肖 紅,何 珍,田 棋,黃鑫淼,廖衛(wèi)東,黃廷華,姚 敏

(長(zhǎng)江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434020)

隨著沙門(mén)氏菌病的頻發(fā)以及給世界養(yǎng)殖業(yè)和公眾健康帶來(lái)的損失與危害,對(duì)沙門(mén)氏菌感染的研究成為社會(huì)關(guān)注的焦點(diǎn)之一。沙門(mén)氏菌通過(guò)三型分泌系統(tǒng)(T3SS-2)將蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中,與宿主免疫系統(tǒng)互作,調(diào)節(jié)其在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制[1]。有效地跟蹤沙門(mén)氏菌在胞內(nèi)的存活、增殖及與宿主細(xì)胞的互作是探索沙門(mén)氏菌致病機(jī)制的重要方面。

一些報(bào)告已使用化學(xué)熒光染料標(biāo)記細(xì)菌開(kāi)展病原菌與宿主細(xì)胞的互作及機(jī)制研究[2-4]。由于化學(xué)物質(zhì)的非特異性,標(biāo)記化合物可能從細(xì)菌泄漏到細(xì)胞,產(chǎn)生非細(xì)菌的熒光標(biāo)記,干擾研究者對(duì)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)的行為觀察。其次,并非所有細(xì)菌都以相同的效率染色,并且細(xì)菌生物膜對(duì)熒光染料的滲透性差異妨礙了研究者對(duì)細(xì)菌活力的判斷[5]。因此,化學(xué)熒光染料標(biāo)記細(xì)菌對(duì)于跟蹤活宿主細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病原體的價(jià)值有限。增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)是一種發(fā)光的水母蛋白,具有體積小、穩(wěn)定性強(qiáng)、探測(cè)時(shí)不需要外源底物等優(yōu)點(diǎn)。 它廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究,包括細(xì)胞分化、基因追蹤和體內(nèi)蛋白質(zhì)定位和操作的研究[6-7]。 GFP能在多種原核生物中表達(dá)而發(fā)光,包括大腸桿菌、乳酸乳球菌和戈登鏈球菌[8-10]。EGFP的表達(dá)不會(huì)改變細(xì)菌與宿主細(xì)胞的相互作用,并且可以在活的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中觀察到表達(dá)EGFP的細(xì)菌[11]。

本研究通過(guò)電轉(zhuǎn)法將帶有沙門(mén)氏菌毒力基因PagC的啟動(dòng)子序列(PpagC)和增強(qiáng)型熒光蛋白基因(EGFP)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Sal-14028中,獲得能產(chǎn)生熒光信號(hào)的Sal-pPpagC-EGFP菌株。比較研究了熒光菌株與野生菌株在生化特征和生長(zhǎng)特征等方面的差異。此外,本研究通過(guò)細(xì)胞侵染試驗(yàn)初步探討了Sal-pPpagC-EGFP在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的定位示蹤作用,以期為沙門(mén)氏菌感染細(xì)胞的分子機(jī)制研究提供有效的生物材料。

1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒、細(xì)胞株和小鼠

鼠傷寒沙門(mén)氏菌14028標(biāo)準(zhǔn)株及其感受態(tài)細(xì)胞、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞均由長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存。pET28a-EGFP質(zhì)粒、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司。豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21由本實(shí)驗(yàn)室保存。BALB/c小鼠購(gòu)自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,體質(zhì)量18～25 g。

1.2 試驗(yàn)試劑

T4DNA連接酶、限制性?xún)?nèi)切酶、卡那霉素(Kanamycin,Km)購(gòu)自TaKaRa公司;蛋白胨和酵母粉購(gòu)自O(shè)xoid公司;胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Solarbio公司;兔單克隆抗體LAMP1、山羊抗兔IgG Alexa Fluor 488購(gòu)自Abcam公司;細(xì)菌質(zhì)粒DNA小提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司。常規(guī)生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用GenBank 中鼠傷寒沙門(mén)氏菌 ATCC14028 標(biāo)準(zhǔn)株P(guān)agC基因的啟動(dòng)子序列(PpagC)為模板進(jìn)行設(shè)計(jì):引物1(PpagC-F 5′-CGTGCGCAGTTAACCACTCTTAATAATAATG-3′)和引物2(PpagC-R 5′-GCTCTAGATACTACTTATTATTTACGGTGT-3′),由上海生工科技有限公司合成。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以鼠傷寒沙門(mén)氏菌ATCC14028為模板,擴(kuò)增PpagC片段。將PpagC片段克隆到pMD18-T載體,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,使用Omega試劑盒提取質(zhì)粒,XbaⅠ、FspⅠ限制性?xún)?nèi)切酶切下PpagC、EGFP片段后相連接,獲得重組質(zhì)粒并命名為pPpagC-EGFP。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后使用Omega試劑盒提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR和酶切鑒定,陽(yáng)性菌株進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序引物為5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′。

