王魯明，裴昊銘，徐永杰，陳業(yè)明

基于薄膜干燥-真空抽濾技術(shù)的核桃油體提取及破乳研究

王魯明1，裴昊銘1，徐永杰2，陳業(yè)明1※

（1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，無錫 214122； 2. 湖北省林業(yè)科學(xué)研究院，武漢 430075）

為降低實(shí)際生產(chǎn)中油體破乳的成本，實(shí)現(xiàn)油體的綠色、高值化綜合利用，該研究通過低速離心（2 862，15 min）將去衣核桃仁水提物分離成油體富集物、清液和沉淀組分，其中，油體富集物通過薄膜干燥和真空抽濾破乳制備核桃油和富含磷脂和膜蛋白的高值附加產(chǎn)品。在此過程中，系統(tǒng)考察了脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在3個離心組分中的分布和性質(zhì)，并研究了油體富集物在薄膜干燥過程中的破乳機(jī)制。結(jié)果表明：去衣核桃仁中的脂質(zhì)主要分布在油體富集物（占核桃仁脂質(zhì)總量的85.69%）中，而蛋白質(zhì)主要分布在清液（占核桃仁蛋白質(zhì)總量的23.58%，主要是清蛋白和球蛋白）和沉淀（占核桃仁蛋白質(zhì)總量的65.04%，主要是谷蛋白）中。油體富集物在薄膜干燥的過程中表現(xiàn)出向變稠-變軟-液態(tài)的形態(tài)轉(zhuǎn)變，液態(tài)物料通過真空抽濾分離為游離油（占核桃仁脂質(zhì)總量的81.78%）和磷脂-膜蛋白富集物。磷脂-膜蛋白富集物主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：中性脂占67.23%、蛋白質(zhì)占19.41%（其中，膜蛋白占蛋白成分的50%以上）、磷脂占6.61%和其他成分（如鞘氨醇）占6.75%。激光共聚焦顯微鏡和電導(dǎo)率分析表明，在薄膜干燥過程中，油體會隨著水分的蒸發(fā)逐漸聚合為更大的油體，直至破乳釋放出游離油，同時，蛋白質(zhì)-磷脂膜從油體上擠壓出來，而釋放的游離油導(dǎo)致電導(dǎo)率在干燥期間出現(xiàn)急劇下降。該研究為油體破乳提供了一種新的思路，對于核桃油的綜合高附加值利用具有重要的指導(dǎo)意義。

油脂；油體；破乳；磷脂；油體膜蛋白；薄膜干燥；真空抽濾

0 引 言

核桃（）作為中國分布最廣的經(jīng)濟(jì)樹種之一，其種植面積及產(chǎn)量均位居世界首位[1-2]。核桃中含有13%～24%的蛋白質(zhì)以及60%～70%的脂質(zhì)[3]，其脂質(zhì)中富含的多不飽和脂肪酸（亞油酸、-亞麻酸等）具有預(yù)防心腦血管疾病的作用[4]。在油料種子中，脂質(zhì)多儲存于油體之中[5]，油體內(nèi)芯主要由甘油三酯（94.21%～98.17%）組成，外殼則是由單層磷脂分子（0.57%～1.97%）及油體膜蛋白（0.59%～3.46%，主要是油體蛋白，其次是油體鈣蛋白和油體固醇蛋白）組成[6-7]。甘油三酯、蛋白質(zhì)和磷脂的含量與油體的大小密切相關(guān)[8]。油體粒徑越大，比表面積越小，蛋白質(zhì)和磷脂的含量就越低。除了這3種主要成分外，油體還含有一些其他的功能成分，如甾醇、維生素E等[9]。在水相中，油體可以抵抗各種物理（如高溫[10]）和化學(xué)（如尿素[11]、鹽[12]）壓力。因此，可以將油體從油料種子（如核桃[3]、大豆[13]、葵花籽[14]等）中提取出來，并應(yīng)用于制備食用油[13]、冰激凌[15]、蛋黃醬[16]等食品。

