王 瑩,王曉宇,孫德慧,霍紅雁,劉海臣,徐 惠,張繼星

(內(nèi)蒙古民族大學(xué) 生命科學(xué)與食品學(xué)院,內(nèi)蒙古 通遼 028000)

目前,土壤鹽分是植物最主要的非生物脅迫之一,土壤鹽漬化日益嚴(yán)重,已經(jīng)成為影響我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素[1]。土壤鹽漬化問(wèn)題在我國(guó)干旱半干旱地區(qū)表現(xiàn)得尤為嚴(yán)重,且體現(xiàn)出鹽漬化程度高、鹽堿地分布范圍廣、種類復(fù)雜多樣的特點(diǎn),嚴(yán)重阻礙了土地地力的提升,且對(duì)我國(guó)土地的利用產(chǎn)生了巨大危害[2]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),世界鹽堿地面積超過(guò)900萬(wàn)hm2,占干旱和半干旱地區(qū)總面積的39%,幾乎占世界陸地面積的6.5%[3]。與此同時(shí),隨著人類活動(dòng)對(duì)自然環(huán)境產(chǎn)生的影響,伴隨著不合理的灌溉與施肥等農(nóng)事操作也使得土壤鹽漬化面積正在逐年增加[4]。植物有多種方式抵御鹽脅迫,其中鈣依賴蛋白激酶(CDPK)利用多種信號(hào)途徑參與調(diào)控離子通道相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)整氣孔運(yùn)動(dòng)來(lái)適應(yīng)植物對(duì)鹽的耐受性。目前,已經(jīng)在植物提取物中發(fā)現(xiàn)的大量鈣刺激的蛋白激酶活性就與CDPKs相關(guān),它可解碼植物體內(nèi)的Ca2+信號(hào),從而提高蛋白激酶活性[5]。有研究表明,在過(guò)量表達(dá)的植物中,擬南芥鈣依賴蛋白激酶基因AtCPK6中幾種脅迫調(diào)控基因的表達(dá)水平發(fā)生了變化從而提高了對(duì)鹽脅迫的耐受性[6]。CDPK可以通過(guò)調(diào)節(jié)ABA信號(hào)傳導(dǎo)和減少活性氧(ROS)的積累來(lái)正向或負(fù)向調(diào)節(jié)鹽脅迫耐受性[7]。蓖麻(Ricinuscommunis)是大戟科蓖麻屬一年生或多年生草本植物,具有很高的利用價(jià)值,其籽油中含有豐富的蓖麻油酸,在航空航天和工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用[8]。蓖麻還具有耐瘠薄、耐干旱、耐鹽堿、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn),可以在貧瘠的邊際土地上生長(zhǎng),不與糧爭(zhēng)地,并能作為土壤改良作物,有效解決我國(guó)現(xiàn)階段耕地面積不足和土壤鹽堿化等問(wèn)題[9-11]。本研究基于蓖麻轉(zhuǎn)錄組信息,克隆蓖麻鈣依賴蛋白激酶29基因(RcCDPK29)并分析其在鹽處理下的表達(dá)量,同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析,構(gòu)建RcCDPK29雙元表達(dá)載體,以期為研究RcCDPK29基因的生物學(xué)功能提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為蓖麻哲蓖3號(hào),該品種是通遼市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院育成的高產(chǎn)抗病優(yōu)良品種。將蓖麻種子置于腐殖質(zhì)土壤待長(zhǎng)至二葉期時(shí),用300 mmol/L鹽處理 0,2,6,8,12,24 h 后,分別取根、莖、葉置于液氮中速凍,-80 ℃ 超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 植物總RNA的提取及cDNA合成

總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR 高保真酶購(gòu)自大連寶生物 (TaKaRa)公司,膠回收試劑盒、2×Es Taq Master Mix 購(gòu)自康維世紀(jì)公司,其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 蓖麻RcCDPK29基因的克隆

通過(guò)對(duì)蓖麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,獲得候選RcCDPK29全長(zhǎng)序列,根據(jù)其CDS序列設(shè)計(jì)特異性引物RcCDPK29-F、RcCDPK29-R(表1),并加入表達(dá)載體酶切位點(diǎn),由北京六合華大基因公司合成。參照購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司的2 × Es Taq Master Mix 說(shuō)明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng),體系及程序條件見表2。利用購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司的0.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的條帶,連接至pMDTM19-T Simple Vector,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌Top10感受態(tài)中,涂于藍(lán)白斑篩選培養(yǎng)基后挑取單菌落,PCR檢測(cè)陽(yáng)性菌送至北京六合華大基因公司測(cè)序。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

