鄒信芳, 劉琴, 陸榮柱

(1. 江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 鎮(zhèn)江 212013; 2. 江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院婦科,江蘇 蘇州 215300)

宮頸癌是最常見的婦科腫瘤疾病之一[1],2020年全球約有60.4萬例新增病例,新增死亡病例34.2萬例[2],隨著宮頸癌防治“三階梯”(宮頸癌篩查、陰道鏡檢查、組織學(xué)診斷)的推行以及手術(shù)根治療法的開展[3],早期宮頸癌患者往往預(yù)后良好,但目前的治療方案無法進(jìn)一步改善晚期宮頸癌及復(fù)發(fā)性宮頸癌患者的預(yù)后及生存率。分子靶向治療通過干預(yù)特定分子來阻斷癌癥的生長、發(fā)展和轉(zhuǎn)移,已成為宮頸癌治療的熱點(diǎn)[4]。但是,腫瘤分子異質(zhì)性阻礙了特異性分子靶向藥物的療效。

核因子E2相關(guān)因子1(nuclear factor erythroid 2-related factor 1,Nrf1)是CNC-bZIP家族中的成員,其與核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)結(jié)構(gòu)相似,都能夠與小Maf蛋白結(jié)合形成異源二聚體,進(jìn)而與位于各種抗氧化基因啟動(dòng)子區(qū)域的抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element,ARE)結(jié)合,轉(zhuǎn)錄調(diào)控抗氧化反應(yīng)[5]。目前對Nrf2的研究較為成熟,其具有強(qiáng)抗氧化作用,在卵巢癌中具有明顯的抑癌作用[6]。另有研究指出,癌細(xì)胞在Nrf2持續(xù)激活的狀態(tài)下表現(xiàn)出更強(qiáng)的惡性生長能力,該現(xiàn)象稱為“Nrf2成癮狀態(tài)”[7]。這種狀態(tài)的代謝特征是Nrf2促使癌細(xì)胞中谷胱甘肽合成增加,導(dǎo)致癌細(xì)胞抗氧化活性增強(qiáng)[8]。相較于Nrf2,Nrf1功能更廣泛,可參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、脂肪代謝和糖代謝等[9]多種生物學(xué)過程。此外,Barid等[10]研究發(fā)現(xiàn),與正常小鼠相比,Nrf1特異性敲除的小鼠可誘發(fā)肝癌。在胰腺癌細(xì)胞中沉默Nrf1可導(dǎo)致癌細(xì)胞的增殖能力以及對化療藥物的耐藥性增強(qiáng)[11];Weyburne等[12]則發(fā)現(xiàn)激活Nrf1可誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞死亡。由此說明,Nrf1在腫瘤中具有一定的抑癌作用。但是,Nrf1在宮頸癌及其他惡性腫瘤中的表達(dá)及對癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響尚不清楚。

本研究通過TCGA數(shù)據(jù)庫檢索分析Nrf1在人宮頸癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá)水平,及其表達(dá)水平差異與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性;在此基礎(chǔ)上檢測人宮頸癌及癌旁組織中Nrf1mRNA的表達(dá)水平,進(jìn)而通過慢病毒轉(zhuǎn)染,構(gòu)建Nrf1過表達(dá)宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞株,進(jìn)一步驗(yàn)證過表達(dá)Nrf1對宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力的影響,初步探究Nrf1在宮頸癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源、主要試劑及儀器

11對宮頸癌及癌旁組織均來自2019年江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院婦科原發(fā)宮頸癌手術(shù)患者。癌旁組織系距離癌組織2 cm處的組織,所有組織部位均由專業(yè)病理科醫(yī)師選取。本研究符合江蘇大學(xué)附屬昆山醫(yī)院的倫理委員會(huì)相關(guān)規(guī)定,所有標(biāo)本提供者均簽署知情同意書。所有入組患者術(shù)前均未接受過放療、新輔助化療等可能影響癌灶性質(zhì)的治療。

宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院上海生命研究所。DMEM、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;胎牛血清購自美國Gibco公司;RNA提取試劑盒購自奕杉生物有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green染料購自康為世紀(jì)生物科技有限公司;所用引物均由銳博生物科技有限公司合成。Nrf1過表達(dá)慢病毒及空載體均購自上海吉?jiǎng)P基因有限公司。兔抗人Nrf1抗體購自華安生物科技有限公司;兔抗人GAPDH抗體購自美國Abcam公司;HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG購自碧云天生物技術(shù)公司;EdU試劑盒購自銳博生物科技有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司。

1.2 基于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫分析Nrf1 mRNA在人宮頸癌中的表達(dá)水平