與目前的油料加工技術(shù)（機(jī)械壓榨和有機(jī)溶劑浸出）相比，水相萃取工藝（aqueous extraction processing, AEP）比較環(huán)保，更為重要的是，有利于油料蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的綜合利用[17-18]。在油體破乳方面，研究者主要研究了物理法（冷凍-解凍[19]）、化學(xué)法（表面活性劑[20]）和酶法（主要是蛋白酶[21]），并發(fā)現(xiàn)酶法破乳效率最高。在細(xì)胞壁水解酶的輔助下，花生油體的提取率可以達(dá)到94.35%，所得油體在木瓜蛋白酶和磷脂酶處理后，破乳率可達(dá)98.26%[22]。此外，還可以將商業(yè)蛋白酶直接加入油料水提物中，以水解油料水提物中的貯藏蛋白、清蛋白以及油體膜蛋白，再通過離心的方式將脂質(zhì)以游離油和乳狀物的形式分離，乳狀物則需要通過使用額外的商業(yè)蛋白酶或調(diào)酸性pH值來進(jìn)一步破乳，以提高油的產(chǎn)量。通過這種方法，可以使膨化米糠粉中約84.1%的脂質(zhì)以游離油的形式釋放[23]?？傮w而言，AEP的這些方法都需要使用蛋白酶、堿和酸，所形成的乳狀物還需進(jìn)一步處理才能形成食用油，成本高昂且工藝復(fù)雜，對實(shí)際生產(chǎn)不利。

薄膜干燥是一種高效且溫和的傳導(dǎo)式干燥方法，其蒸發(fā)所需的熱量由蒸汽或熱水提供，之后通過不銹鋼壁將熱量傳導(dǎo)至物料薄膜上，具有蒸發(fā)效率高，能耗低的優(yōu)點(diǎn)，適用于熱敏性、黏度高的食品物料，如乳清蛋白等[24-25]，但并未有人對其在油體破乳方面的應(yīng)用進(jìn)行研究。本文中對薄膜干燥的過程進(jìn)行模擬，并結(jié)合真空抽濾技術(shù)對核桃油體進(jìn)行了破乳研究。以此設(shè)計(jì)一種新的、簡單的、不使用任何酶和化學(xué)試劑的方法來對核桃油體進(jìn)行破乳。為了降低核桃衣中酚類成分對于油體和蛋白質(zhì)提取的不利影響[3]，本研究首先對核桃進(jìn)行去衣處理，再制取去衣核桃仁的水提物，用低速離心（2 862，15 min；工業(yè)生產(chǎn)中可實(shí)現(xiàn)）將其分離為輕相（油體富集物）、中間相（清液）和重相（沉淀）。對油體富集物進(jìn)行薄膜干燥處理，通過真空抽濾分離出核桃油和磷脂-膜蛋白富集物。在此過程中，系統(tǒng)考察脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在3個離心組分中的分布和性質(zhì)，并探討油體富集物在薄膜干燥中的變化機(jī)制，對于核桃的綜合高附加值利用具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃仁儲存在4 ℃下直至使用；食品級不銹鋼板（500 mm×400 mm×1.5 mm）從無錫當(dāng)?shù)厥袌鲑徺I；定性濾紙，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；質(zhì)譜（mass spectrum, MS）級甲醇、MS級乙腈和高效液相色譜（high performance liquid chromatography, HPLC）級異丙醇，美國Fisher Science公司；HPLC級甲酸、HPLC級甲酸銨、甲基叔丁基醚、尼羅紅、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate isomer, FITC）和二硫蘇糖醇（dithiothreitol, DTT），美國Sigma公司；其他常規(guī)試劑均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-60BE01B打漿機(jī)，美的電器有限公司；K9840半自動凱氏定氮儀，濟(jì)南海能儀器股份有限公司；TDZ5-WS離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；LKTC-82-T恒溫水浴鍋，金壇伊通電子有限公司；SHB-III 循環(huán)水式多用真空泵，上海葉拓科技有限公司；電導(dǎo)率儀DDS-307，上海天達(dá)儀器有限公司；Chemi Doc XRS+凝膠成像儀，美國Bio-Rad 公司；TCS-P8激光共聚焦顯微鏡，德國徠卡有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 油體的制備

油體的制備參考裴昊銘等[3]的方法。核桃仁（100 g）在4 ℃條件下浸泡12 h，手工去衣。將去衣核桃仁清洗后置于打漿機(jī)中，加去離子水至600 g，打漿1.5 min，用200目（篩孔尺寸：0.075 mm）濾布過濾后，將濾渣再次置于打漿機(jī)中，加入400 g去離子水，打漿1 min，過濾后合并兩次濾液。濾液用低速離心機(jī)（2 862，15 min）分離為輕相（油體富集物）、中間相（清液）和重相（沉淀）。