1.5 熒光菌株的構(gòu)建及鑒定

重組質(zhì)粒pPpagC-EGFP在2.0 kV電壓下電擊4 ms,使其轉(zhuǎn)化進(jìn)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌感受態(tài)細(xì)胞。挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證,測(cè)序引物同上。陽(yáng)性菌株標(biāo)記為Sal-pPpagC-EGFP,并使用熒光顯微鏡觀察。另設(shè)空白質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌作為對(duì)照。

1.6 重組熒光沙門(mén)氏菌Sal-pPpagC-EGFP的生物學(xué)性狀

1.6.1 Sal-pPpagC-EGFP的穩(wěn)定性檢測(cè) 挑取Sal-pPpagC-EGFP單克隆分別劃線于LB固體培養(yǎng)基(含有30 μg/mL Km)和LB固體培養(yǎng)基中,置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng),每12 h移植1次,連續(xù)20次,分別于第3,6,9,12,15,18,20次,挑取單克隆制作涂片于熒光顯微鏡下觀察EGFP熒光信號(hào)。

1.6.2 Sal-pPpagC-EGFP的生長(zhǎng)曲線測(cè)定 按照 1%的比例將Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028新鮮培養(yǎng)物分別接入含有 30 μg/mL Km的LB 液體培養(yǎng)基和無(wú)Km的LB 液體培養(yǎng)基中。置 37 ℃、180 r/min 恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng),每隔 1 h 取樣,采用酶標(biāo)儀讀取OD600值,試驗(yàn)重復(fù) 3 次,并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.6.3 Sal-pPpagC-EGFP的半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定 將熒光株Sal-pPpagC-EGFP和野生株Sal-14028培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,收集菌體,滅菌PBS洗滌3次,以滅菌PBS重懸菌液,分光光度計(jì)測(cè)定菌液濃度。130只8周齡BALB/c雌性小鼠,隨機(jī)分為3組,第1組為Sal-pPpagC-EGFP攻毒組,分別以108,107,106,105,104cfu/mL的劑量腹腔注射BALB/c小鼠,每個(gè)劑量重復(fù)12只。第2組為Sal-14028攻毒組,分別以108,107,106,105,104cfu/mL的劑量進(jìn)行腹腔注射BALB/c小鼠,每個(gè)劑量重復(fù)12只。第3組為生理鹽水對(duì)照組,10只小鼠給予腹腔注射同體積生理鹽水。連續(xù)觀察21 d,記錄BALB/c小鼠的死亡情況,使用改良寇氏法計(jì)算Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028的LD50。

1.7 熒光菌株Sal-pPpagC-EGFP在豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21中的示蹤初探

1.7.1 細(xì)胞和菌株培養(yǎng) 豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21在37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)于DMEM+10% FBS中。按照106/孔密度將細(xì)胞接種于12孔板中,Sal-pPpagC-EGFP和Sal-14028培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用滅菌PBS洗滌并調(diào)整濃度,以MOI=10的感染指數(shù)侵染細(xì)胞,細(xì)菌與細(xì)胞孵育30 min后加入含50 μg/mL終濃度多粘菌素的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7.2 免疫熒光試驗(yàn) 將感染3,6 h的3D4/21細(xì)胞用PBS洗滌3次后,以4%多聚甲醛固定10 min,0.1% TritonX-100透化10 min。細(xì)胞再次經(jīng)PBS洗滌后,用5% BSA封閉60 min。將細(xì)胞與稀釋好的LAMP1一抗(1∶200)室溫反應(yīng)2 h,再與山羊抗兔二抗(1∶400)37 ℃孵育45 min,然后用PBS緩沖液洗滌,DAPI染色3 min后洗滌3次,最后滴加抗熒光猝滅劑封片,進(jìn)行顯微鏡分析。野生株Sal-14028感染細(xì)胞作為對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.1PpagC片段的擴(kuò)增 為使質(zhì)粒pET28a-EGFP在沙門(mén)氏菌中穩(wěn)定表達(dá)和復(fù)制,本研究計(jì)劃將沙門(mén)氏菌PagC基因的啟動(dòng)子序列(PpagC)克隆并替換pET28a-EGFP中的T7啟動(dòng)子,并將PpagC、EGFP片段連接到pET28a-EGFP質(zhì)粒的XbaⅠ、FspⅠ位點(diǎn)(圖1),以期重組菌株具備穩(wěn)定發(fā)光的特征。試驗(yàn)中以鼠傷寒沙門(mén)氏菌14028菌液為模板,分別用上下游引物PpagC(F1)、PpagC(R2)擴(kuò)增,結(jié)果擴(kuò)增出716 bp片段(圖2-A),片段長(zhǎng)度與預(yù)期相符。

