王 鵬,田哲娟,趙雪芳,康 忱,吳志明,2,李亞棟,2,黃冀楠

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院 經(jīng)濟(jì)作物研究所,河北 石家莊 050051;2.河北省蔬菜工程技術(shù)研究中心,河北 石家莊 050051; 3.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所,河北 石家莊 050035)

番茄(Solanumlycopersicum)是喜溫蔬菜,在全世界范圍內(nèi)廣泛種植。其生長發(fā)育所需的最適溫度在18～25 ℃,對(duì)低溫比較敏感。低溫脅迫嚴(yán)重影響番茄植株健康,甚至導(dǎo)致植株死亡[1]。冬春季節(jié),設(shè)施種植的番茄極易受到低溫影響,番茄品質(zhì)和產(chǎn)量無法得到保證,低溫限制了番茄的周年連續(xù)生產(chǎn)[2]。因此,生產(chǎn)上迫切需要耐寒的番茄品種,開展番茄耐寒研究和選育新品種顯得尤為重要。

鈣是植物體生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素,鈣離子(Ca2+)是一種重要的第二信使,在植物生長發(fā)育和抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Ca2+的濃度變化可以精確反映外部環(huán)境和內(nèi)源激素的變化,是啟動(dòng)鈣離子信號(hào)通路的中心環(huán)節(jié)[3-4]。鈣調(diào)蛋白(Calmodulin,CaM)是一種分布廣、功能多、分子結(jié)構(gòu)保守的Ca2+靶蛋白,在鈣離子信號(hào)途徑中扮演重要角色。CaM通常由149個(gè)氨基酸組成,含有4個(gè)能夠與Ca2+結(jié)合的螺旋環(huán)螺旋(Helix-loop-helix)構(gòu)成的EF-hand結(jié)構(gòu)域[5-6]。CaM可以與Ca2+結(jié)合來影響Ca2+濃度,同時(shí)結(jié)合后所形成的復(fù)合體還可以激活鈣離子信號(hào)通路中一系列下游蛋白,進(jìn)而調(diào)控植物生長發(fā)育及反應(yīng)外界刺激[7-8]。

大量研究證明,CaM在植物響應(yīng)低溫脅迫中具有非常重要的作用。Ca2+-CaM介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑通過與NO、活性氧系統(tǒng)(ROS)以及MAPKs(Mitogen-activated protein kinases)交互作用,進(jìn)而建立植物的耐低溫應(yīng)答[9]。天山雪蓮SikCML7參與了天山雪蓮對(duì)低溫、干旱和鹽脅迫響應(yīng)的過程[10]。在麻風(fēng)樹(JatrophacurcasL.)中證實(shí)CaM可通過提高植株脯氨酸含量,進(jìn)而改善植株的低溫耐受性[11]。近年來,通過生物技術(shù)手段,進(jìn)一步證明CaM在提高植物的抗低溫脅迫上的重要作用。Zhang等[12]將一種南極魚的CaM基因片段轉(zhuǎn)入煙草后,可顯著增加轉(zhuǎn)基因植株在0 ℃或4 ℃下的PS Ⅱ光合效率,明顯提高轉(zhuǎn)基因植株的抗低溫能力。在番茄中,類CaM蛋白SlCML37過表達(dá)可顯著改善了果實(shí)的低溫耐受性[13];而過表達(dá)SlCML44的番茄植株表現(xiàn)出優(yōu)異的耐低溫能力,低溫脅迫下種子萌發(fā)率和幼苗生長情況顯著優(yōu)于對(duì)照植株[14]。Zhao等[15]鑒定的番茄CaM基因家族中發(fā)現(xiàn)SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列雖然不同,但卻能編碼相同的蛋白,并對(duì)多種脅迫刺激具有高敏感性。然而利用CaM基因探討番茄耐寒性的研究卻鮮有報(bào)道。