目前，核桃去衣已有專門的工業(yè)設(shè)備[26]，如山東諸城華邦機(jī)械有限公司生產(chǎn)的HBTP-2000型全自動去皮機(jī)；離心條件是模擬工業(yè)離心機(jī)的離心參數(shù)[27]。

1.3.2 薄膜干燥及真空抽濾

薄膜干燥和真空抽濾聯(lián)用技術(shù)破乳核桃油體工藝流程如圖1所示。

圖1 薄膜干燥和真空抽濾聯(lián)用技術(shù)破乳核桃油體工藝流程圖

薄膜干燥：本研究前期預(yù)試驗(yàn)考察了干燥時間、攤平次數(shù)以及油體富集物pH值對薄膜干燥的影響，結(jié)果表明：在水分基本上蒸發(fā)后，破乳率隨著加熱時間的延長而降低；隨著攤平次數(shù)的增加，其破乳率總體呈下降的趨勢，但其真空抽濾所需時間呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，在攤平3次時抽濾時間最少（抽濾時間較攤平1次時縮短30%），且其破乳率較高；隨著油體富集物pH值的降低，破乳率呈先下降后上升的趨勢，但均低于未調(diào)節(jié)pH值的油體（pH值約為7.0）；考慮到溫度高有利于油脂氧化，而溫度低會使水分蒸發(fā)慢，故選擇干燥溫度為50 ℃。

真空抽濾：本研究前期預(yù)試驗(yàn)考察了離心、真空抽濾以及真空抽濾時不同材質(zhì)的過濾紙/膜（食用油過濾紙：MHLE-270、MHLE-80，定性濾紙，有機(jī)過濾膜：聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯）的分離效果。結(jié)果表明：離心分離的效果低于真空抽濾，5種濾紙/膜中，定性濾紙的分離效果較好。

綜合以上預(yù)試驗(yàn)，制定以下操作流程：將食品級不銹鋼平板置于50 ℃水浴上，油體富集物涂抹在平板上蒸發(fā)水分，期間攤平2次，然后使用食品級塑料刮刀將其收集到燒杯中。為了確保每次涂抹厚度相同，在刮刀兩端安裝相同厚度的墊片，厚度1.0 mm。待水分蒸發(fā)一段時間后，通過真空抽濾（定性濾紙；真空度：0.095 MPa；16 min）將其分離為濾餅和核桃油。

濾餅中蛋白質(zhì)和磷脂的含量測定分別參考GB 5009.5-2016和GB/T 5537-2008；核桃油的酸價和過氧化值測定分別參考GB 5009.229-2016和GB 5009.227-2016。

1.3.3 不同干燥時間油體富集物的形態(tài)變化

將油體富集物涂抹在食品級不銹鋼平板上，每份樣品約3 g，分別蒸發(fā)0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100 s，之后將樣品用刮刀收集到燒杯中，并置于冰水浴中冷卻。冷卻后對樣品進(jìn)行觀察并拍照記錄。

1.3.4 不同干燥時間油體富集物的電導(dǎo)率

將油體富集物涂抹在上述平板上，每份樣品約3 g，分別蒸發(fā)0、15、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、120、150和180 s。將這些樣品分別放入燒杯中，立即置于冰水浴中冷卻。冷卻后將樣品放在室溫下平衡，然后用電導(dǎo)率儀測定電導(dǎo)率，并測定其含水率。

1.3.5 含水率的測定

參照GB 5009.3-2016中的直接干燥法測定樣品含水率。計(jì)算式[28]如式（1）所示。

式中為樣品含水率，%；為樣品干燥前質(zhì)量，g；1為干燥后的質(zhì)量，g。

1.3.6 激光共聚焦（confocal laser scanning microscopy, CLSM）顯微鏡檢測

取1 mL待測樣品加入40 μL 0.1 mg/mL尼羅紅和40 μL 0.1 mg/mL FITC，在黑暗中放置30 min后，分別在522和495 nm的激發(fā)波長下觀察樣品中的脂質(zhì)（以紅色表示）和蛋白質(zhì)（以綠色表示）。

1.3.7 基于Tricine-Tris緩沖液體系的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Tricine–sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis, Tricine-SDS-PAGE）測定