表2 PCR反應(yīng)體系及條件Tab.2 PCR reaction system and conditions

1.4 序列分析

使用DNAMAN軟件獲得RcCDPK29CDS序列所對(duì)應(yīng)的氨基酸序列。在NCBI和InterProScan 上進(jìn)行蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi,https://www.ebi.ac.uk/interpro/);通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)該蛋白基本理化性質(zhì)進(jìn)行分析;SOMPA在線工具分析該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa%20_sopma.html);通過(guò)ProtScale Sever在線軟件分析該蛋白的疏水性(https://web.expasy.org/protscale/);通過(guò)SWISS-MODEL在線軟件分析該蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)(https://swissmodel.expasy.org/);結(jié)合NCBI-Blast在線搜索與RcCDPK29相似度較高的其他蛋白序列,并利用DNAMAN軟件進(jìn)行序列相似性比對(duì)。TMHMM Server v.2.0軟件預(yù)測(cè)RcCDPK29蛋白是否存在跨膜結(jié)構(gòu)域(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)。

1.5 植物表達(dá)載體構(gòu)建

將測(cè)序成功的陽(yáng)性菌液進(jìn)行擴(kuò)搖,提取質(zhì)粒后,應(yīng)用限制性內(nèi)切酶SmaⅠ和XbaⅠ將該質(zhì)粒與表達(dá)載體pCG-3300進(jìn)行雙酶切,T4連接酶酶切產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)Top10細(xì)胞中,通過(guò)Kan抗性篩選陽(yáng)性菌,擴(kuò)搖后提質(zhì)粒,進(jìn)行重組質(zhì)粒PCR鑒定和雙酶切鑒定,酶切體系見表3。0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)、回收目的條帶,并在反應(yīng)條件為16 ℃下過(guò)夜連接,連接體系見表3。用熱激法將10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10感受態(tài)中,涂板培養(yǎng)過(guò)夜后挑取單菌落,37 ℃ 180 r/min振蕩培養(yǎng)4 h,利用菌液PCR陽(yáng)性菌進(jìn)行雙酶切鑒定。

表3 雙酶切體系及連接體系Tab.3 Double enzyme digestion system and ligation reaction system

1.6 熒光定量PCR分析

根據(jù)測(cè)序獲得的RcCDPK29堿基序列,應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)特異性引物qRcCDPK29(表1)。以蓖麻RcSKIP和RcADP基因?yàn)閮?nèi)參,檢測(cè)蓖麻根、莖、葉中RcCDPK29在鹽處理?xiàng)l件下0,2,6,8,12,24 h的表達(dá)量,PCR反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);72 ℃ 30 s。循環(huán)后增加熔解曲線。每個(gè)樣品3次重復(fù),用2-ΔΔCT方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻RcCDPK29的全長(zhǎng)獲得與序列分析

以哲蓖3號(hào)蓖麻葉片cDNA為模板,PCR擴(kuò)增并測(cè)序后獲得1 590 bp的CDS序列(圖1),編碼528個(gè)氨基酸(圖2)。結(jié)合NCBI和InterProScan[13]在線預(yù)測(cè)工具對(duì)蓖麻RcCDPK29蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析(圖3),RcCDPK29蛋白具有5個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,分別是在81—338位的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和 4個(gè)EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域 (385—413,421—449,457—485,492—520)。結(jié)合DNAMAN軟件對(duì)6個(gè)植物一致性較高的鈣依賴蛋白激酶CDPK29氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析(圖4),蓖麻(Ricinuscommunis)的RcCDPK29氨基酸序列與毛果楊(Populustrichocarpa)、石榴(Punicagranatum)、麻瘋樹(Jatrophacurcas)、巴西橡膠樹(Heveabrasiliensis)、木薯(Manihotesculenta)、柑橘(Citrussinensis)的CDPK29氨基酸序列一致性均在75%以上,其中與麻瘋樹一致性最高,為82.29%。

M．DL2000 DNA Marker;1—2．PCR結(jié)果。圖9—10同。M．DL2000 DNA Marker;1—2．PCR results．The same as Fig.9—10.圖1 蓖麻RcCDPK29基因 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 PCR products of RcCDPK29 gene in Ricinus communis

方框.EF-hand結(jié)構(gòu)域。The boxes.EF-hand domains.圖2 RcCDPK29 基因CDS序列推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 RcCDPK29 CDS sequence and its deduced amino acid sequence

