唐 君,代 祥,李貴飛,,穆 兵,王 楓,楊亦揚(yáng)

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 休閑農(nóng)業(yè)研究所,江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇 南京 210014; 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,江蘇 南京 210095)

茶樹是葉用植物,生長過程中對氮肥的要求高。適宜的氮肥用量可以提高茶葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[1]。由于茶園管理粗放,施入的氮肥往往過量。據(jù)調(diào)查,我國有30%的茶園土壤氮肥施用過量[2]。不僅造成資源浪費(fèi),還會加劇土壤酸化和水體富營養(yǎng)化[3],同時(shí)對茶葉品質(zhì)產(chǎn)生不利影響[4]。通過精準(zhǔn)施肥和選用氮高效品種,可以顯著提高茶園氮素利用率。研究表明,20年生的茗豐茶園,與習(xí)慣施肥相比,化學(xué)氮肥減施27.8%,產(chǎn)量不減[5]。篩選出黃棪對低氮不敏感,屬于氮高效茶樹品種[6]。

雖然目前關(guān)于NPF基因的研究已有較多報(bào)道,但大多集中在模式植物擬南芥、水稻中[9],而對于茶樹中的NPF基因鑒定及功能研究報(bào)道較少。為探討NPF蛋白在茶樹氮素響應(yīng)方面的功能,本研究克隆得到一個(gè)受氮素處理誘導(dǎo)表達(dá)的NPF轉(zhuǎn)錄本,根據(jù)其在茶樹基因組上分布位置,將其命名為CsNPF5。對該基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析,研究CsNPF5在不同氮素水平下的表達(dá)模式,以期為進(jìn)一步研究CsNPF5基因功能、提高氮素利用率并選育氮高效茶樹品種提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.2 CsNPF5基因克隆

基于茶樹基因組序列信息,設(shè)計(jì)CsNPF5基因全長擴(kuò)增引物T1和T2(表1)在茶樹gDNA中和cDNA中擴(kuò)增NPF5基因序列,通過對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳、切膠回收并連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)培養(yǎng)挑取陽性單菌落進(jìn)行測序,并將測序序列在茶樹基因組中檢索驗(yàn)證該基因存在,即克隆CsNPF5基因全長。

表1 PCR擴(kuò)增的引物序列Tab.1 Primer sequences of PCR amplification

1.3 CsNPF5基因染色體定位

利用克隆的CsNPF5基因序列,通過搜索茶樹基因組數(shù)據(jù)庫Tea Plant Information Archive(TPIA,http://tpdb.shengxin.ren/index.html),獲得與CsNPF5基因序列完全匹配的基因組位置信息和基因ID,對CsNPF5進(jìn)行全基因組染色體分布定位及基因拷貝數(shù)分析。

1.4 CsNPF5基因序列分析

利用DNAMAN進(jìn)行不同物種中CsNPF5基因同源序列的多序列比對。用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)進(jìn)行CsNPF5基因的開放閱讀框(Open reading frame, ORF)預(yù)測。用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線工具進(jìn)行CsNPF5蛋白保守域預(yù)測。用ExPASy Compute pI/MW(https://web.expasy.org/cgi-bin/compute_pi/pi_tool)在線工具進(jìn)行蛋白分子量和等電點(diǎn)計(jì)算。用CsNPF5蛋白序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索其他物種中該蛋白的同源序列,用MEGA 10軟件[20],將獲得的同源序列以鄰接法(Neighbor-joining,NJ;bootstrap=1 000)構(gòu)建進(jìn)化樹。用TMHMM 軟件(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)預(yù)測蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域;用ProtComp 9.0(http://linux1.softberry.com)預(yù)測蛋白亞細(xì)胞定位。

1.5 CsNPF5基因表達(dá)分析

利用Primer 6設(shè)計(jì)目的基因特異性定量引物(T3和T4)。以茶樹GAPDH[21]為內(nèi)參基因(T5和T6),熒光定量反應(yīng)體系TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa, Code No. RR820A) 10 μL,特異引物各1 μL(4 μmol/L),cDNA 模板1 μL(50 ng/μL),加雙蒸水到7 μL,終體積 20 μL。充分混勻,短暫離心后,于 ABI7500 Fast 實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,參數(shù)為:95 ℃ 3 min預(yù)變性;95 ℃ 10 s,60 ℃ 20 s,72 ℃10 s,40個(gè)循環(huán),每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光信號,每個(gè)反應(yīng)設(shè)3次生物學(xué)重復(fù),2個(gè)技術(shù)重復(fù),最后采用2-ΔΔCt法來計(jì)算基因相對表達(dá)量,并采用ANOVA進(jìn)行Duncan′s多重比較分析,顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹CsNPF5基因gDNA和cDNA序列的克隆