將油體富集物分散在去離子水（料液比=1∶9，質(zhì)量比）中，離心（5 000，30 min）得到油體富集物X（OB-X）。并取部分再次分散在去離子水（料液比=1∶9，質(zhì)量比）中，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為11。將懸浮液離心（5 000，30 min），得到油體富集物Y（OB-Y）。分別取3 g左右的油體富集物、油體富集物X和油體富集物Y置于平板上干燥。干燥樣品用冷丙酮脫脂兩次（料液比=1∶9 g/mL）。用凱氏定氮法測定清液、沉淀和上述脫脂樣品的蛋白質(zhì)含量。清液和沉淀用去離子水稀釋至2 mg/mL，稀釋后的樣品與0.5 mL的Tricine-SDS-PAGE樣品溶解液混合。對于上述油體脫脂樣品，直接加入1 mL的Tricine-SDS-PAGE樣品溶解液，使最終蛋白質(zhì)含量達(dá)到1 mg/mL。將DTT加入到這些樣品中，體積分?jǐn)?shù)為2%，在沸水浴中加熱5 min。然后根據(jù)朱金蒙[29]的方法進(jìn)行Tricine-SDS-PAGE測定。

1.3.8 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandem mass spectrometry, LC-MS/MS）測定濾餅脂質(zhì)組成

在濾餅（100 μg）加入適量內(nèi)標(biāo)脂，用200 μL去離子水和240 μL甲醇攪勻，然后加入800 μL甲基叔丁基醚，在60 W、4 ℃條件下超聲20 min，之后在室溫下放置30 min。將溶液離心（14 000，10 ℃，15 min），取上層溶液氮吹干燥。干燥后溶于200 μL 90%異丙醇/乙腈中，14 000離心15 min后制得樣品。

將樣品（10 μL）裝入CSH C18反相柱（2.1 mm× 100 mm i.d.，1.7 μm）。A相：乙腈-水（6/4，體積比）+0.1%甲酸+0.1 mmol/L甲酸銨；B相：乙腈-異丙醇（1/9，體積比）+0.1%甲酸+0.1 mmol/L甲酸銨。初始流動相為30% B相，流速為300 μL/min，保持2 min，然后在23 min內(nèi)線性增加到100% B相，然后在5%的B相中平衡10 min。

Q-Exactive質(zhì)譜儀分別在正模式和負(fù)模式下獲得質(zhì)譜圖。對所有測量的ESI參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化和預(yù)置：源溫度為300 ℃；毛細(xì)管溫度為350 ℃；離子噴霧電壓為3 000 V；離子透鏡電壓頻率S-lens RF level為50%；掃描范圍/200～1 800。使用軟件LipidSearch 4.1進(jìn)行脂質(zhì)鑒定。前體和碎片的質(zhì)量公差均設(shè)置為0.000 5%。

相對豐度計(jì)算：刪除甘油三酯、甘油二酯以及單甘酯的數(shù)據(jù)，其他脂質(zhì)（磷脂、鞘氨醇、溶血磷脂和神經(jīng)酰胺）的信號強(qiáng)度值進(jìn)行加和得到它們的總信號強(qiáng)度值，然后利用各脂質(zhì)的信號強(qiáng)度值除上述總信號強(qiáng)度值，得到各脂質(zhì)的相對豐度。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均重復(fù)3次，使用Excel 2016軟件進(jìn)行繪圖和計(jì)算，并用SPSS軟件進(jìn)行顯著性分析，不同字母表示差異顯著（<0.05）。用Image Lab軟件3.0分析Tricine-SDS-PAGE凝膠上的條帶強(qiáng)度和表觀分子量（kDa）。

2 結(jié)果與分析

2.1 油體富集物、清液和沉淀組分中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的分布

本研究所用核桃仁的含水率為3.11%±0.02%，蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13.96%±0.06%，脂質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為66.20%±0.27%。結(jié)果表明，帶衣核桃仁（對照）中蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的提取率分別為83.77%和93.46%。去衣后，核桃仁的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的提取率分別為92.05%和98.48%（圖2）?？煽闯觯瑤б潞颂胰实鞍踪|(zhì)和脂質(zhì)的提取率較低，原因是核桃衣中酚類物質(zhì)不利于蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的提取[30]。