目前,番茄耐寒品種的選育工作仍以常規(guī)雜交育種為主,具有選育時(shí)間長、雜交不親和等缺點(diǎn)。CaM在眾多植物耐低溫方面的貢獻(xiàn)為番茄耐寒品種的選育提供了新的思路。針對(duì)SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列和蛋白序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析,并預(yù)測啟動(dòng)子順勢(shì)作用元件。利用qRT-PCR技術(shù)探究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在不同番茄品種中低溫脅迫下的表達(dá)模式。以期為CaM基因在番茄耐低溫方面應(yīng)用,培育番茄新品種提供技術(shù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

以番茄品種Heinz1706、LA3969、冀粉2號(hào)、冀粉3號(hào)和農(nóng)博粉霸15為試驗(yàn)材料。其中Heinz1706和LA3969引自TGRC(Tomato Genetics Resource Center,番茄遺傳資源中心);冀粉2號(hào)和冀粉3號(hào)為河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所生物技術(shù)室選育,對(duì)低溫具有較高耐受性;農(nóng)博粉霸15為石家莊農(nóng)博士科技開發(fā)有限公司(河北)培育的商用品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 處理方法 分別選取飽滿、大小一致的供試材料種子20粒,經(jīng)消毒、殺菌后于2020年10月16日浸種,10月21日播種于日光溫室。模擬田間環(huán)境(25 ℃,光周期12 h/12 h,光照強(qiáng)度為50 000 lx,相對(duì)濕度60%)培養(yǎng)生長21 d。①取Heinz1706品種幼苗葉片組織保存于-80 ℃,提取RNA用于克隆SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因。②5種供試材料各選取長勢(shì)一致的植株10株,分為2批,每批材料5株,分別轉(zhuǎn)移至5, 15 ℃的培養(yǎng)箱中,光周期均設(shè)置為12 h/12 h,光照強(qiáng)度為50 000 lx,相對(duì)濕度60%,處理至0 ,0.25,0.5,1,2,4,8,12,24,48 h時(shí)取幼苗葉片于-80 ℃保存,提取RNA,上述處理每組取3次生物學(xué)重復(fù),用于研究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式。

1.2.2 總RNA 提取及反轉(zhuǎn)錄 按照Plant Total RNA Isolation Kit 試劑盒(成都福際生物技術(shù)有限公司)說明要求提取上述所取材料的總RNA,使用NanoDrope 2000微量紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA濃度和質(zhì)量,使用Prime Script RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,并將濃度稀釋為100 ng/μL,置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的克隆SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的CDS序列參照參考文獻(xiàn) [15]。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的cDNA序列收集自SGN數(shù)據(jù)庫(https://solgenomics.net/),對(duì)應(yīng)的序列編號(hào)分別為Solyc10g077010.1.1、Solyc11g072240.1.1和Solyc12g099990.1.1。利用Primer Premier 5.0軟件跨基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)特異性PCR引物(表 1)。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

以Heinz1706品種幼苗葉片cDNA為模板,利用SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。按照EasyTaq?DNA Polymerase(北京全式金生物技術(shù)有限公司)說明要求配置PCR擴(kuò)增體系(25 μL):10×EasyTaq? Buffer 2.5 μL,dNTPs(2.5 mmol/L) 2 μL,EasyTaq? DNA Polymerase 0.3 μL,正向引物(10 μmol/L) 1 μL,反向引物(10 μmol/L) 1 μL,模板cDNA(100 ng/μL) 2 μL,加ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit(OMEGA)試劑盒回收目的片段。并由華大基因(北京)測序。

1.2.4 番茄CaM3、CaM4和CaM5氨基酸序列分析 利用DNAMAN(ver.6.0)軟件將SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因翻譯為蛋白質(zhì)序列,利用Protparam軟件(https://web.expasy.org/protparam/)進(jìn)行蛋白理化性質(zhì)分析,利用在線SOPMA工具(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),通過NCBI中的CDD(Conserved domain database)數(shù)據(jù)庫和SMART在線結(jié)構(gòu)域篩查工具(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.5 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析 參考番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的CDS序列及基因組序列,截取起始密碼子上游2 kb的基因組序列認(rèn)定為啟動(dòng)子序列。利用PlantCARE在線工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進(jìn)行啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件預(yù)測分析。