在R軟件(3.3.3版本)中利用ggplot2軟件包整合TCGA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku/index.html)和GTEx數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project)樣本,分析Nrf1mRNA在人宮頸癌組織及正常宮頸組織中的表達(dá)水平。

利用OncoLnc網(wǎng)站(http://www.oncolnc.org/)中的宮頸癌數(shù)據(jù)集進(jìn)行在線生存分析,篩選條件設(shè)置:“Gene:Nrf1”;“Cancer:CESE”;“Lower Percentile:50,Upper Percentile:50”,分析宮頸癌患者Nrf1mRNA表達(dá)水平與患者生存的關(guān)系,繪制Kaplan-Meier生存曲線。

1.3 qRT-PCR檢測Nrf1 mRNA在人宮頸癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取11對宮頸癌及癌旁組織中的總RNA,用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照試劑盒說明書配置20 μL qRT-PCR反應(yīng)體系:8.4 μL DEPC水、10 μL 2×Ultra SYBR Mixture和上、下游引物各0.4 μL、0.8 μL cDNA加入8連管中。以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR引物序列如下:Nrf1上游引物,5′-AGGAACACGGAGTGACCCAA-3′;Nrf1下游引物,5′-TATGCTCGGTGTAAGTAGCCA-3′;GAPDH上游引物,5′-AGGTCGGTGTGAACGGATT-3′;GAPDH下游引物,5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。

qRT-PCR反應(yīng)步驟如下:95 ℃預(yù)變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火/延伸1 min,變性、退火/延伸共計(jì)40個(gè)循環(huán),后接熔解曲線階段:95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 15 s。每孔設(shè)3個(gè)復(fù)孔,完成反應(yīng)后得到各孔循環(huán)閾值(Ct)值,并采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對表達(dá)。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 所用慢病毒載體原件均帶有綠色熒光蛋白(green fluorescent protein,GFP)、嘌呤霉素抗性蛋白及flag標(biāo)簽蛋白。Nrf1過表達(dá)慢病毒及空載體的載體元件順序如下:GV492;Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin。

將處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞接種至6孔板內(nèi)(105個(gè)/孔),當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)40%～50%時(shí)進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染。每種細(xì)胞分為Nrf1過表達(dá)組和空載體對照組。慢病毒感染72 h后加入2 μg/mL嘌呤霉素篩選3 d。

1.4.2 qRT-PCR檢測Nrf1mRNA表達(dá) 實(shí)驗(yàn)方法步驟同“1.3”,檢測宮頸癌HeLa、SiHa細(xì)胞中Nrf1過表達(dá)組和空載體組Nrf1mRNA表達(dá)水平。

1.4.3 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測Nrf1蛋白表達(dá) 將處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(105個(gè)/孔),于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)90%以上。PBS清洗細(xì)胞2遍;加入裂解液后至冰上反應(yīng)30 min;收集細(xì)胞,4 ℃行12 000 r/min離心15 min;取上清液進(jìn)行BCA蛋白定量;取蛋白樣品100 ℃變性10 min;10% SDS-PAGE 80 V電泳90 min使蛋白按分子大小分離;300 mA轉(zhuǎn)膜90 min將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜;10%脫脂奶粉封閉1 h;加入一抗(Nrf1 1 ∶1 000稀釋,GAPDH 1 ∶5 000稀釋)于4 ℃孵育過夜;TBST洗膜3次,每次5 min;二抗(1 ∶2 000稀釋)室溫孵育1 h;TBST洗膜3次,每次5 min;抗體結(jié)合檢測采用化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng),Image J分析蛋白條帶灰度值。

1.4.4 EdU實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 將對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa細(xì)胞接種至24孔板內(nèi)(3×104個(gè)/孔),72 h后用EdU培養(yǎng)基(50 μmol/L)孵育細(xì)胞2 h;4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min;0.5% Triton X-100孵育10 min(增強(qiáng)細(xì)胞膜穩(wěn)定性);1×Apollo染色反應(yīng)液避光搖床孵育30 min;1×Hoechst33342避光孵育30 min;倒置熒光顯微鏡下拍攝圖片并計(jì)數(shù)熒光顯像細(xì)胞。細(xì)胞增殖率(%)=EdU標(biāo)記細(xì)胞數(shù)/Hoechst標(biāo)記細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4.5 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 將對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞接種于6孔板(103個(gè)/孔),37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 d;4%多聚甲醛固定20 min;PBS清洗2遍;2.5%結(jié)晶紫染液避光染色30 min;PBS充分清洗并晾干孔板;相位對比顯微鏡(日本Olympus公司)下隨機(jī)選取>50個(gè)細(xì)胞的克隆細(xì)胞團(tuán)并用Image J軟件計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.4.6 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 取24孔板,每孔加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL。放置Transwell小室于實(shí)驗(yàn)孔內(nèi),將處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞用空培養(yǎng)基重懸,加入上層Transwell小室內(nèi)(3×104個(gè)/孔),體積200 μL;37 ℃ 5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞24 h;取出24孔板,PBS清洗小室2遍;4%多聚甲醛固定20 min;2.5%結(jié)晶紫染液避光染色20 min;PBS充分清洗并晾干小室,鏡下觀察小室并拍照,采用Image J軟件分析細(xì)胞穿透小室的數(shù)目。