去衣核桃仁的水提物經(jīng)低速離心（2 862，15 min）可分離為輕相（油體富集物）、中間相（清液）和重相（沉淀）組分。將去衣核桃仁的脂質(zhì)總量和蛋白質(zhì)總量分別定義為100%，則其中85.69%的脂質(zhì)和3.43%的蛋白質(zhì)分布在油體富集物中，10.83%的脂質(zhì)和23.58%的蛋白質(zhì)分布在清液中，1.96%的脂質(zhì)和65.04%的蛋白質(zhì)分布在沉淀中（圖2）。據(jù)報道，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白分別占核桃總蛋白的6.8%、17.6%、5.3%和70.1%[31]，即清蛋白和球蛋白占核桃總蛋白的24.4%。在本研究中，清液中核桃蛋白的占比為23.58%，沉淀中蛋白占比為65.04%。由此可以推測，清液中主要為核桃清蛋白和球蛋白，沉淀蛋白主要為谷蛋白。

圖2 去衣核桃仁水提物中脂質(zhì)和蛋白質(zhì)在濾渣和離心組分（油體富集物、清液和沉淀）中的分布

由上述數(shù)據(jù)可知，離心得到的3個組分中都存在一定量的脂質(zhì)，為了了解脂質(zhì)在其內(nèi)的存在形式，本研究通過激光共聚焦顯微鏡等對其進(jìn)行了研究。由圖3a和3b可知，在相同的放大倍數(shù)下，清液中的油體粒徑明顯小于油體富集物。在沉淀（圖3c）中，可觀察到方形的顆粒以及一些極小的圓點(diǎn)（箭頭指示）。為了確認(rèn)這些圓點(diǎn)是否為油體，利用9 mol/L尿素將沉淀完全分散，然后經(jīng)過高速離心（25 000，30 min）后，表層浮有白色乳狀物（圖3d），與油體富集物的狀態(tài)相似，從而證實(shí)了沉淀中的圓點(diǎn)是粒徑更小的油體。由此表明，3個離心組分中的脂質(zhì)是以油體的形式存在，且油體粒徑由大到小排序?yàn)椋河腕w富集物、清液、沉淀。綜上所述，核桃油體的粒徑分布范圍較大，這也與之前的研究相符[32]。根據(jù)Stokes公式，油體粒徑越大越容易離心上浮，而油體粒徑越小上浮需要的離心力也就越大。因此，低速離心分離出的3相中都存在脂質(zhì)。

圖3 油體富集物、清液和沉淀中油體的微觀結(jié)構(gòu)

2.2 油體富集物、清液及沉淀的蛋白質(zhì)組成

利用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳對油體富集物、清液及沉淀的蛋白質(zhì)組成進(jìn)行分析。根據(jù)圖4結(jié)果顯示，清液（泳道2）中主要含有表觀分子量為65.1、52.6、38.7、24.8、20.6、13.4和10 kDa的蛋白質(zhì)，而沉淀（泳道3）則以表觀分子量為30.8～33.3 kDa和19.7～21.7 kDa的蛋白質(zhì)為主，這些結(jié)果也表明了清液和沉淀中含有不同性質(zhì)的蛋白質(zhì)。結(jié)合YAN等的研究結(jié)果[33]，可以說明清液中主要是清蛋白和球蛋白，沉淀中主要是谷蛋白，進(jìn)而驗(yàn)證了上述結(jié)果。另外，可以看出油體富集物（泳道4）的蛋白質(zhì)組成中，除了油體膜蛋白（表觀分子量為37.6、24.6、13.9和12.8 kDa）[34]外，還含有一部分的非油體膜蛋白（主要是表觀分子量為51 kDa和10 kDa的蛋白質(zhì)）。為了考察油體與非油體膜蛋白之間相互作用的強(qiáng)度，對油體富集物進(jìn)行了去離子水（泳道5）和pH值為11（泳道6）洗滌，結(jié)果表明，去離子水不能去除非油體膜蛋白，而pH值為11洗滌可以有效地釋放非油體膜蛋白，油體膜蛋白仍保留在油體富集物Y中，這也與之前的研究相符[35]。

通過分析油體富集物中各蛋白條帶的強(qiáng)度，計(jì)算得到了油體膜蛋白各條帶占總蛋白條帶的比例。結(jié)果表明，油體蛋白占總條帶比例為42.62%，油體鈣蛋白的占比為9.44%，11--羥基類固醇脫氫酶5（即油體固醇蛋白）的占比則為1.32%，這也說明了油體膜蛋白貢獻(xiàn)了油體富集物中50%以上的蛋白質(zhì)，也表明濾餅中50%以上的蛋白質(zhì)為油體膜蛋白。