1.2.6 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因在低溫脅迫下的表達(dá)模式及組織表達(dá)分析 根據(jù)SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的cDNA序列,避開保守片段,在各自的特異性區(qū)域內(nèi)設(shè)計(jì)qRT-PCR引物(表1),以1.2.1中所述材料的cDNA為模板,以番茄β-actin基因?yàn)閮?nèi)參進(jìn)行qRT-PCR分析。反應(yīng)體系(10 μL):2 × SYBR premix EX Taq(TaKaRa) 5 μL,正向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,反向引物(10 μmol/L) 0.5 μL,模板cDNA(100 ng/μL)1 μL,加ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 預(yù)變性30 s;95 ℃ 變性5 s,60 ℃ 退火30 s,45個(gè)循環(huán);95 ℃ 變性30 s,60 ℃ 退火1 min,95 ℃ 變性15 s。每種材料設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù),每個(gè)樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù),最終結(jié)果采用2-ΔΔCT法計(jì)算分析,其中,以各基因在0 h,即尚未進(jìn)行脅迫處理時(shí)的表達(dá)量為對(duì)照,設(shè)為“1”[16]。使用SPSS 20.0進(jìn)行顯著性分析。

于番茄功能基因組數(shù)據(jù)庫(http://ted.bti.cornell.edu/cgi-bin/TFGD/digital/home.cgi)中下載番茄栽培種Heinz1706不同組織的RNA-seq測序數(shù)據(jù)(D004),提取SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同組織中的表達(dá)數(shù)據(jù),導(dǎo)入MeV軟件,生成表達(dá)熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因的克隆

以番茄栽培種Heinz1706幼苗葉片組織的cDNA為模板,分別擴(kuò)增SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的CDS序列,產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,發(fā)現(xiàn)3次擴(kuò)增反應(yīng)均產(chǎn)生一條接近500 bp的特異性條帶。回收測序分析表明,三者長度均為450 bp,具有連續(xù)完整的開放閱讀框(Open Reading Frame,ORF),編碼149個(gè)氨基酸。核酸序列比對(duì)(圖1)發(fā)現(xiàn)3條序列僅有較小差異,相似度為93.63%,而其編碼的氨基酸序列完全相同。

圖1 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因序列比對(duì)Fig.1 Sequence multi-alignment of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5

2.2 氨基酸序列分析

對(duì)SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因所編碼的相同的蛋白序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析,發(fā)現(xiàn)其蛋白長度為149個(gè)氨基酸,分子式為C721H1133N189O254S10,相對(duì)分子質(zhì)量為16.83 ku;由20種氨基酸組成,其中酸性氨基酸Asp和Glu的含量最多,分別為13.4%和12.1%,堿性氨基酸(Arg和Lys)占10.06%,理論等電點(diǎn)4.1,為酸性蛋白;不穩(wěn)定系數(shù)24.43,為穩(wěn)定蛋白;親疏水性分析結(jié)果顯示,該蛋白的平均疏水指數(shù)為-0.619,為親水性蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示,該蛋白由60.4%的α-螺旋、9.4%的β-折疊、6.04%的延伸鏈和24.16%的無規(guī)則卷曲組成;三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示(圖 2-A),該蛋白由較多α-螺旋構(gòu)成了類似骨棒狀結(jié)構(gòu),中間由較長的α-螺旋連接,棒狀結(jié)構(gòu)兩端分別含有2個(gè)鈣離子;對(duì)該蛋白結(jié)構(gòu)域分析發(fā)現(xiàn)(圖 2-B),該蛋白屬于PTZ00184家族,即CaM蛋白家族,另含有4個(gè)EF-h domain(鈣離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域),與三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致。

