王鑫，黨秀麗，趙龍，侯紅，耿健，敖翔

（1.沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東北耕地保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，土肥資源高效利用國(guó)家工程研究中心，沈陽(yáng) 110866；2.中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012）

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化、城市化進(jìn)程逐漸加快，土壤重金屬污染日益嚴(yán)重。2014 年環(huán)境保護(hù)部和國(guó)土資源部共同頒布的《全國(guó)土壤污染狀況調(diào)查公報(bào)》顯示全國(guó)土壤總超標(biāo)率為16.1%，污染類型以無(wú)機(jī)型為主，Cd 的點(diǎn)位超標(biāo)率高達(dá)7.0%，位居所調(diào)查的污染物之首[1]。近30年來(lái)，我國(guó)土壤中的Cd 含量急劇增加，年平均增加0.004 mg·kg-1，遠(yuǎn)高于歐洲地區(qū)[2]。與其他重金屬相比，Cd 具有高生物毒性、強(qiáng)生物富集性、非生物降解性等特性，被認(rèn)為是毒性最大的重金屬之一[3]，其主要通過(guò)施肥、采礦和基礎(chǔ)化工行業(yè)廢物排放等途徑進(jìn)入土壤[4]。根據(jù)數(shù)年前的統(tǒng)計(jì)，株洲市正遭受嚴(yán)重Cd 污染的農(nóng)田土壤面積超過(guò)160 km2，其中重度污染農(nóng)田土壤面積達(dá)34.41 km2，云南鉛尾礦區(qū)周邊土壤中Cd 的含量最高，已經(jīng)達(dá)到259.27 mg·kg-1，嚴(yán)重超出了國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 15618—2018），土壤Cd污染問(wèn)題已不容忽視[5-6]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外陸續(xù)開展了Cd 對(duì)土壤環(huán)境中生態(tài)受體的毒性閾值研究，Cd 對(duì)受試生物的劑量-效應(yīng)關(guān)系可能隨著土壤性質(zhì)、測(cè)試終點(diǎn)的改變而發(fā)生變化。Zhang 等[7]的研究表明赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）在Cd 污染土壤中暴露7 d 的LC50（半數(shù)致死濃度）為120.48 mg·kg-1，但相關(guān)閾值研究依舊是基于有限的土壤環(huán)境生態(tài)受體。不同理化性質(zhì)的土壤對(duì)Cd的吸附能力也不同，從而影響土壤中重金屬的毒性，影響土壤吸附Cd 的主要因素有土壤pH、陽(yáng)離子交換量、黏粒含量、有機(jī)質(zhì)含量等[8-9]。李彥祺[10]的研究表明不同土壤類型中Cd 對(duì)秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans）的毒性效應(yīng)不同，在廈門水稻土中EC50（半數(shù)效應(yīng)濃度）為96.9 mg·kg-1，而在泉州紅壤中EC50為28.7 mg·kg-1，但兩種土壤的理化性質(zhì)差異不大。因此，開展基于不同土壤、不同測(cè)試終點(diǎn)的毒理學(xué)評(píng)價(jià)，對(duì)于Cd污染土壤的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)具有重要意義。