圖4 離心組分中蛋白質(zhì)組成的Tricine-SDS-PAGE電泳圖

2.3 油體富集物的薄膜干燥及真空抽濾分離

薄膜干燥的自組裝置是將食品級不銹鋼板放置于50 ℃水浴鍋上（圖5）。將10 g左右的油體富集物（含水率：20.68%）涂抹在平板（蒸發(fā)面積：325 mm×325 mm）上，可在12 min左右完成干燥（含水率<0.1%）。待完成干燥后，通過真空抽濾將油體富集物分離成濾餅和核桃油，其中，核桃油占比95.45%，濾餅占比4.55%。經(jīng)計(jì)算，每100 g核桃仁可得54.14 g核桃油（即得率為54.14%），占核桃仁脂質(zhì)總量的81.78%。前人研究數(shù)據(jù)表明[36]，乙酸乙酯萃取法的得率最高（68.32%），其次是氯仿/甲醇（64.38%）、石油醚（64.36%）、正己烷（59.78%）、丙酮（59.41%）、冷榨（42.72%）。結(jié)果表明，本研究的方法優(yōu)于冷榨法，接近丙酮和正己烷的得率。

試驗(yàn)測定結(jié)果顯示，分離所得核桃油的酸價（以KOH計(jì)）為（0.04±0.01）mg/g，過氧化值為（3.64±0.27）mmol/kg。趙慧博等[37]通過水酶法制備的核桃油酸價為0.19～0.34 mg/g，過氧化值為1.10～2.48 mmol/kg；王亞萍等[38]研究表明水酶法、溶劑浸提法和壓榨法制備的核桃油酸價為0.42～0.73 mg /g，過氧化值為1.18～3.15 mmol/kg。因此表明，該方法制備的核桃油的酸價遠(yuǎn)低于上述方法，而過氧化值略高。根據(jù)國標(biāo)GB/T 22327-2019對核桃油酸價的要求，酸價小于1.0 mg/g時，為一級核桃油。需要說明的是，GB/T 22327-2019未對核桃油的過氧化值提出要求。

為了考察核桃油和濾餅的貯藏穩(wěn)定性，將它們分別裝入燒杯中，并用保鮮膜密封，然后置于室溫（30～35 ℃）和光照（自然光）條件下儲存（無錫，7－9月）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，核桃油在存放了1個月后開始散發(fā)出哈敗氣味，而濾餅在儲存2個月后也沒有釋放出任何哈敗的氣味。在今后的研究中應(yīng)進(jìn)一步提高核桃油的貯藏穩(wěn)定性，如可通過真空輔助薄膜干燥來縮短蒸發(fā)時間和減少與氧氣的接觸，減少核桃油的氧化程度，以進(jìn)一步提高核桃油的貯藏穩(wěn)定性。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，建議首先利用真空薄膜干燥蒸發(fā)水分，如真空耙式干燥機(jī)，干燥完成后通過真空抽濾分離為核桃油和磷脂-膜蛋白富集物。

圖5 薄膜干燥和真空抽濾分離油體富集物中的核桃油和濾餅

2.4 油體富集物在連續(xù)水分蒸發(fā)中的變化

為了了解油體在蒸發(fā)過程中發(fā)生的變化，通過測定微觀結(jié)構(gòu)和分析電導(dǎo)率，對不同蒸發(fā)時間的油體富集物進(jìn)行了研究。由圖6a顯示，隨著水分的蒸發(fā)，油體富集物的狀態(tài)先是逐漸變得粘稠（0～40 s，含水率由20.68%降至10.67%），然后再變軟（50 s，含水率：8.83%），直到最后變?yōu)橐簯B(tài)（60～80 s，含水率由7.18%降至3.98%）；根據(jù)圖6b所示，在0～60 s時，油體富集物的水分快速蒸發(fā)且速度幾乎恒定，之后蒸發(fā)速度逐漸變緩，結(jié)合圖6c數(shù)據(jù)，當(dāng)含水率從10.13%（45 s）降至7.18%（60 s）時，電導(dǎo)率出現(xiàn)急劇下降并接近于0；利用激光共聚焦顯微鏡觀察初始油體富集物和60 s蒸發(fā)樣品發(fā)現(xiàn)，在初始油體富集物（圖6d）中，油體分散比較均勻，未發(fā)生聚集，而在60 s蒸發(fā)樣品（圖6e）中，可以觀察到游離油（用虛線橢圓形表示）和磷脂-膜蛋白富集物（白色箭頭所指）。因此，可以表明在蒸發(fā)時間45～60 s時電導(dǎo)率急劇下降是游離油在此過程中逐漸增加所導(dǎo)致。