A.番茄CaM蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測;B.番茄CaM蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析。A.Predicted tertiary structure of CaM protein of tomato;B.Conservative domain of CaM protein of tomato.圖2 番茄CaM蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Predicted tertiarystructure and conservative domain of CaM protein of tomato

2.3 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析

為解析SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達(dá)模式,分別對(duì)3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,3個(gè)基因的啟動(dòng)子序列含有多種脅迫響應(yīng)和激素信號(hào)響應(yīng)的順勢(shì)元件(表 2),表明SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因雖然編碼同一個(gè)蛋白質(zhì),但各自的表達(dá)模式受到內(nèi)外多因素的共同調(diào)控。3個(gè)基因各自的啟動(dòng)子區(qū)除含有真核生物所必需的核心元件CAAT-box和TATA-box外,還含有如光信號(hào)響應(yīng)元件:G-box、GT1-motif和MRE;激素類信號(hào)應(yīng)答元件:ABRE(脫落酸信號(hào)響應(yīng)元件)、CGTCA-motif(茉莉酸信號(hào)響應(yīng)元件)、P-box(赤霉素信號(hào)響應(yīng)元件)、TATC-box(赤霉素信號(hào)響應(yīng)元件)、TCA-element(水楊酸信號(hào)響應(yīng)元件)、TGA-element(生長素信號(hào)響應(yīng)元件)和TGACG-motif(茉莉酸信號(hào)響應(yīng)元件);脅迫響應(yīng)元件:ARE(缺氧信號(hào)響應(yīng)元件)、LTR(低溫信號(hào)響應(yīng)元件)、MBS(干旱信號(hào)響應(yīng)元件)和TC-rich repeats(防御和脅迫信號(hào)響應(yīng)元件);另外在SlCaM3和SlCaM4基因的啟動(dòng)子區(qū)還鑒定到CAT-box(分生組織特異性表達(dá)元件),推測SlCaM3和SlCaM4可能在分生組織中特異性表達(dá)并發(fā)揮作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),SlCaM3基因啟動(dòng)子區(qū)所含順式作用元件的類型最為豐富,表明該基因在激素響應(yīng)和抵御非生物脅迫等活動(dòng)發(fā)揮著重要作用。橫向?qū)Ρ?個(gè)番茄CaM基因的順式元件分布情況發(fā)現(xiàn),多數(shù)元件呈互補(bǔ)模式分布,預(yù)示著CaM蛋白功能的多樣性。

表2 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的啟動(dòng)子序列順式作用元件分析Tab.2 Putative cis-element analysis in promoter regions of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5

2.4 番茄CaM3、CaM4和CaM5基因低溫脅迫下的表達(dá)模式

本研究共設(shè)置2個(gè)處理組:15,5 ℃,利用qRT-PCR技術(shù),以0 h(尚未進(jìn)行脅迫處理)的葉片cDNA樣品為對(duì)照,探究SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在多個(gè)番茄品種幼苗葉片組織中受低溫脅迫后一段連續(xù)時(shí)間內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,15 ℃處理(圖 3)時(shí),番茄品種Heinz1706的葉片中SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5的表達(dá)在受脅迫2h內(nèi)被抑制;4h之后表達(dá)量緩慢升高,其中SlCaM5基因表達(dá)上調(diào)較為明顯,SlCaM3和SlCaM4基因恢復(fù)至原有水平;LA3969的葉片中,SlCaM4基因在受到低溫刺激后0.25h內(nèi)表達(dá)量降低,之后其表達(dá)緩慢升高,在4h時(shí)顯示為上調(diào);SlCaM3和SlCaM5基因在受到脅迫后表達(dá)量持續(xù)升高,4h后尤為明顯,其中SlCaM5基因表達(dá)上調(diào)更為顯著。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在冀粉2號(hào)、冀粉3號(hào)和農(nóng)博粉霸15中的表達(dá)模式與在Heinz1706中的表達(dá)模式類似;縱觀全局發(fā)現(xiàn),SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在5種番茄材料中的表達(dá)模式均呈現(xiàn)出先降低后升高的趨勢(shì),值得注意的是,SlCaM5基因處理后期表達(dá)量升高更為顯著。