圖1 pPpagC-EGFP質(zhì)粒結(jié)構(gòu)圖譜Fig.1 Structural mapping of pPpagC-EGFP plasmid

2.1.2 重組質(zhì)粒酶切鑒定 用限制性?xún)?nèi)切酶XbaⅠ、FspⅠ雙酶切重組質(zhì)粒PMD18-PpagC和pET28a-EGFP,得到約716 bp的PpagC片段和4 184 bp的pET28a-EGFP片段(圖2-B),連接后得到重組質(zhì)粒pPpagC-EGFP再次雙酶切獲得約716 bp的PpagC片段和4 184 bp的pET28a-EGFP片段(圖2-C)。

A.PCR擴(kuò)增PpagC片段:M.DNA Marker DL2000;B.pMD18T-PpagC、pET28a-EGFP雙酶切電泳圖,瓊脂糖凝膠濃度為1.5%:1.pET28a-EGFP,2.pMD18T-PpagC,M.DNA Marker DL2000;C.重組質(zhì)粒pPpagC-EGFP雙酶切(FspⅠ和Xba Ⅰ)電泳圖,瓊脂糖凝膠濃度為1.5%:1.原質(zhì)粒,2—3.酶切質(zhì)粒,M.DNA Marker DL2000。A.PCR amplification of PpagC promoter fragment:M.DNA Marker DL2000;B.pMD18T-PpagC,pET28a-EGFP double digestion 1.5% agarose gel electrophoresis map:1.pET28a-EGFP,2.pMD18T-PpagC,M.DNA Marker DL2000;C.1.5% agarose gel electrophoresis plot of recombinant plasmid pPpagC-EGFP double digested(Fsp Ⅰ and Xba Ⅰ)product:1.The original plasmid,2—3.The digested plasmid,M.DNA Marker DL2000.圖2 PpagC片段PCR擴(kuò)增和pMD18T-PpagC、pPpagC-EGFP的酶切鑒定Fig.2 PCR Amplification of PpagC fragment and validation of pMD18T-PpagC and pPpagC-EGFP by enzymatic cleavage

2.2 鼠傷寒沙門(mén)氏菌Sal-pPpagC-EGFP菌株的測(cè)序鑒定及熒光檢測(cè)

2.2.1 Sal-pPpagC-EGFP菌株的測(cè)序鑒定 陽(yáng)性菌株菌液委托上海生工科技公司測(cè)序,結(jié)果表明,重組質(zhì)粒pPpagC-EGFP成功轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌14028。部分測(cè)序峰圖見(jiàn)圖3。

2.2.2 Sal-pPpagC-EGFP菌株的熒光鑒定 挑取電轉(zhuǎn)后的鼠傷寒沙門(mén)氏菌和空白對(duì)照單克隆制備菌液涂片,在熒光顯微鏡下觀察,可見(jiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光(圖4-A),右圖為空白對(duì)照,在激發(fā)光下無(wú)可見(jiàn)熒光(圖4-B)。說(shuō)明增強(qiáng)型綠色熒光蛋白基因(EGFP)已成功轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌14028,陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為Sal-pPpagC-EGFP。

測(cè)序引物為5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′。The sequencing primer is 5′-GCTGCCCATGGTATATCTCCT-3′.圖3 pPpagC-EGFP質(zhì)粒測(cè)序峰圖(第一部分)Fig.3 pPpagC-EGFP plasmid sequencing peak map(part 1)

A.Sal-pPpagC-EGFP鼠傷寒沙門(mén)氏菌在熒光顯微鏡下的圖片(激發(fā)488 nm/發(fā)射507 nm、100×);B.空白對(duì)照在熒光顯微鏡下的圖片(激發(fā)488 nm/發(fā)射507 nm、100×)。A.Picture of Sal-pPpagC-EGFP Salmonella typhimurium under fluorescence microscope(excitation 488 nm/emission 507 nm,100×);B.Blank control under fluorescence microscope(excitation 488 nm/emission 507 nm,100×).圖4 標(biāo)記EGFP的沙門(mén)氏菌的熒光圖Fig.4 Fluorescence map of salmonella labeled with EGFP