目前Cd對(duì)土壤無(wú)脊椎動(dòng)物毒性的閾值研究主要集中在跳蟲和蚯蚓，國(guó)外利用線蟲開展生態(tài)毒理研究較早，但國(guó)內(nèi)對(duì)線蟲毒性的閾值研究較為不足[11]。秀麗隱桿線蟲由于其生命周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)、成本低和對(duì)毒物敏感等特點(diǎn)[12-13]，被認(rèn)為是評(píng)價(jià)污染物毒性的有力工具。秀麗隱桿線蟲的發(fā)育、壽命、繁殖、應(yīng)激反應(yīng)和氧化損傷等一系列致死和亞致死終點(diǎn)已被開發(fā)，并用于毒性評(píng)估和體內(nèi)毒理學(xué)研究[14]。有研究表明重金屬Pb、Cd 暴露可顯著抑制矮小擬麗突線蟲的繁殖、體長(zhǎng)生長(zhǎng)和產(chǎn)卵[15]。但相關(guān)研究多基于水體介質(zhì)中重金屬污染物對(duì)線蟲的毒性，基于土壤介質(zhì)中重金屬污染物的線蟲毒性試驗(yàn)相對(duì)缺乏[16]。因此，本研究以秀麗隱桿線蟲為受試生物，選用3 種理化性質(zhì)各異的土壤（江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土），研究外源Cd 對(duì)線蟲不同測(cè)試終點(diǎn)（生長(zhǎng)、繁殖和發(fā)育）的毒性效應(yīng)和閾值，并進(jìn)一步探究影響Cd 毒性的主要土壤理化性質(zhì)，為土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的修訂提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤分別采集于中國(guó)江西省鷹潭市、江蘇省蘇州市和吉林省長(zhǎng)春市的農(nóng)田表層（0～20 cm）。土壤于自然條件下風(fēng)干，剔除其中的石塊和動(dòng)植物殘?bào)w后過(guò)2 mm 篩備用。土壤pH采用酸度計(jì)（雷磁pHS-3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司）測(cè)定，土水比為1∶2.5（m∶V），土壤中黏粒占比通過(guò)比重計(jì)法測(cè)定[17]；土壤中有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀氧化法測(cè)定，田間持水量采用環(huán)刀法測(cè)定，碳酸鈣含量采用中和滴定法測(cè)定[18]；土壤陽(yáng)離子交換量采用氯化鋇緩沖液法測(cè)定[19]；土壤非晶質(zhì)錳氧化物、非晶質(zhì)鐵氧化物含量采用酸性草酸銨緩沖溶液浸提法測(cè)定[20]；晶質(zhì)鐵氧化物、晶質(zhì)錳氧化物含量采用0.3 mol·L-1C6H5Na3O7-1 mol·L-1NaHCO3-Na2S2O4（V∶V∶m=40∶5∶1）浸提法測(cè)定[21]。土壤經(jīng)過(guò)HCl-HNO3-HF-HClO4消解處理后，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測(cè)定土壤中Cd的背景濃度[22]。供試土壤理化性質(zhì)見表1。

表1 供試土壤理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of tested soils

1.2 供試生物

大腸桿菌OP50 株（尿嘧啶缺陷型-線蟲食物來(lái)源）和野生型秀麗隱桿線蟲N2 株均由福建上源生物科技有限公司提供。將線蟲投放在生長(zhǎng)瓊脂培養(yǎng)基（Nematode growth-medium，NGM）上，置于恒溫氣候箱中在（20±1）℃條件下培養(yǎng)。

NGM 制備方法為：稱取0.25 g 酪蛋白胨（BR 生化試劑）、1.7 g瓊脂粉（BR）和0.3 g NaCl（GR優(yōu)級(jí)純）于90 mL 無(wú)菌水，121 ℃條件下高壓滅菌，待冷卻到55 ℃后加入無(wú)菌的0.1 mL 1 mol·L-1MgSO4、0.1 mL 1 mol·L-1CaCl2、0.25 mL 1 mol·L-1KH2PO4[用KOH 調(diào)整pH至（6.0±0.2）]和0.1 mL 5 g·L-1膽固醇乙醇溶液，用無(wú)菌水定容至100 mL 并充分混勻后，倒入培養(yǎng)皿冷卻備用。

大腸桿菌菌液制備方法為：通過(guò)在Luria-Bertani（LB）瓊脂培養(yǎng)板上劃線培養(yǎng)大腸桿菌OP50 后，挑取單克隆大腸桿菌菌落至含有100 mL LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，于恒溫振蕩培養(yǎng)箱中37 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)14 h，然后使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定菌液光密度，至600 nm 波長(zhǎng)下吸光值（OD600）為1.1～1.2，用于線蟲的培養(yǎng)、NGM板的涂布和后續(xù)線蟲毒性試驗(yàn)。

LB 固體培養(yǎng)基：稱取1.0 g 胰蛋白胨（BR）、0.5 g酵母抽提物（BR）、1.5 g 瓊脂（BR）和1.0 g 氯化鈉（GR）放入錐形瓶中，加超純水至100 mL，高壓滅菌，然后將其倒入滅菌后的培養(yǎng)皿中自然冷卻至室溫，得到LB固體培養(yǎng)基。