圖3 RcCDPK29蛋白保守區(qū)預(yù)測(cè)Fig.3 Prediction of RcCDPK29 conserved domains

圖4 蓖麻與其他植物CDPK29序列一致性對(duì)比Fig.4 Identity comparison of CDPK29 sequences between Ricinus communis and other plants

2.2 RcCDPK29理化性質(zhì)和蛋白結(jié)構(gòu)分析

對(duì)蓖麻RcCDPK29基因進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測(cè)分析,該基因編碼的蛋白分子量為59.74 ku,等電點(diǎn)(pI)值為6.21。該蛋白由228個(gè)α-螺旋、45個(gè)β-轉(zhuǎn)角、203個(gè)無(wú)規(guī)則卷曲以及52個(gè)延伸鏈構(gòu)成,α-螺旋在該蛋白中起重要作用(圖5)。使用SWISS-MODEL[14]在線軟件預(yù)測(cè)蓖麻RcCDPK29蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。同源建模結(jié)果顯示(圖6),RcCDPK29與擬南芥CDPK(SMTL ID:3q5i．1)相似度為40.41%,具有較高可信度(>30%)。經(jīng)TMHMM[15]在線軟件預(yù)測(cè)分析RcCDPK29不存在跨膜結(jié)構(gòu)域,是典型的非跨膜蛋白(圖7)。利用ProtScale Sever[16]在線軟件分析蛋白疏水性顯示,RcCDPK29蛋白的528個(gè)氨基酸中,最大的親水性系數(shù)為2.778,最小的親水性系數(shù)為-3.133,平均親水性系數(shù)為-0.355,進(jìn)一步表明該蛋白屬于親水性蛋白(圖8)。

h．α-螺旋;e．延伸鏈;t．β-轉(zhuǎn)角; c．無(wú)規(guī)則卷曲。h． Alpha helix;e．Extended strand;t．Beta turn;c．Random coil．圖5 RcCDPK29蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Secondary structure prediction of RcCDPK29

圖6 RcCDPK29蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 RcCDPK29 protein tertiary structure prediction

圖7 RcCDPK29蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.7 Transmembrane structure prediction of RcCDPK29 protein

圖8 RcCDPK29蛋白的疏水性分析Fig.8 Hydrophobic analysis of RcCDPK29 protein

2.3 RcCDPK29雙元表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖9)顯示,重組質(zhì)粒明顯大于酶切后表達(dá)載體電泳條帶,酶切后目的片段大小與RcCDPK29序列大小一致(圖10),植物表達(dá)載體構(gòu)建成功。

圖9 表達(dá)載體重組質(zhì)粒檢測(cè)Fig.9 Expression vector recombinant plasmid assay

圖10 表達(dá)載體雙酶切鑒定Fig．10 Expression vector double digestion detection identification

2.4 RcCDPK29在不同組織和不同脅迫時(shí)間的表達(dá)分析

對(duì)蓖麻根、莖、葉進(jìn)行多時(shí)間點(diǎn)組織特異性分析,由圖11可知,RcCDPK29基因主要在莖中表達(dá),鹽處理12 h表達(dá)量最高。隨著鹽處理時(shí)間的延長(zhǎng),RcCDPK29基因根的表達(dá)量逐漸下降,分別在2,8,24 h達(dá)到最低,與0 h差異顯著;葉在2 h的表達(dá)量最低且與0 h相比差異顯著。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。Different lowercase letters indicate significant difference.圖11 RcCDPK29 在蓖麻根(A)、莖(B)、葉(C)中不同處理時(shí)間的表達(dá)量測(cè)定Fig.11 Determination of expression of RcCDPK29 at different processing times in Ricinus communis root(A),stem(B),leaf(C)