上述結(jié)果表明，隨著水分的蒸發(fā)，油體之間的距離逐漸減小，當(dāng)含水率降至10%左右時，油體開始發(fā)生聚合，并隨著水分進(jìn)一步蒸發(fā)而破乳釋放出游離油。當(dāng)兩個或多個油體聚合成一個較大的油體時，其總表面積減小，導(dǎo)致一些油體膜蛋白和磷脂從油體表面被擠出，形成磷脂-膜蛋白富集物。

注：圖b、c中不同字母表示存在顯著性差異（P<0.05）

2.5 濾餅中的成分組成

對濾餅的基本組成物質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)濾餅主要成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為：67.23%的中性脂、19.41%的蛋白質(zhì)（其中，膜蛋白占蛋白成分的50%以上）、6.61%的磷脂和6.75%的其他成分（如鞘氨醇），是一種磷脂-膜蛋白富集物。之后，采用LC-MS/MS對濾餅中的脂質(zhì)組成進(jìn)行定性分析，并進(jìn)行了半定量（相對豐度）分析。通過LC-MS/MS在濾餅中鑒定出了甘油三酯、甘油二酯、單甘酯、磷脂、鞘氨醇、溶血磷脂和神經(jīng)酰胺。由表1結(jié)果可知，濾餅中的主要磷脂是卵磷脂，其次是鞘氨醇和磷脂酸。除上述脂類外，濾餅中還含有極少量的溶血磷脂和神經(jīng)酰胺。

以上結(jié)果表明，該濾餅可以作為一種功能性食品配料。一方面，它含有幾種功能成分（特別是磷脂和鞘氨醇）；另一方面，磷脂和油體膜蛋白在食品加工中可以起到很好的乳化劑作用[39]。

表1 濾餅中的磷脂組成(甘油三酯、甘油二酯和單甘酯除外)

注：a表示相對豐度計(jì)算：刪除甘油三酯、甘油二酯以及單甘酯的數(shù)據(jù)；相對豐度計(jì)算為每種脂質(zhì)的強(qiáng)度/磷脂、鞘氨醇、溶血磷脂和神經(jīng)酰胺的總強(qiáng)度。

Note: a is relative abundance was calculated as follows. The data for triacylglycerides, diacylglycerols, and monoglycerides were removed. The relative abundance was calculated as intensity of each lipid species/total intensity of phospholipids, sphingosines, lysophospholipids, and ceramides.

3 結(jié) 論

1）去衣核桃仁水提物經(jīng)低速離心（2 862，15 min）后，其中的脂質(zhì)主要分布在油體富集物（占核桃仁脂質(zhì)總量的85.69%）中，而蛋白質(zhì)主要分布在清液（占核桃仁蛋白質(zhì)總量的23.58%，主要是清蛋白和球蛋白）和沉淀（占核桃仁蛋白質(zhì)總量的65.04%，主要是谷蛋白）中；3個離心組分中的脂質(zhì)是以油體的形式存在，且油體粒徑由大到小排序?yàn)橛腕w富集物、清液、沉淀。

2）油體富集物在經(jīng)薄膜干燥和真空抽濾后，可分離成核桃油（占核桃仁脂質(zhì)總量的81.78%）和濾餅（中性脂占67.23%，蛋白質(zhì)占19.41%，磷脂占6.61%，其他組分占6.75%）；濾餅中的蛋白質(zhì)50%以上是油體膜蛋白，并且其具有磷脂和鞘氨醇等功能成分，可以作為一種新的功能性食品配料；

3）在薄膜干燥過程中，油體之間的距離隨著水分的蒸發(fā)而縮短，并逐漸發(fā)生聚合，從而導(dǎo)致聚合油體的比表面積減小，蛋白質(zhì)-磷脂膜從油體上擠壓出來；隨著進(jìn)一步的聚合，油體越來越大，直至破乳釋放出游離油。