2.3 Sal-pPpagC-EGFP的生物學(xué)特性

2.3.1EGFP表達(dá)的穩(wěn)定性檢測(cè) 連續(xù)20次轉(zhuǎn)接劃線后檢測(cè)Sal-pPpagC-EGFP的熒光信號(hào),結(jié)果表明,在不同的時(shí)間點(diǎn),不論含抗生素或不含抗生素培養(yǎng)基上的單克隆都保持強(qiáng)烈的熒光,且菌落數(shù)量無(wú)較大差異,說(shuō)明pPpagC-EGFP在Sal-14028中穩(wěn)定表達(dá)EGFP,且不受抗性選擇的影響。

2.3.2 熒光菌株的生長(zhǎng)曲線 在相同培養(yǎng)條件下,熒光菌株與野生菌株生長(zhǎng)曲線的變化趨勢(shì)基本相同,都在2 h后進(jìn)入指數(shù)期,約10 h后進(jìn)入穩(wěn)定期(圖5)。結(jié)果表明,pPpagC-EGFP質(zhì)粒、卡那霉素的存在及EGFP的表達(dá)對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。

圖5 Sal-14028和Sal-pPpagC-EGFP的生長(zhǎng)曲線比較Fig.5 Comparison of the growth curves of Sal-14028 and Sal-pPpagC-EGFP

2.3.3 半數(shù)致死量(LD50)測(cè)定 使用改良寇氏法計(jì)算出Sal-pPpagC-EGFP的LD50為1.20×106cfu/mL,Sal-14028的LD50為1.45×106cfu/mL,兩者毒力無(wú)顯著差異(P>0.05)(表1),結(jié)果表明,EGFP基因的插入對(duì)熒光株的毒力無(wú)明顯影響。

表1 8周齡小鼠腹腔注射Sal-14028、Sal-pPpagC-EGFP菌株后LD50的測(cè)定Tab.1 Determination of LD50 after intraperitoneal injection of Sal-14028 and Sal-pPpagC-EGFP strains in 8-week-old mice

2.4 豬肺泡巨噬細(xì)胞3D4/21中吞噬溶酶體與熒光沙門(mén)氏菌的共定位

沙門(mén)氏菌在488 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光信號(hào),Alexa Fluor 488標(biāo)記的溶酶體蛋白LAMP1在495 nm波長(zhǎng)的激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光信號(hào)(圖6)。結(jié)果表明,沙門(mén)氏菌侵襲進(jìn)入了3D4/21細(xì)胞,溶酶體廣泛表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,且與包含沙門(mén)氏菌的吞噬體發(fā)生共定位,吞噬體中沙門(mén)氏菌的EGFP熒光信號(hào)未受免疫熒光相關(guān)試劑、吞噬體膜和細(xì)胞膜的影響。

圖6 熒光沙門(mén)氏菌在3D4/21中與吞噬溶酶體共定位情況(100×)Fig.6 Co-localization of Salmonella fluorescens with phagocytic lysosomes in 3D4/21(100×)

3 結(jié)論與討論

鼠傷寒沙門(mén)氏菌是一種高致病力、兼性胞內(nèi)感染的革蘭氏陰性細(xì)菌,是重要的人畜共患病原體之一,可導(dǎo)致人類(lèi)和動(dòng)物腸胃炎、豬敗血癥和死亡等。然而鼠傷寒沙門(mén)氏菌在宿主體內(nèi)散播的分子機(jī)制尚待進(jìn)一步確定。目前對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的研究主要集中在對(duì)其致病因子表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),毒力因子特異抗體的制備,新型藥物靶點(diǎn)的尋找等[12-13],沙門(mén)氏菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的示蹤及其在感染細(xì)胞內(nèi)的行為狀態(tài)是開(kāi)展上述研究的重要基礎(chǔ)。本研究通過(guò)基因重組構(gòu)建了EGFP標(biāo)記的熒光菌株Sal-pPpagC-EGFP,并評(píng)估了EGFP和Km基因的引入對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌 14028生物學(xué)特性和毒力的影響。另外,驗(yàn)證了Sal-pPpagC-EGFP在豬肺泡巨噬細(xì)胞中的定位示蹤作用。本研究結(jié)果表明,Sal-pPpagC-EGFP是研究鼠傷寒沙門(mén)氏菌致病機(jī)制的潛在工具。