LB液體培養(yǎng)基：稱取0.5 g胰蛋白胨（BR）、0.5 g酵母抽提物（BR）和0.5 g 氯化鈉（GR）放入錐形瓶中，加超純水至100 mL，高壓滅菌后得到LB液體培養(yǎng)基。

Ludox 懸浮液：50 mL Ludox TM-50 懸浮液（購(gòu)于上海宇燦生物科技有限公司）加超純水至150 mL，配制成Ludox懸浮液，用于膠體懸浮法分離土壤中線蟲。

K-medium 緩沖液：稱取3.1 g 氯化鈉（GR）、2.4 g氯化鉀（GR）于錐形瓶中，加入1 000 mL去離子水，在

121 ℃高壓滅菌20 min，室溫保存。

為減少線蟲個(gè)體差異可能對(duì)試驗(yàn)的影響，試驗(yàn)前需要進(jìn)行線蟲的同步化培養(yǎng)。待NGM 表面分布大量產(chǎn)卵的成蟲時(shí)，將成蟲以K-medium 緩沖液沖洗至離心管并洗去其體表殘余的大腸桿菌，向離心管內(nèi)加入堿性裂解液（5% NaClO 和2.5 mol·L-1NaOH）以裂解線蟲身體獲得蟲卵。用緩沖液多次沖洗蟲卵表面多余的裂解液后，將蟲卵置于含有3 mL 緩沖液的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)16 h后即可獲得年齡同步的第一階段線蟲幼蟲。

1.3 土壤中Cd的添加

試驗(yàn)選用的試劑為氯化鎘（CdCl2·2.5H2O，分析純?cè)噭?。在外源Cd添加前，對(duì)供試土壤進(jìn)行紫外滅菌處理，消除土壤本身存在的線蟲或蟲卵。通過(guò)向土壤中噴施氯化鎘母液向土壤中添加外源Cd，每個(gè)土壤設(shè)置6 個(gè)Cd 含量，分別為0（對(duì)照）、5、10、100、150、300 mg·kg-1，每個(gè)濃度設(shè)置4 個(gè)平行，對(duì)照組僅添加去離子水，將土壤充分?jǐn)嚢柚辆鶆?。將制備完畢的Cd 污染土壤置于燒杯中，期間通過(guò)稱重法補(bǔ)充去離子水以維持土壤含水量為田間持水量的55%～60%。土壤樣品老化7 d 后進(jìn)行線蟲毒性試驗(yàn)和總Cd、有效態(tài)Cd濃度的測(cè)定。

1.4 土壤中線蟲的毒性試驗(yàn)

毒性試驗(yàn)根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO10872指南[23]和Sácca等[24]的方法進(jìn)行。稱取0.5 g老化7 d的風(fēng)干土壤至孔板中，加入100 μL 重懸于K-medium 緩沖液的大腸桿菌菌液作為線蟲的食物來(lái)源，向土壤中補(bǔ)充K-medium 緩沖液使土壤含水量保持在田間持水量的80%～90%，以保證試驗(yàn)期間土壤水分滿足線蟲生長(zhǎng)發(fā)育需求。使用直徑為0.1 mm的玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管向12孔板內(nèi)的土壤中添加10 條線蟲后用封口膜密封，將孔板置于恒溫培養(yǎng)箱中，在（20±1）℃的黑暗條件下培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)結(jié)束后，向每個(gè)孔板中加入0.5 mL 孟加拉紅染色劑，再將孔板放于70 ℃恒溫干燥箱中加熱10 min殺死全部線蟲以終止試驗(yàn)，通過(guò)LudoxTM離心懸浮法將孔板中的所有線蟲回收于培養(yǎng)皿中，每個(gè)處理4次重復(fù)。

回收的線蟲置于顯微鏡（100 倍）下測(cè)量線蟲的體長(zhǎng)以計(jì)算線蟲的生長(zhǎng)量。生長(zhǎng)量計(jì)算公式：

式中：G為生長(zhǎng)量，μm；T1為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)的線蟲體長(zhǎng)，μm；T2為線蟲初始體長(zhǎng)，本研究取50條第一階段線蟲幼蟲的平均體長(zhǎng)作為線蟲的初始體長(zhǎng)，即（235.2±6.5）μm。