利用引物T1和T2分別在茶樹葉片gDNA和氮素處理茶樹葉片cDNA文庫中,進(jìn)行茶樹CsNPF5基因gDNA和cDNA序列PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物分別經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳,擴(kuò)增產(chǎn)物長度在1 000～2 000 bp(圖1),經(jīng)測序確認(rèn),以gDNA為模板的PCR擴(kuò)增,獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為2 096 bp,而以cDNA為模板,獲得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為1 440 bp。在NCBI數(shù)據(jù)庫中用ORF Finder分析擴(kuò)增基因序列的編碼框,經(jīng)檢索ORF Finder分析測序,cDNA序列恰好包含一個(gè)完整基因編碼框,即擴(kuò)增基因cNDA全長為1 440 bp,編碼479個(gè)氨基酸(圖2)。通過拼接PCR擴(kuò)增的基因gDNA和cDNA序列,指出該基因包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子(圖3),經(jīng)比對NCBI數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該基因序列與中華獼猴桃NPF8.1(GenBank:PSS34634.1)具有較高的相似性,達(dá)79.54%,檢索茶樹基因組數(shù)據(jù)庫(TPIA)NPF同源基因,發(fā)現(xiàn)該基因是位于茶樹1號染色體上的第5個(gè)NPF基因,故將其命名為CsNPF5。

M.2000 bp DNA Ladder;1.以cDNA為模板目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物;2.以gDNA為模板目的基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。M.2 000 bp DNA Ladder;1.The PCR amplification product,which was obtained by using cDNA as a template to amplify the target gene;2.The PCR amplification product,which was obtained by using gDNA as a template to amplify the target gene.圖1 CsNPF5基因PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of CsNPF5 gene

陰影部分.指示PTR2結(jié)構(gòu)域在CsNPF5蛋白上的分布;紅色的ATG.起始密碼子;*.終止密碼子。Shaded area.Indicates the distribution of the PTR2 domain in CsNPF5 protein;Red ATG.Initiation codon;*.Termination codon.圖2 CsNPF5基因序列特征Fig.2 Sequence characteristics of CsNPF5 gene

圖3 CsNPF5基因結(jié)構(gòu)Fig.3 Gene structure of CsNPF5

2.2 CsNPF5 的染色體定位

以gDNA為模板的PCR擴(kuò)增的CsNPF5序列作為搜索序列,在茶樹基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Blast同源搜索,得到一個(gè)與CsNPF5基因序列完全相同的基因座(TEA015944.1)序列,獲得CsNPF5基因座物理位置信息為Chr1:226371356—226373449(-),指出CsNPF5基因定位于茶樹1號染色體上,且為單拷貝基因。

2.3 CsNPF5基因及其編碼蛋白序列分析

開放閱讀框分析指出,CsNPF5基因開放閱讀框全長為1 400 bp,編碼479個(gè)氨基酸,相對分子量53.12 ku,等電點(diǎn)7.13,包含一個(gè)PTR2保守結(jié)構(gòu)域?；蚪Y(jié)構(gòu)分析指出,CsNPF5基因的3個(gè)外顯子長度分別為540,48,844 bp,2個(gè)內(nèi)含子大小為105,549 bp。InterPro在線工具對CsNPF5基因編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析表明,CsNPF5蛋白的第2—403位氨基酸具有NPF蛋白家族共有的PRT2保守結(jié)構(gòu)域。對CsNPF5基因內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)進(jìn)行分析,結(jié)果表明,該基因的內(nèi)含子都符合經(jīng)典的GT-AG剪切法則,且CsNPF5基因的PRT2結(jié)構(gòu)域包含一個(gè)內(nèi)含子,這與植物NPF基因的內(nèi)含子分布模式一致。同時(shí)PSORT在線工具預(yù)測CsNPF5蛋白的亞細(xì)胞定位,結(jié)果指出CsNPF5蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中,這表明該蛋白具有在植物細(xì)胞核外行使功能的潛力。同時(shí)TMHMM分析結(jié)果表明,CsNPF5蛋白具有7個(gè)跨膜區(qū),符合NPF蛋白家族具有多跨膜區(qū)細(xì)胞核外行使功能的特征。

2.4 CsNPF5基因編碼蛋白的同源性及系統(tǒng)進(jìn)化分析

以CsNPF5蛋白的氨基酸序列為搜索序列,用Blast搜索NCBI數(shù)據(jù)庫中與CsNPF5蛋白同源的蛋白,將搜索得到的不同物種中的同源蛋白用DNAMAN進(jìn)行序列比對,發(fā)現(xiàn)CsNPF5蛋白與已報(bào)道的茶樹(Camelliasinensis)、中華獼猴桃(Actinidiachinensis)、雷公藤(Tripterygiumwilfordii)、茸毛煙草(Nicotianatomentosiformis)、甜櫻桃(Prunusavium)、辣椒(Capsicumannuum)、中華辣椒(Capsicumchinense)、毛果楊(Populustrichocarpa)、木薯(Manihotesculenta)、葡萄(Vitisvinifera)、野生番茄(Solanumpennellii)、馬鈴薯(Solanumtuberosum)、月季(Rosachinensis)和歐洲草莓(Fragariavesca)中的NPF蛋白均具有同源性,聚類分析指出,這些NPF蛋白可分三類,其中茶樹CsNPF與中華獼猴桃NPF蛋白相似性較高,達(dá)79.54%,聚在同一進(jìn)化支(圖 4),進(jìn)一步表明CsNPF5保守的PRT2結(jié)構(gòu)與經(jīng)典的植物NPF結(jié)構(gòu)是一致的。