1.4.7 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移 將處于對數(shù)生長期的宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)(105個(gè)/孔),當(dāng)細(xì)胞融匯度達(dá)90%以上時(shí),用10 μL移液槍槍頭在孔內(nèi)中央劃直線;PBS清洗2遍洗去漂浮細(xì)胞;加入無血清空培養(yǎng)基,鏡下觀察劃痕大小并拍照(0 h);37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)細(xì)胞24 h后再次鏡下拍照。采用Image J軟件分析劃痕后0 h及24 h的劃痕愈合情況。劃痕愈合率(%)=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析Nrf1 mRNA在宮頸癌中的表達(dá)

基于數(shù)據(jù)庫TCGA_GTEx-STAD的樣本數(shù)據(jù)分析顯示,宮頸癌組織中Nrf1mRNA相對表達(dá)水平明顯低于正常宮頸組織(Z=3.86,P<0.01)。見圖1。

圖1 正常宮頸組織和宮頸癌組織中Nrf1 mRNA相對表達(dá)水平比較

2.2 通過OncoLnc網(wǎng)站分析Nrf1 mRNA與宮頸癌患者預(yù)后的相關(guān)性

將OncoLnc網(wǎng)站數(shù)據(jù)中所有宮頸癌組織樣本中Nrf1mRNA表達(dá)量較高的50%設(shè)為Nrf1高表達(dá)組(n=132),表達(dá)量較低的50%為Nrf1低表達(dá)組(n=132),繪制Kaplan-Meier曲線計(jì)算累積生存率。結(jié)果表明,隨著時(shí)間推移,Nrf1高表達(dá)組生存率明顯高于Nrf1低表達(dá)組(P<0.05),至隨訪結(jié)束時(shí)Nrf1低表達(dá)組累計(jì)生存率為28.6%,Nrf1高表達(dá)組累計(jì)生存率為59.6%。見圖2。

圖2 Nrf1 mRNA表達(dá)與宮頸癌患者預(yù)后的關(guān)系

2.3 人宮頸癌組織中Nrf1 mRNA表達(dá)水平

與癌旁組織相比,Nrf1mRNA在人宮頸癌組織中的表達(dá)水平顯著降低(t=2.92,P<0.05),與TCGA數(shù)據(jù)庫中分析的Nrf1mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)結(jié)果相一致(圖3)。

圖3 Nrf1 mRNA在宮頸癌及癌旁組織中的相對表達(dá)水平比較

2.4 外源性過表達(dá)Nrf1

2.4.1 qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率 結(jié)果顯示,在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中,與空載體對照組相比,Nrf1過表達(dá)組Nrf1mRNA相對表達(dá)水平明顯升高(t分別為2.88,2.73,P均<0.05)。見圖4。

圖4 qRT-PCR檢測各組宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中Nrf1 mRNA表達(dá)水平

2.4.2 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效率 結(jié)果顯示,在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中,與空載體對照組相比,Nrf1過表達(dá)組Nrf1蛋白表達(dá)水平明顯升高(t=2.81,P<0.05;t=4.58,P<0.01)。見圖5。

2.5 外源性過表達(dá)Nrf1抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖能力

2.5.1 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 與空載體對照組相比,宮頸癌HeLa細(xì)胞中Nrf1過表達(dá)組細(xì)胞增殖能力明顯降低(t=4.43,P<0.01)。見圖6。

2.5.2 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中,與空載體對照組相比,Nrf1過表達(dá)組克隆細(xì)胞團(tuán)個(gè)數(shù)明顯減少(t分別為4.92,5.70,P均<0.01)。見圖7。

圖5 蛋白質(zhì)免疫印跡檢測各組宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中Nrf1蛋白相對表達(dá)

A:HeLa細(xì)胞中Hoechst及EdU的標(biāo)記情況,比例尺=100 μm;B:EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖率

A:宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞中克隆細(xì)胞團(tuán)形成情況;B:克隆細(xì)胞團(tuán)個(gè)數(shù)

2.6 外源性過表達(dá)Nrf1顯著抑制宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞的遷移能力

2.6.1 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中,與空載體對照組相比,Nrf1過表達(dá)組細(xì)胞遷移數(shù)明顯減少(t分別為2.82,3.54,P均<0.05)。見圖8。

2.6.2 細(xì)胞劃痕愈合實(shí)驗(yàn) 在宮頸癌HeLa和SiHa細(xì)胞中,與空載體對照組相比,Nrf1過表達(dá)組細(xì)胞劃痕愈合率明顯降低(t分別為8.52,6.52,P均<0.05)。見圖9。

A:宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞遷移情況,比例尺=100 μm;B:細(xì)胞遷移數(shù)

A:宮頸癌HeLa細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);B:宮頸癌SiHa細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn);比例尺=200 μm

3 討論

以往研究發(fā)現(xiàn),Nrf1在肝癌組織中的表達(dá)顯著低于正常肝組織,并且Nrf1表達(dá)水平與肝癌的惡性程度呈負(fù)相關(guān)[13]。本研究經(jīng)TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示,宮頸癌組織中Nrf1mRNA相對表達(dá)水平明顯低于正常宮頸組織;此外,宮頸癌組織中Nrf1mRNA表達(dá)水平顯著低于癌旁組織,由此表明Nrf1在宮頸癌組織中呈低表達(dá),其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展過程中具有抑癌潛能。

既往有臨床研究指出,Nrf1可作為黑色素瘤[14]及彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤[15]患者的預(yù)后指標(biāo)。本研究基于OncoLnc網(wǎng)站數(shù)據(jù),構(gòu)建Kaplan-Meier生存曲線,發(fā)現(xiàn)Nrf1高表達(dá)組患者生存率明顯高于Nrf1低表達(dá)組,表明Nrf1表達(dá)水平與宮頸癌患者預(yù)后呈正相關(guān),由此提示Nrf1具有作為宮頸癌患者預(yù)后指標(biāo)的可能。當(dāng)然,這一結(jié)論仍然需要更多的臨床樣本數(shù)據(jù)來支持。Ren等[13]研究發(fā)現(xiàn),在肝癌HepG2細(xì)胞中特異性敲除Nrf1α(Nrf1的一種亞基)后,肝癌細(xì)胞增殖和遷移能力明顯增強(qiáng),這可能與其能夠通過Wnt/β-catenin通路介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化行為有關(guān)[16]。本研究采用宮頸腺癌HeLa細(xì)胞及宮頸鱗癌SiHa細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn),以研究過表達(dá)Nrf1對不同病理類型宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)功能的影響,結(jié)果顯示過表達(dá)Nrf1可抑制宮頸癌HeLa及SiHa細(xì)胞的增殖和遷移,進(jìn)一步證實(shí)了Nrf1的抑癌作用。

以往的研究多集中于Nrf1作為轉(zhuǎn)錄因子和藥物作用靶點(diǎn),缺乏關(guān)于Nrf1在疾病模型(包括腫瘤)中獨(dú)立生物學(xué)作用的研究。本研究探討了Nrf1在宮頸癌中的表達(dá)和對宮頸癌細(xì)胞的生物學(xué)作用。但是,本研究也存在不足之處,僅采用一種基因干預(yù)方式,即外源性過表達(dá)Nrf1,沒有進(jìn)一步通過shRNA敲低、CRISPR-CAS 9敲除等方式反向驗(yàn)證結(jié)果。并且在進(jìn)行EdU實(shí)驗(yàn)時(shí),因SiHa細(xì)胞染料附著能力欠佳,經(jīng)多次調(diào)整實(shí)驗(yàn)操作仍未得到理想染色狀態(tài),故僅采用了HeLa細(xì)胞,后續(xù)可采用其他多種宮頸癌細(xì)胞完善實(shí)驗(yàn)。此外,有待利用轉(zhuǎn)錄本測序、蛋白基因組學(xué)分析進(jìn)一步探討Nrf1在人宮頸癌細(xì)胞中的作用及分子機(jī)制,并在此基礎(chǔ)上結(jié)合體內(nèi)(動(dòng)物實(shí)驗(yàn))及體外(細(xì)胞系以及宮頸癌原代細(xì)胞株)系統(tǒng)探究Nrf1在人宮頸癌中的生物學(xué)功能。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)Nrf1在人宮頸癌組織中呈低表達(dá),外源性過表達(dá)Nrf1可抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖及遷移能力。