置于顯微鏡（40 倍）下觀察線蟲的繁殖情況。繁殖量計(jì)算公式：

式中：R為繁殖量；I1為線蟲成蟲繁殖的數(shù)量，條；I2為試驗(yàn)投放的線蟲個(gè)體數(shù)量，條。

置于顯微鏡（40 倍）下觀察具有生育能力的線蟲個(gè)體數(shù)量（線蟲體內(nèi)蟲卵個(gè)數(shù)≥1，則表示具有生育能力）以計(jì)算線蟲的生育率。生育率計(jì)算公式：

式中：F為生育率，%；F1為具有含卵線蟲的線蟲個(gè)體數(shù)量，條；F2為引入試驗(yàn)的線蟲個(gè)體數(shù)量，條。

1.5 土壤總Cd和有效態(tài)Cd的測(cè)定

土壤總Cd 含量的測(cè)定方法：準(zhǔn)確稱取0.25 g 土壤樣品于微波消解罐中，加入3 mL 硝酸、3 mL 鹽酸、2 mL 氫氟酸及2 mL 雙氧水，將消解罐置于微波消解儀中進(jìn)行消解。消解完畢后冷卻至室溫，加入1 mL高氯酸，置于電子控溫加熱器中，加熱除酸至消解液剩余1 mL 左右，將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，用2%稀硝酸溶液定容至標(biāo)線[25]。同時(shí)測(cè)定空白和土壤標(biāo)樣，通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測(cè)定濾液中Cd的含量。

土壤中有效態(tài)Cd 含量的測(cè)定方法[26]：稱取5 g 過(guò)2 mm 尼龍篩網(wǎng)的風(fēng)干土壤于離心管中，加入25 mL 0.1 mol·L-1的CaCl2溶液，于25 ℃恒溫水浴振蕩器中250 r·min-1條件下振蕩12 h，將離心管置于離心機(jī)中4 000 r·min-1條件下離心8 min 后過(guò)0.45 μm 濾膜，通過(guò)電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測(cè)定濾液中Cd的含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

通過(guò)Logisitic 方程擬合實(shí)測(cè)總Cd 含量和有效態(tài)Cd 含量與線蟲各個(gè)毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)之間的劑量-效應(yīng)關(guān)，并計(jì)算EC50：

以計(jì)算Cd 對(duì)線蟲繁殖毒性的EC50為例，式中：y為線蟲的繁殖量；x為實(shí)測(cè)總Cd 含量或有效態(tài)Cd 含量，mg·kg-1；a為對(duì)照組中線蟲的繁殖量；x0為EC50值，mg·kg-1；b為方程擬合過(guò)程中所產(chǎn)生的斜率參數(shù)。Cd對(duì)線蟲生育毒性或生長(zhǎng)毒性的EC50計(jì)算方式同上，將y替換為生育率或生長(zhǎng)量，a替換為對(duì)照組中線蟲的生育率或生長(zhǎng)量。

Logisitic 方程的擬合通過(guò)Sigmaplot 14.0 軟件進(jìn)行，利用OriginPro 2019 和Excel 2020 軟件進(jìn)行圖和表的制作，相關(guān)性分析和單因素方差分析通過(guò)SPSS 22.0 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤中有效態(tài)Cd含量

土壤中Cd的毒性在很大程度上取決于其生物有效性，重金屬的有效態(tài)含量能夠較好地反映生物的可利用性和毒性?？傮w上看，3種土壤中的有效態(tài)Cd含量均隨外源Cd 含量的增加而增加，但相同外源Cd 含量下，不同土壤中有效態(tài)Cd 含量存在顯著差異（圖1）。理論總Cd含量為300 mg·kg-1時(shí)，江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土中有效態(tài)Cd含量最高，分 別達(dá)到170.36、165.01 mg·kg-1和132.64 mg·kg-1，有效態(tài)Cd的提取比例由低到高分別為吉林長(zhǎng)春黑土44%、江蘇蘇州水稻土55%、江西鷹潭紅壤56%。