節(jié)點(diǎn)自展值小于50%不顯示。The bootstrap values of nodes less than 50% is not displayed.圖4 不同植物中CsNPF5同源蛋白的聚類分析Fig.4 Phylogenetic analysis of CsNPF5 orthologous proteins from different plants

2.5 氮素處理下茶樹CsNPF5基因表達(dá)分析

不同小寫字母表示不同氮素處理下CsNPF5表達(dá)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant differences(P<0.05)of CsNPF5 expression under different nitrogen treatments.圖5 不同氮素處理下CsNPF5的相對表達(dá)模式Fig.5 Expression patterns of CsNPF5 gene under different nitrogen treatments

3 結(jié)論與討論

植物中轉(zhuǎn)運(yùn)硝態(tài)氮的基因家族成員,功能不盡相同。PtNRTs基因在白楊的不同組織具有不同的表達(dá)模式,表明這些基因在白楊代謝過程中起著不同的作用[22]。硝態(tài)氮誘導(dǎo)能夠激活或抑制轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族中成員的表達(dá)。在擬南芥的根和葉中,AtNRT1.1、AtNRT2.1和AtNRT2.2能夠被硝態(tài)氮強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá),AtNRT2.4雖被誘導(dǎo),但是表達(dá)量差異不顯著,AtNRT2.5的表達(dá)則會被氮素抑制[23]。茶樹中,硝態(tài)氮誘導(dǎo)下,CsNRT1.1和CsNRT1.2幼嫩葉中表達(dá)量上升,CsNRT1.7在成熟葉中表達(dá)量上升,CsNRT2.4則會在根中大量表達(dá)[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,CsNPF5在葉中的表達(dá)受到硝態(tài)氮的誘導(dǎo)。且硝態(tài)氮濃度越高,CsNPF5達(dá)到表達(dá)量的頂峰的時(shí)間就越快。硝態(tài)氮濃度越高,可能硝態(tài)氮受體就越容易感受到硝態(tài)氮信號,作為下游基因的CsNPF5表達(dá)也更快。目前,對植物感受硝態(tài)氮信號并作出響應(yīng)的機(jī)制的研究已取得很大的進(jìn)展。環(huán)核苷酸門控通道(CNGC)是動植物中普遍存在的離子通道[24]。擬南芥中,NRT1.1蛋白與CNGC15蛋白在質(zhì)膜上形成復(fù)合物,抑制CNGC15的Ca2+通道活性,NRT1.1感受到外界硝態(tài)氮信號后,NRT1.1-CNGC15復(fù)合物解離,CNGC15恢復(fù)正常功能,鈣離子內(nèi)流,隨之,轉(zhuǎn)錄因子NLP7被蛋白激酶磷酸化,進(jìn)入細(xì)胞核激活一級硝態(tài)氮響應(yīng)[25]。一般可認(rèn)為外界1 mmol/L的硝態(tài)氮濃度是硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白高低親和系統(tǒng)轉(zhuǎn)換的分界線[26]。本試驗(yàn)中,在0.2,10 mmol/L的NO3-離子處理下,CsNPF5基因表達(dá)量都出現(xiàn)了一定程度的上調(diào)。說明該基因可能是雙親和的硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。

茶樹CsNRT2.4基因在擬南芥中過表達(dá),可以增加擬南芥的根長、鮮質(zhì)量以及根在低氮素水平下的氮素吸收效率,提高氮素利用率[18]。CsNRT2.4和CsNRT3.2在中茶108和龍井43均會被硝酸鹽誘導(dǎo)表達(dá),但與中茶108相比,龍井43中的CsNRT2.4和CsNRT3.2表達(dá)量更高,說明龍井43的對外界氮素的響應(yīng)更快[27]。有研究表明,龍井43屬于氮高效茶樹品種[28]。說明CsNRT2.4和CsNRT3.2表達(dá)量可以反映某一茶樹品種硝態(tài)氮的吸收能力[27]。對CsNPF5是否能反映某一茶樹品種的硝態(tài)氮吸收能力,還有待進(jìn)一步研究。不過NO3-的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過程,涉及同化、運(yùn)輸和信號傳遞的多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的步驟,往往通過幾個(gè)基因的表達(dá)量的差異看不出該品種是否為氮高效的茶樹品種。因此,為了選育耐低氮和氮高效的茶樹品種,還需要對硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)的基因或者蛋白進(jìn)行系統(tǒng)的研究。