chǎn)切實可行。

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Molecular marker assisted identification and application of maize germplasms for maize rough dwarf disease resistance

WANG JiangHao, WANG LiWei, ZHANG DongMin, GUO Rui, ZHANG QuanGuo, LI XingHua, WEI JianFeng, SONG Wei, Wang BaoQiang, LI RongGai

Institute of Cereal and Oil Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences/Hebei Laboratory of Crop Genetics and Breeding, Shijiazhuang 050035

【Objective】Molecular markers tightly linked to three maize rough dwarf disease (MRDD) resistant loci were employed to identify resistant inbred lines, then the classification of heterotic groups and analysis of combining ability of these inbred lines were carried out, which proved a highly efficient way for maize MRDD resistance breeding.【Method】A recombinant inbred lines (RILs) population consisting of 263 F9lines was developed through single seed descent method from a segregating F2population by crossing a resistant inbred line K36 to a susceptible inbred line S221. The MRDD resistances of the RILs were identified in different growing environments. Meanwhile the RILs were genotyped by employing three pairs of molecular markers, 5FR, 6W53 and IDP25K which were closely linked to the three resistant loci,,and. The excellent lines with disease resistance and good agronomic traits were selected out after field evaluation. Totally 24 maize inbred lines including the elite lines were genotyped using Maize 56K SNP array, then the genetic distances between the selected lines and other elite inbred lines were calculated according to Roger's algorithm and cluster analysis was conducted to classify the heterotic groups. Meanwhile, hybrid combinations were generated and the combining abilities were tested to screen the combinations with strong disease resistance and heterosis.【Result】The inbred line K36 were homozygous resistant at the three loci,,andwhile S221 were homozygous susceptible. All the 263 RILs were genotyped into 21 patterns in terms of genetic composition of the three resistant loci. The lowest DSI (0.281) appeared when all the three loci were homozygous resistant while the highest DSI (0.776) appeared when the three loci were homozygous susceptible, which were consistent with the resistant and susceptible parents (0.257, 0.623). The order of DSI from low to high value for one homozygous resistant locus was(0.396),(0.478) and(0.654) when the other two loci were homozygous susceptible, which showed thatandperformed the strongest and the weakest resistance whilewas in the middle. The variation range of genetic distance between JR2136 with the genotype of three homozygous resistant loci and other 23 inbred lines was 0.2234-0.2895, with an average value of 0.2612. The inbred line with the smallest genetic distance was C413, and the largest was Chang7-2. According to the results of cluster analysis, JR2136 was classified into Reid group, hybrid combinations with inbred lines H92 and H521 belonging to Huanggai group performed strong disease resistance and heterosis.【Conclusion】The resistance of K36 to MRDD was controlled by three loci,,and, and it had quantitative genetic characteristics and gene additive effect. Maize varieties with homozygous resistant genotypes demonstrated the strongest disease resistance. The developed molecular markers closely linked with the three resistant loci have proved valuable tools in disease-resistant breeding and screening of resistant germplasm resources. It is feasible to use molecular markers for assisted selection and gene aggregation to select highly heterotic combinations with strong disease resistance.

maize rough dwarf disease; resistance gene; molecular marker-assisted selection (MAS); heterotic grouping; combining ability

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.10.002

2022-12-17；

2023-02-13

河北省重點研發(fā)計劃（22326317D）、河北省農(nóng)林科學院創(chuàng)新工程人才專項（C22R0302）、河北省重大專項（21326319D）、國家玉米產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-02-58）

王江浩，E-mail：wangjianghao@haafs.org。通信作者王寶強，E-mail：wbq662@126.com。通信作者李榮改，E-mail：lironggai@haafs.org

（責任編輯 李莉）