圖1 土壤中有效態(tài)Cd含量Figure 1 Concentration of CaCl2 extracted Cd in soil

2.2 Cd對(duì)線蟲毒性的效應(yīng)及閾值

根據(jù)ISO 10872指南中有關(guān)線蟲毒性試驗(yàn)的有效性標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行相應(yīng)的毒性試驗(yàn)結(jié)果檢驗(yàn)。由表2可見，本研究中線蟲毒性測(cè)試結(jié)果符合有效性標(biāo)準(zhǔn)要求。

表2 毒性測(cè)試有效性Table 2 Toxicity test validity

2.2.1 Cd對(duì)線蟲生長(zhǎng)的影響

選擇Logistic 方程分別擬合土壤中實(shí)際測(cè)得的總Cd 含量、有效態(tài)Cd 含量與秀麗隱桿線蟲生長(zhǎng)量間的劑量-效應(yīng)關(guān)系，結(jié)果如圖2所示。3種土壤中線蟲的生長(zhǎng)量均隨著Cd 含量的增加逐漸降低，但下降趨勢(shì)存在差異。江西鷹潭紅壤、吉林長(zhǎng)春黑土、江蘇蘇州水稻土中理論總Cd含量分別達(dá)到10、50、150 mg·kg-1時(shí)，線蟲的生長(zhǎng)量相較于對(duì)照組開始出現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）；理論總Cd含量提高至300 mg·kg-1時(shí)，吉林長(zhǎng)春黑土中線蟲的生長(zhǎng)量達(dá)到503.06 μm，而江西鷹潭紅壤和江蘇蘇州水稻土線蟲的生長(zhǎng)量分別僅為122.30、379.80 μm。基于實(shí)測(cè)總Cd含量計(jì)算得出，江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土中Cd對(duì)線蟲生長(zhǎng)毒性的EC50分別為54.37、197.54 mg·kg-1和287.02 mg·kg-1，最大值是最小值的5.28 倍；基于有效態(tài)Cd 含量計(jì)算得出，Cd 對(duì)線蟲生長(zhǎng)毒性的EC50分別為24.60、116.60 mg·kg-1和145.15 mg·kg-1，最大值是最小值的5.90倍。

圖2 線蟲生長(zhǎng)量與實(shí)測(cè)總Cd和有效態(tài)Cd含量的劑量-效應(yīng)關(guān)系Figure 2 Dose-response relationships of the growth of C.elegans with the measured concentrations of total Cd and CaCl2-extracted Cd

2.2.2 Cd對(duì)線蟲生育的影響

由圖3線蟲生育率與實(shí)測(cè)總Cd和有效態(tài)Cd含量的劑量-效應(yīng)關(guān)系可知，理論總Cd含量于0～5 mg·kg-1的范圍內(nèi)時(shí)，3種土壤中線蟲的生育能力均未受到Cd毒性的影響（P＞0.05）；理論總Cd 含量達(dá)到10 mg·kg-1時(shí)，江西鷹潭紅壤中線蟲的生育開始受到明顯的抑制（P＜0.05），生育率降為0，而吉林長(zhǎng)春黑土中線蟲的生育未受到顯著的毒性影響（P＞0.05）；理論總Cd 含量達(dá)到50 mg·kg-1時(shí)，江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土仍有60%和73%的線蟲具有生育能力?；趯?shí)測(cè)總Cd 含量計(jì)算得出，江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土中Cd 對(duì)線蟲生育毒性的EC50分別為7.07、77.41 mg·kg-1和103.09 mg·kg-1，最大值是最小值的14.58 倍；基于有效態(tài)Cd 含量計(jì)算得出，Cd 對(duì)線蟲生長(zhǎng)毒性的EC50分別為5.20、39.97 mg·kg-1和47.80 mg·kg-1，最大值是最小值的9.19 倍，較基于總Cd含量得到的毒性閾值差異縮小。

圖3 線蟲生育率與實(shí)測(cè)總Cd和有效態(tài)Cd含量的劑量-效應(yīng)關(guān)系Figure 3 Dose-response relationships of the fertility of C.elegans with the measured concentrations of total Cd and CaCl2-extracted Cd

