于欣,于霜,殷曉偉,楊玉柱（山東省單縣中心醫(yī)院,山東 菏澤 274300）

在臨床現代各項醫(yī)學技術逐步改進和推廣的背景下，無創(chuàng)循環(huán)腫瘤細胞（CTC）檢測方式的特異性和敏感性不斷提升[1]，并在臨床得到了更多的應用和更大的關注度。VONA學者在2000年時，首次通過健康血液細胞形態(tài)和大小，用顯微鏡方式觀察外周血狀況，進而檢出CTC[2]。此項技術能完整顯示出CTC各表型，并具備成本低、便捷、快速等優(yōu)勢，利于后續(xù)開展研究和實驗。當前主流技術中，免疫學技術在腫瘤標志廣譜檢測和特異性方面存在一定缺陷，會導致無法檢出異質性CTC，而ISET技術缺陷為部分較大單核細胞易混淆在CTC中[3]，而部分較小CTC則易經過濾而在檢測中出現漏檢的狀況。所以，現在暫無完美的檢測方式能完整捕捉到循環(huán)內CTC。在鑒定CTC方面，仍然主要采用免疫學技術，但此方式具備標志物特異性缺陷，逆轉錄-聚合酶鏈反應（PCR）技術具備較高靈敏度，但無法更為完整地觀察到細胞，而在形態(tài)學方法上則具備成本低、直觀、快速等優(yōu)勢[4]。本研究利用我國相關部門認可的CTCBIOPSY異常細胞分離染色系統(tǒng)，納入2020年2月-2021年12月單縣中心醫(yī)院收治的120例腫瘤患者，歸類常見腫瘤患者外周血檢出CTC狀況，并分析此類基于ISET技術和形態(tài)學評估標準的CTC方式應用到臨床腫瘤檢驗中所具備的價值。具體報告如下。

1 資料及方法

1.1一般資料 選取2020年2月-2021年12月單縣中心醫(yī)院收治的120例腫瘤患者作為研究對象，包含前列腺癌21例、乳腺癌25例、腸癌21例、肺癌53例；疾病TNM分期：I期24例、II期29例、III期30例、IV期37例；年齡34-78歲，平均為（58.65±1.02）歲；女性58例、男性62例。120例患者基本資料均滿足本研究各項條件和標準。各患者均接受首次手術后經病理檢查得到確診，排除以往接受相應醫(yī)療治療者、肝腎心肺功能性疾病者、精神/智力異常者。

1.2方法 采集各患者接受治療前肘靜脈血液4ml，將血液標本置入含乙二胺四乙酸抗凝（EDTA）的真空采血管中，防止采血中出現上皮細胞污染，用第2管血液標本進行CTC檢測。完成采血后，上下?lián)u動混勻采血管，充分混合抗凝劑和血液標本，采集血液標本后2h內則需進行檢測。

標本前處理：用醫(yī)用乙醇75% 1ml潤洗濾器、NaCl 0.9% 2ml溶液進行漂洗。將0.9% NaCl溶液3ml和固定劑（PFA 8%）200uL加入至15ml的離心管中，均勻混合后，再加入血液標本5ml，均勻混合后，在室內溫度下放置10min，再把標本加入到濾器內，用異常細胞分離染色儀（CTCBIOPSY，武漢友芝友公司提供）進行檢測。完成分離后，把濾器取出，加入甲醇300uL至濾器中，在室溫下固定1min后，把濾膜取出，再把濾膜貼在玻片中間位置，室溫下將其晾干后，實施染色處理，50℃環(huán)境下干燥30min，滴入甘油100%進行封片處理，再實施免疫組化鏡檢。