不同小寫字母表示基因表達(dá)差異顯著(P<0.05)。圖4同。Different lowercase indicate significant different(P<0.05).The same as Fig.4.圖3 15 ℃低溫脅迫下SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達(dá)模式Fig.3 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in response to 15 ℃ cold stress

5 ℃處理(圖 4)時(shí),SlCaM3基因在Hein1706z、LA3969、冀粉2號(hào)和冀粉3號(hào)葉片中的表達(dá)模式相似,其表達(dá)量雖有小幅度升高或降低,但總體水平與未進(jìn)行低溫處理時(shí)基本一致;SlCaM4基因在Heinz1706中受到低溫脅迫后12 h內(nèi)表達(dá)量無顯著變化,24 h后開始緩慢升高,在LA3969、冀粉2號(hào)和冀粉3號(hào)中2 h內(nèi)表達(dá)受到抑制,4 h表達(dá)升高恢復(fù)至原有水平,之后再次受到抑制,于24～48 h再次升高;SlCaM5基因在Heinz1706、LA3969、冀粉2號(hào)和冀粉3號(hào)中的表達(dá)模式相似,在低溫處理前期其表達(dá)量變化不明顯,處理后期表達(dá)量顯著升高。在農(nóng)博粉霸15中,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達(dá)量均為先升高后降低的情況,且同時(shí)在處理1 h出現(xiàn)上調(diào)峰值,之后表達(dá)量逐步降低,在24 h后3個(gè)基因的表達(dá)均受到抑制,同時(shí)形態(tài)觀察顯示植株生命活動(dòng)受到威脅。

圖4 5 ℃低溫脅迫下SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因的表達(dá)模式Fig.4 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in response to 5 ℃ cold stress

上述結(jié)果顯示SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因?qū)Φ蜏剌^為敏感,在不同番茄品種中的表達(dá)模式不同,其中SlCaM5基因在受到不同程度的低溫脅迫后,表達(dá)量變化更為明顯,在多個(gè)耐寒品種中表達(dá)量呈上升趨勢(shì),推測該基因在番茄抵御低溫過程中的高表達(dá),在維持CaM蛋白的翻譯水平中發(fā)揮著重要作用。

本研究參考番茄RNA-Seq數(shù)據(jù),分析了SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在栽培品種Heinz1706的不同組織及果實(shí)發(fā)育階段中的特異性表達(dá)模式。結(jié)果表明(圖 5),Heinz1706品種SlCaM3和SlCaM4在分生組織活躍的花、根和果實(shí)發(fā)育初期中具有較高的表達(dá),而在葉和成熟果實(shí)中的表達(dá)水平較低;在啟動(dòng)子順式元件分析結(jié)果中,SlCaM3和SlCaM4基因均含有分生組織特異性表達(dá)元件,結(jié)果相一致。SlCaM5基因在Heinz1706的不同組織中表達(dá)水平差異不明顯。

1.花蕾;2.花;3.葉片;4.根;5.1 cm 果實(shí);6.2 cm 果實(shí);7.3 cm 果實(shí);8.綠熟期果實(shí);9.轉(zhuǎn)色期果實(shí);10.轉(zhuǎn)色10 d果實(shí)。1.Flower buds;2.Flowers;3.Leaves;4.Roots;5.1 cm fruits;6.2 cm fruits;7.3 cm fruits;8.Mature green fruits;9.Breaker fruits;10.Breaker +10 d fruits.圖5 SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在Heinz1706不同組織中的表達(dá)模式Fig.5 Expression profiles of SlCaM3,SlCaM4 and SlCaM5 in different tissues of Heinz1706