2.2.3 Cd對(duì)線蟲繁殖量的影響

由圖4線蟲繁殖量與實(shí)測(cè)總Cd和有效態(tài)Cd含量的劑量-效應(yīng)關(guān)系可知，3 種土壤中江西鷹潭紅壤理論總Cd含量達(dá)到5 mg·kg-1時(shí)線蟲的繁殖受到顯著的毒性抑制（P＜0.05），而江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土理論總Cd 含量均達(dá)到50 mg·kg-1時(shí)線蟲的繁殖才開始出現(xiàn)明顯的降低（P＜0.05）；理論總Cd 含量提高至150 mg·kg-1時(shí)江西鷹潭紅壤中幾乎沒(méi)有新的線蟲后代個(gè)體產(chǎn)生，而吉林長(zhǎng)春黑土中每條線蟲仍然能產(chǎn)生10.2 條后代個(gè)體?；趯?shí)測(cè)總Cd 含量計(jì)算得出，江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土中Cd 對(duì)線蟲繁殖毒性的EC50分別為5.75、13.84 mg·kg-1和85.94 mg·kg-1，最大值是最小值的14.94 倍；基于有效態(tài)Cd 含量計(jì)算得出，Cd 對(duì)線蟲繁殖毒性的EC50分別為3.14、7.67 mg·kg-1和37.25 mg·kg-1，最大值是最小值的11.86倍，較基于總Cd含量得到的毒性閾值差異縮小。

圖4 線蟲繁殖量與實(shí)測(cè)總Cd和有效態(tài)Cd含量的劑量-效應(yīng)關(guān)系Figure 4 Dose-response relationships of the reproductive number of C.elegans with the measured concentrations of total Cd and CaCl2-extracted Cd

2.3 土壤理化性質(zhì)與Cd毒性閾值間的相關(guān)性

基于Cd 含量推導(dǎo)的線蟲毒性的EC50值如表3 所示。通過(guò)相關(guān)性分析探究土壤理化性質(zhì)中影響Cd毒性的主導(dǎo)因素，分析結(jié)果如表4所示，pH、土壤碳酸鈣含量和陽(yáng)離子交換量與線蟲生長(zhǎng)量和生育率的EC50呈顯著正相關(guān)關(guān)系，非晶質(zhì)錳氧化物和晶質(zhì)錳氧化物與基于繁殖的EC50呈顯著正相關(guān)關(guān)系，有機(jī)質(zhì)含量和線蟲的生長(zhǎng)、發(fā)育和繁殖的EC50均呈顯著正相關(guān)關(guān)系。以上結(jié)果表明，土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量、碳酸鈣含量、陽(yáng)離子交換量及非晶質(zhì)和晶質(zhì)錳氧化物含量是影響土壤中Cd 毒性的主要因素。pH 主要通過(guò)影響Cd在土壤中形態(tài)的分布從而影響土壤Cd 的生物有效性，堿性土壤的生物有效性通常較低，對(duì)生物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)較小[27]。陽(yáng)離子交換量比較高的土壤中重金屬離子的吸附量更高，會(huì)吸附土壤環(huán)境中更多的Cd，以降低土壤Cd 的生物有效性。土壤有機(jī)質(zhì)是組成土壤固相的重要成分，可以通過(guò)與土壤中的重金屬發(fā)生沉淀、吸附、螯合等作用，來(lái)降低土壤中重金屬的有效性[28]。碳酸鈣除本身具有一定的吸附作用外，還可能影響反應(yīng)體系的平衡系數(shù)，降低土壤中有效態(tài)Cd 的含量，從而影響Cd 的生物毒性[29]。錳氧化物對(duì)土壤中Cd 的吸附和凈化能夠降低Cd 的毒性，其含有變價(jià)元素并帶有表面電荷，具有良好的表面活性，對(duì)土壤中的重金屬具有良好的吸附凈化能力，從而可以降低土壤Cd的毒性[30]。

表3 基于實(shí)測(cè)總Cd和有效態(tài)Cd含量推導(dǎo)的Cd對(duì)線蟲毒性的EC50Table 3 The EC50 values of Sb for the toxicity of C.elegans based on the concentration of measured total Cd and CaCl2-extracted