1.3指標判定 油鏡觀察，評估富集細胞形態(tài)[5-6]：①細胞核異型性，表現為分葉狀、結節(jié)狀，呈不規(guī)則形狀；②細胞長端（直徑）高出15um；③核質比高出0.8；④核著色不均勻且深染；⑤核膜增厚，表現為皺褶或凹陷，核膜形狀為鋸齒狀；⑥細胞核核仁巨大或染色質邊移，或出現異常核分裂狀況。評估標準：①CTC：滿足以上參數項目≥4個；②除⑥以外的項目，任意滿足3個或單一滿足評估參數⑥則可判定其為疑似CTC；③細胞成團數目≥3個，則可判定為CTC，但因互相重疊或連接，則無法準確評估為CTC細胞團，則將其判定為循環(huán)腫瘤微栓（CTM）[7]；④≥3個細胞成團，無法判定為CTC細胞團，則評估呈疑似CTM[8]；⑤無法評估來源為血液的細胞，但也不滿足以上各類型的細胞，則標記非血液細胞[9]。

本研究各患者標本檢驗均由醫(yī)院2名影像學科專業(yè)醫(yī)生負責，若產生意見分歧，則根據判定標準商討確定結果。

1.4統(tǒng)計學方法 用R軟件（3.5.0版本）分析數據，數據正態(tài)分布下用t檢驗（±s），偏態(tài)分布的連續(xù)變量用中位數表示，Mann Whitney U檢驗；χ2檢驗分類變量，秩轉換等級變量后，再實施Mann-Whiney U檢驗，若P＜0.05，則表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1外周血CTC形態(tài)學檢出狀況 此次120例腫瘤患者，共49例檢出CTC（40.83%），9例檢出CTM。通過進一步檢驗CD31、CD45抗體實施免疫組化驗證，顯示49例存在CTC形態(tài)的患者和9例CTM患者檢出的CD31、CD45均為陰性，滿足CTM、CTC免疫學特征。

2.2CTC陰性組和陽性組各參數比較 CTC陽性組CTC計數、年齡高于CTC陰性組，CTC陽性組T4分期率51.02%高于CTC陰性組T4分期率8.45%，T2分期率16.33%、T1分期率4.08%、T0分期率0%低于CTC陰性組T2分期率26.76%、T1分期率35.21%、T0分期率1.41%；CTC陽性組N3分期率32.65%、N2分期率20.41%高于CTC陰性組的8.45%、12.68%，組間數據有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 CTC陰性組和陽性組各參數比較

2.3各腫瘤疾病中CTC檢出狀況 CTC陽性組中前列腺癌率52.38%、肺癌率45.28%、腸癌率47.62%、乳腺癌率16%，見表2。

表2 各腫瘤疾病中CTC檢出狀況

3 討論

本研究采用ISET形態(tài)學方式共檢出120例腫瘤患者CTC陽性49例。為深入分析此形態(tài)學CTC方式的特異性，此次檢測CD31抗體免疫組化類似CTM或CTC的血管內皮細胞，證實CTC檢測假陽性率。在染色處理細胞核時采用蘇木素染色，細胞膜為棕黃色，即CD31或CD45為陽性，為血管內皮細胞或血液細胞[10]。而細胞核染色為蘇木素，細胞膜附近未出現棕黃色，則CD31或CD45為陰性，表現為CTM或CTC。利用免疫組化方式得到證實，經本形態(tài)學方式檢出CTM和CTC細胞，均滿足CD31、CD45的免疫學特征，則提示CTC形態(tài)方式和評估標準之間的特異性較高。

同時，由本研究表2 可知，C T C 陽性組中前列腺癌率52.38%、肺癌率45.28%、腸癌率47.62%、乳腺癌率16%，組間差異顯著（P＜0.05）。有報告稱，同一種腫瘤疾病，其檢測方式不同，CTC特異性、敏感性也存在差異。如針對肺癌患者，Cellsearch方式檢出CTC患者占比達19%-39%，而ISET方式則顯示36%-50%的患者存在CTC[11]。目前，暫未發(fā)現具有特異性的腫瘤細胞靶標，最具代表性的則為Cellsearch技術，但如果腫瘤細胞出現上皮間質轉化，則無法檢出CTC[12]。相比于免疫親和吸附技術，此次采用的方式能降低腫瘤細胞上皮間質轉化中表面標志物改變的影響，進而增強CTM和CTC檢出效率。

綜上所述，臨床通過測得CTC結果，能確保細胞完整性，對臨床快速評估各類型腫瘤CTC有積極意義，雖然檢測方式在敏感性方面無明顯優(yōu)勢，但其特異性較為理想。