3 結(jié)論與討論

CDPK對(duì)植物抗鹽脅迫有正調(diào)節(jié)的作用[17-18],其下游的信號(hào)通路與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有著復(fù)雜而緊密的聯(lián)系。CDPK作為一種直接受鈣離子調(diào)節(jié)的蛋白激酶,在信號(hào)通路中處于關(guān)鍵位置。研究證明,CDPK通常以單肽鏈形式存在,結(jié)構(gòu)高度保守,從肽鏈的N端到C端存在4個(gè)功能區(qū)結(jié)構(gòu)域,依次為可變區(qū)、催化區(qū)、連接區(qū)和調(diào)控區(qū)[19]。每個(gè)結(jié)構(gòu)域的氨基酸數(shù)量、同源性和功能都不同。其中,催化區(qū)和連接區(qū)同源性都比較高,催化區(qū)又稱蛋白激酶區(qū),具有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶保守序列。連接區(qū)也有很重要的功能,當(dāng)缺乏Ca2+時(shí),連接區(qū)可能會(huì)與催化區(qū)結(jié)合,導(dǎo)致蛋白激酶活性被抑制。調(diào)控區(qū)是CDPK基因區(qū)別于其他激酶特有的區(qū)域,具有與鈣離子結(jié)合的EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域[20]。本研究對(duì)獲得的RcCDPK29基因序列進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn),該序列包含有典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域以及EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域。蛋白激酶區(qū)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶結(jié)構(gòu)域中81—338位氨基酸處是蛋白激酶結(jié)構(gòu)域,為催化區(qū),是所有CDPK蛋白中都具有的典型亞結(jié)構(gòu)[17],201—213 位氨基酸處的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性域處于該區(qū)域中;調(diào)控區(qū)在385—520位氨基酸附近,包括385—413,421—449,457—485,492—520個(gè)氨基酸處的4個(gè)EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域,是鈣結(jié)合區(qū),也是CDPK有別于其他類激酶的特有區(qū)域[21],其結(jié)構(gòu)和功能類似于鈣調(diào)素(CaM)的氨基酸序列,這是CDPK對(duì)Ca2+高度親和而不依賴于鈣調(diào)素的原因[19]。

蓖麻為適應(yīng)各種外界環(huán)境刺激形成了復(fù)雜的逆境脅迫信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制,其中Ca2+作為第二信使主要參與植物非生物脅迫信號(hào)的傳導(dǎo),Ca2+通過(guò)鈣結(jié)合蛋白介導(dǎo)將脅迫信號(hào)傳遞到調(diào)控通路的下游,鈣依賴蛋白激酶(CDPK)作為鈣結(jié)合蛋白之一在植物抵抗逆境脅迫的調(diào)控反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[22]。從蓖麻中分離得到了RcCDPK29基因,利用生物信息學(xué)方法對(duì)該基因分析后發(fā)現(xiàn)它與其他6個(gè)物種的CDPK家族成員在氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)上存在較大的相似性,具有CDPK家族典型的類鈣調(diào)素結(jié)合域,這也是CDPKs與其他類型蛋白激酶存在區(qū)別的區(qū)域[23]。CDPK普遍存在于植物體的各個(gè)細(xì)胞、組織或器官[24-26]。有些CDPK在植物中廣泛表達(dá),有些在器官或組織中表達(dá)程度不同,甚至特異性不同。RcCDPK29基因的表達(dá)具有組織特異性,這一表達(dá)特性也存在于其他植物中的CDPKs,例如小麥TaCDPK13基因在葉、幼穗以及未成熟的種子中表達(dá),而在根、莖中則未見表達(dá)[27];擬南芥AtCPK17和AtCPK34基因主要在花粉管形成期表達(dá),并參與調(diào)控花粉管的生長(zhǎng)[28];水稻OsCDPK6基因在花粉管形成階段轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[29];油菜BnCDPK1在葉片中的表達(dá)水平最高,在油菜花中的表達(dá)水平很低,在種子等其他組織中的表達(dá)水平則中等[30];在甜瓜中除CmCDPK3外,所有鑒定出的CmCDPK均在根、莖、葉、雄花和卷須這5種組織中至少有一種表達(dá),部分CmCDPK在雄花中高表達(dá)[31]。

本研究在蓖麻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上,克隆RcCDPK29基因,構(gòu)建雙元表達(dá)載體,分析該基因理化性質(zhì),并預(yù)測(cè)RcCDPK29蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu),結(jié)果表明,蓖麻RcCDPK29與麻瘋樹等6個(gè)植物CDPK29的氨基酸序列具有較高一致性。蓖麻CDPK基因序列的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明, RcCDPK為親水蛋白,無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。氨基酸序列包含5個(gè)結(jié)構(gòu)域,1個(gè)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域和 4個(gè)EF-hand鈣結(jié)合結(jié)構(gòu)域。通過(guò)qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn),RcCDPK29主要在蓖麻的莖和葉中表達(dá)。本研究為進(jìn)一步明確蓖麻耐鹽調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ),對(duì)探索蓖麻抵御鹽脅迫的機(jī)制具有一定借鑒意義。