表4 土壤理化性質(zhì)與Cd毒性閾值間的相關(guān)性Table 4 Correlation between threshold of Cd toxicity to C.elegans and soil physicochemical properties

3 討論

線蟲的生長(zhǎng)分為3 個(gè)時(shí)期：胚胎期、幼蟲期和成蟲期，其中幼蟲期要經(jīng)過(guò)4 次發(fā)育蛻皮（L1～L4）[31]，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)ISO 10872中關(guān)于土壤秀麗隱桿線蟲的毒性試驗(yàn)涉及其整個(gè)生命周期，因此可以通過(guò)此方法研究Cd 對(duì)土壤線蟲的毒性影響。本研究結(jié)果表明，線蟲的毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)對(duì)Cd毒性的敏感性由低到高分別為生長(zhǎng)量、發(fā)育率和繁殖量。Boyd 等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，于20 ℃的培養(yǎng)條件下線蟲體長(zhǎng)達(dá)到1 110～1 150 μm 時(shí)開始產(chǎn)卵。如果線蟲生長(zhǎng)受到毒性的抑制而停留在L4（1 100～1 150 μm）期以前，則不能達(dá)到生育所需的階段，就會(huì)影響線蟲的發(fā)育能力，所以Cd對(duì)線蟲生育的影響可能是線蟲生長(zhǎng)受到抑制的附加效應(yīng)。正如本研究結(jié)果所示，在3 種土壤中Cd 對(duì)秀麗隱桿線蟲生長(zhǎng)毒性的EC50遠(yuǎn)高于生育的EC50，因此線蟲的生育能力對(duì)Cd 毒性的敏感性高于生長(zhǎng)量。Schertzinger等[33]的研究表明，當(dāng)檢測(cè)到重金屬Pt對(duì)線蟲繁殖產(chǎn)生抑制時(shí)，沒(méi)有觀察到其對(duì)生育能力的抑制。宋子杰等[34]的研究表明理論總Sb含量達(dá)到4 800 mg·kg-1時(shí)，鷹潭紅壤中線蟲的生育并沒(méi)有受到完全的抑制，但是沒(méi)有新的線蟲后代產(chǎn)生。本研究中當(dāng)吉林長(zhǎng)春黑土理論Cd 含量達(dá)到50 mg·kg-1時(shí)線蟲繁殖受到明顯抑制，而線蟲的生育未受到顯著的毒性影響，可能是Cd對(duì)線蟲蟲卵的損害以及生育毒性的附加效應(yīng)共同造成的，從而導(dǎo)致線蟲的繁殖對(duì)污染物毒性的敏感性高于生育和生長(zhǎng)。