一些GFP質(zhì)粒已成功用于標(biāo)記某些沙門(mén)氏菌,但均存在缺點(diǎn)和限制。目前,熒光沙門(mén)氏菌菌株多基于pUCP18、pKK223系列質(zhì)粒構(gòu)建,如ATCC公司的Salmonella14028GFP菌株采用的是pUCP18MCSgfpmut3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化沙門(mén)氏菌所得,其熒光信號(hào)較強(qiáng),但該菌株所含熒光質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)尚未見(jiàn)報(bào)道,且國(guó)內(nèi)難以獲得。pPpagCGFP_OVA和pPtacCGFP_OVA 質(zhì)粒是應(yīng)用較為成功的沙門(mén)氏菌熒光質(zhì)粒,但主要針對(duì)SL1344缺陷型沙門(mén)氏菌菌株設(shè)計(jì)[14]。此外,研究報(bào)道pACYC和pSIF等載體中四環(huán)素抗性基因可影響吞噬入胞內(nèi)的沙門(mén)氏菌的存活和生長(zhǎng)[15]。以上質(zhì)粒的優(yōu)缺點(diǎn)為進(jìn)一步優(yōu)化構(gòu)建熒光沙門(mén)氏菌提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù),也是本研究以PagC基因的啟動(dòng)子序列(PpagC)和pET28a-EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ),并引入卡那霉素抗性基因,作為研究切入點(diǎn)的重要原因。

熒光質(zhì)粒在沙門(mén)氏菌胞內(nèi)的穩(wěn)定性與質(zhì)粒攜帶的EGFP基因和Km抗性基因?qū)?xì)菌生長(zhǎng)、毒力、胞內(nèi)存活等生物學(xué)特性的影響是以PpagC和pET28a-EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)的熒光沙門(mén)氏菌能否成功應(yīng)用的關(guān)鍵。大腸桿菌與沙門(mén)氏菌由一個(gè)祖先分化而來(lái)[16],此外,在大腸桿菌基因島OI-122中同樣存在毒力基因PagC,并與沙門(mén)氏菌毒力基因PagC具有顯著同源性[17-18]。因此,本研究基于大腸桿菌來(lái)源的PET28a-EGFP構(gòu)建的pPpagC-EGFP質(zhì)粒能夠在沙門(mén)氏菌中穩(wěn)定傳代。GFP的最大優(yōu)點(diǎn)是不損害標(biāo)記對(duì)象,在細(xì)菌致病性研究中具有潛在用途。Valdivia 等[19]構(gòu)建了GFP表達(dá)載體并在腸道病原體和鼠傷寒沙門(mén)氏菌中進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果表明,GFP表達(dá)不會(huì)對(duì)細(xì)菌存活產(chǎn)生不利影響,也不會(huì)損害細(xì)菌進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞或在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活的能力。本研究成功利用EGFP標(biāo)記了鼠傷寒沙門(mén)氏菌 14028,并對(duì)其生長(zhǎng)特性和毒力進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明熒光株與野生株的生長(zhǎng)曲線和毒力無(wú)顯著差異,與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果一致。有研究報(bào)道,濃度為15～150 μg/mL的氨基糖苷類(lèi)(卡那霉素)抗生素不會(huì)降低胞內(nèi)沙門(mén)氏菌存活和增殖的能力[20]。本研究證明了pPpagC-EGFP衍生的卡那霉素抗性基因不會(huì)影響沙門(mén)氏菌在胞內(nèi)存活與增殖的能力。試驗(yàn)中,熒光顯微鏡觀察菌株Sal-pPpagC-EGFP在吞噬溶酶體中的定位情況,發(fā)現(xiàn)其侵染3D4/21細(xì)胞3 h后定位于溶酶體,并于6 h后增殖。說(shuō)明一定時(shí)間范圍內(nèi),隨著感染時(shí)間增長(zhǎng),胞內(nèi)沙門(mén)氏菌數(shù)量增多。本研究進(jìn)一步揭示了,Km抗性基因標(biāo)記的以PpagC和pET28a-EGFP質(zhì)粒為基礎(chǔ)的Sal-pPpagC-EGFP可作為研究沙門(mén)氏菌致病機(jī)制的潛在工具。

本研究成功構(gòu)建啟動(dòng)子序列為14028標(biāo)準(zhǔn)沙門(mén)氏菌源性的pPpagC-EGFP質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)后獲得熒光菌株Sal-pPpagC-EGFP。通過(guò)細(xì)菌侵染試驗(yàn),初步了解其在豬肺泡巨噬細(xì)胞內(nèi)與吞噬溶酶體的共定位情況及存活穩(wěn)定性。為進(jìn)一步闡明沙門(mén)氏菌致病機(jī)制奠定基礎(chǔ),提供了實(shí)時(shí)觀測(cè)胞內(nèi)細(xì)菌行為狀態(tài)的有效生物材料。