本研究為核桃油體的破乳利用提供了一種綠色、簡便的方法，即薄膜干燥-真空抽濾聯(lián)用技術(shù)，與AEP的破乳方法相比，該方法無需使用蛋白酶、酸、堿和有機(jī)溶劑，成本低且工藝簡單。利用該方法破乳核桃油體可制取核桃油和濾餅（即磷脂-膜蛋白富集物）。但受限于實(shí)驗(yàn)室條件，所得到的核桃油過氧化值偏高，所以，在實(shí)際生產(chǎn)中，建議使用真空薄膜干燥蒸發(fā)水分，如真空耙式干燥機(jī)，干燥完成后通過真空抽濾分離核桃油和磷脂-膜蛋白富集物，以此來降低氧化。另外，該方法也可用于油體極性脂的提取和分析研究，可以極大減少有機(jī)溶劑的使用量。

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Extraction of walnut oil body and its demulsification based on thin film drying-vacuum filtration technology

WANG Luming1, PEI Haoming1, XU Yongjie2, CHEN Yeming1※

(1.214122,; 2.430075)

The oil body is one type of oil-storing organelle with a triglycerides matrix core that is coated by a protein-phospholipid membrane. Oil bodies can be isolated from oilseeds by aqueous extraction processing, and then directly processed into cream-like food ingredients. Nevertheless, the demulsification of the oil body is another meaningful direction for the utilization of the oil body. Much effort has been made into the demulsification of the oil body, such as the physical (e.g., freeze-thaw), chemical (e.g., surfactant), and enzymatic methods (mainly proteases). However, these methods have either a low demulsification rate or a high cost (adding chemicals or enzymes). In this study, a simple method without enzymes and chemicals was designed to demulsify the walnut oil body. Firstly, the water extract was prepared from the peeled walnut kernels, and the water extract was then separated into the light phase (oil body cream), intermediate phase (skim), and heavy phase (precipitate) by low-speed centrifugation (2 862, 15 min). Secondly, the oil body cream was demulsified by combined thin film drying and vacuum filtration technology, in order to obtain the walnut oil and the by-product rich in phospholipids and membrane proteins. The distribution of lipids and proteins in the three centrifuged fractions was systematically investigated to examine the mechanism of demulsification of the oil body during film drying. The results showed that the lipids in peeled walnut kernels were mainly distributed in the oil body cream (85.69% of total lipids in peeled walnut kernels), while the proteins were mainly distributed in the skim (23.58% of total proteins in peeled walnut kernels) and precipitate (65.04% of total proteins in peeled walnut kernels). The Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (Tricine-SDS-PAGE) protein profiles showed that the proteins in the skim were mainly composed of albumin and globulin, and those in precipitate were mainly composed of glutenin. The moisture content (20.68%) of the oil body cream gradually decreased during the thin film drying process. In the beginning, the oil body cream was gradually thickening, and then gradually was soft until it became a liquid. The liquid material could be separated into walnut oil (81.78% of the total lipids in walnut kernels) and filter cake (phospholipid-membrane protein concentrate) by vacuum filtration. The composition analysis showed that the phospholipid-membrane protein concentrate were composed of 67.23% of neutral lipids, 19.41% of proteins, 6.61% of phospholipids and 6.75% of other components (such as sphingosine). Tricine-SDS-PAGE results showed that more than 50% of the proteins in the phospholipid-membrane protein were oil body membrane proteins, indicating better emulsifying activity. The demulsification mechanism of the oil body was examined by confocal laser scanning microscope and conductivity analysis. The results showed that the distance among oil bodies was shortened with the evaporation of water, and gradually coalesced during the thin film drying, resulting in the reduction of the specific surface area of the coalesced oil body. As a result, the protein-phospholipid membrane was squeezed out from the coalesced oil body. With continuous coalescence, the coalesced oil droplets became larger and larger until release of free oil, and the free oil caused a sharp decrease in conductivity during the thin film drying and almost achieved to 0. This finding can provide a novel and simple strategy for the oil body demulsification, particularly with the guiding significance for the comprehensive value-added utilization of the walnut oil body.

oil and fats; oil body; demulsification; phospholipids; oleosins; thin film drying; vacuum filtration

10.11975/j.issn.1002-6819.202212126

TS222+.1; TS225.1

A

1002-6819(2023)-05-0241-08

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2022-12-17

2023-01-31

江蘇省林業(yè)科技創(chuàng)新與推廣項(xiàng)目（LYKJ-句容[2020]01）

王魯明，研究方向?yàn)橛椭c植物蛋白。Email：wlm_0504@163.com

陳業(yè)明，博士，副教授，研究方向?yàn)橛椭c植物蛋白。Email：chenyeming@jiangnan.edu.cn