土壤理化性質(zhì)可以通過(guò)影響土壤中重金屬Cd的有效態(tài)含量，進(jìn)而影響Cd的毒性和生物有效性，從而對(duì)Cd 的毒性閾值產(chǎn)生影響[35]。在添加相同含量的外源Cd 時(shí)，有效態(tài)Cd 含量在不同土壤上存在明顯的差異，以0.1 mol·L-1CaCl2為提取劑，外源添加含量相同時(shí)，兩種土壤中有效態(tài)Cd 含量相差近5.8 倍，其中尤溪地區(qū)有效態(tài)Cd 占比高達(dá)78%[28]。本研究結(jié)果表明土壤pH、陽(yáng)離子交換量、有機(jī)質(zhì)，碳酸鈣和錳氧化物是影響土壤中Cd 毒性的主要因素。劉海龍等[36]比較18 種土壤中Cd 對(duì)赤子愛勝蚓急性毒性閾值的EC50，發(fā)現(xiàn)不同土壤毒性差異顯著，在鷹潭紅壤和保定潮土中兩者之間相差約200 mg·kg-1，其發(fā)現(xiàn)土壤pH 和有機(jī)質(zhì)含量與EC50呈顯著正相關(guān)關(guān)系。在堿性條件下，土壤表面帶的負(fù)電荷較多，而Cd 帶有正電荷，故Cd2+在堿性土壤上的吸附量比在酸性土壤上的吸附量大，所以Cd 對(duì)動(dòng)植物的毒性一般隨pH 的增大而降低[37]。本研究中江西鷹潭紅壤pH 最低，在添加相同含量外源Cd 時(shí)，土壤中交換態(tài)、水溶態(tài)Cd 的含量增加，即增加了土壤中有效態(tài)Cd 的含量，從而導(dǎo)致江西紅壤中Cd 表現(xiàn)出對(duì)線蟲最高的毒性。陽(yáng)離子交換量和有機(jī)質(zhì)含量對(duì)土壤中重金屬離子的吸附和沉淀具有重要影響。其含量越高，負(fù)電荷量越高，通過(guò)靜電吸引而吸附的金屬離子也越多[38]。鐵錳氧化礦物含有變價(jià)元素并帶有表面電荷，具有良好的表面活性，對(duì)土壤中的重金屬具有良好的吸附凈化功能。本研究選取的吉林長(zhǎng)春黑土錳氧化物含量較高，為外源添加的Cd提供了充足的吸附點(diǎn)位和凈化功能，從而表現(xiàn)出較低毒性[39]。有研究結(jié)果表明碳酸鈣的添加可以顯著提高土壤pH，使土壤吸附Cd 的能力增強(qiáng)，碳酸鈣也可水解后生成重碳酸根離子，再進(jìn)一步電離生成的碳酸根離子可與重金屬離子相結(jié)合形成難溶的碳酸鹽物質(zhì)，從而減低了土壤中Cd 的生物有效性[40]。該結(jié)果同樣能夠解釋吉林長(zhǎng)春黑土具有最低的有效態(tài)Cd含量。

從生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)角度來(lái)看，金屬總量與其對(duì)環(huán)境造成的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)并不一定成比例，而形態(tài)含量及其比例才是關(guān)鍵因素。有研究表明土壤有效態(tài)Cd與蚯蚓體內(nèi)富集系數(shù)的相關(guān)性高于土壤中全量Cd 的相關(guān)性[41]。宋子杰等[42]的研究表明提取態(tài)Sb 含量同樣能夠較好地解釋不同土壤中Sb 對(duì)線蟲繁殖毒性的顯著差異，其研究結(jié)果顯示基于不同土壤中總Sb 含量計(jì)算的線蟲繁殖毒性的EC50差異高達(dá)2.6 倍，而基于磷酸氫鈉提取態(tài)Sb 含量計(jì)算的EC50差異降低至2.0 倍。本研究結(jié)果中基于總Cd含量計(jì)算的繁殖毒性最大差異可達(dá)到14.94倍；基于有效態(tài)Cd含量計(jì)算線蟲繁殖的最大毒性差異降至11.86倍。說(shuō)明土壤中重金屬的有效態(tài)含量可以較好地解釋不同土壤中重金屬的生物毒性的差異。隨著外源Cd與土壤接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，Cd 的可浸提性、生物有效性和毒害作用逐漸降低，本研究只關(guān)注了3種土壤老化7 d后有效態(tài)Cd和毒性的變化，今后應(yīng)研究土壤性質(zhì)和更長(zhǎng)老化時(shí)間對(duì)Cd毒性的影響。

4 結(jié)論

（1）由江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土中Cd 對(duì)線蟲的EC50差異可知，線蟲的3 個(gè)毒性評(píng)價(jià)終點(diǎn)對(duì)Cd毒性的敏感性由低到高分別為生長(zhǎng)量、生育率、繁殖。

（2）pH、陽(yáng)離子交換量、有機(jī)質(zhì)、碳酸鈣及非晶質(zhì)錳和晶質(zhì)錳氧化物含量的增加可以降低3 種土壤中Cd 對(duì)線蟲生長(zhǎng)、生育、繁殖的毒性，是影響土壤中Cd毒性的主要因素。

（3）有效態(tài)Cd 含量能夠更好地表達(dá)不同土壤類型中Cd的生物有效性，并解釋江西鷹潭紅壤、江蘇蘇州水稻土和吉林長(zhǎng)春黑土中Cd對(duì)線蟲毒性的差異，3種土壤中吉林長(zhǎng)春黑土有效態(tài)Cd 含量最低，對(duì)線蟲產(chǎn)生的毒性效應(yīng)也最小。