3 結(jié)論與討論

CaM在高等生物中具有高度保守性,能夠承受很強(qiáng)的選擇壓力,在生物體中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能[17]。本研究中克隆到的SlCaM3、SlCaM4和SlCaM53條序列相似度為93.63%,編碼的149個(gè)氨基酸序列完全相同,并且具有CaM蛋白家族典型EF-h domain。CaM是一類廣譜型信號(hào)分子,其功能也具有廣泛性以適應(yīng)復(fù)雜的生長環(huán)境,但不同的CaM基因在響應(yīng)環(huán)境脅迫和激素信號(hào)時(shí)具有不同的分工[18]。本研究對(duì)3個(gè)基因的啟動(dòng)子區(qū)順式元件分析發(fā)現(xiàn),盡管SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因雖然編碼同一個(gè)蛋白質(zhì),但啟動(dòng)子序列含有多種順勢(shì)元件響應(yīng)多種非生物脅迫和激素信號(hào),說明各自的表達(dá)模式受到內(nèi)外多種不同因素的調(diào)控,在多種逆境脅迫下保證CaM蛋白功能不受影響。在SlCaM3和SlCaM4基因的啟動(dòng)子區(qū)還鑒定到分生組織特異性表達(dá)元件,這與組織特性表達(dá)結(jié)果相互印證,表明啟動(dòng)子區(qū)域復(fù)雜性,同時(shí)提示了作用元件的重要性。橫向?qū)Ρ软樖皆植?呈互補(bǔ)模式分布,提示基因家族或可能存在聯(lián)動(dòng)調(diào)控的機(jī)制。

植物感受低溫信號(hào)并傳遞信號(hào)到細(xì)胞核內(nèi),激活轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)而調(diào)節(jié)基因表達(dá),引起一系列生理生化反應(yīng),產(chǎn)生抗寒能力,這是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)系統(tǒng)[19]。在低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中,Ca2+是重要的第二信使[20-22]。低溫脅迫發(fā)生時(shí),Ca2+濃度發(fā)生變化,Ca2+與受體蛋白CaM結(jié)合后進(jìn)一步激活下游鈣依賴的蛋白激酶(CaMK)或CaM結(jié)合蛋白(CaMBP)[23-24],蛋白激酶的活化導(dǎo)致與活性氧代謝相關(guān)的POD、SOD、CAT等活性增強(qiáng)或轉(zhuǎn)錄因子激活,從而完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),參與脅迫應(yīng)答[25-26]。大量研究表明,CaM蛋白可以通過鈣離子信號(hào)途徑來提高植物對(duì)低溫脅迫的耐受性。沙冬青AmCaM1在低溫處理下1 h表達(dá)量開始上調(diào)[27]。茶樹CsCaM1和CsCaM2在低溫脅迫(4 ℃)下表達(dá)量均升高,其中CsCaM2受低溫影響的誘導(dǎo)程度更大[28]。本研究中SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在5個(gè)番茄栽培品種受低溫脅迫時(shí)表達(dá)量均有所變化,15 ℃下這3個(gè)基因在所有番茄品種中表達(dá)量均呈上調(diào)趨勢(shì),其中SlCaM5對(duì)低溫的響應(yīng)更為迅速(LA3969、農(nóng)博粉霸15),并且在5個(gè)品種中表達(dá)量變化更為明顯。5 ℃時(shí)這3個(gè)基因的表達(dá)情況更為復(fù)雜,在Heinz1706、LA3696、冀粉2號(hào)和冀粉3號(hào)4個(gè)品種中,SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5表達(dá)量均表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì),但對(duì)低溫脅迫時(shí)間的響應(yīng)不盡相同;然而在農(nóng)博粉霸15中,這3個(gè)基因表達(dá)量先升高,并于低溫脅迫1 h后達(dá)最高表達(dá)量,然后下降。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5在不同番茄品種中對(duì)不同程度低溫以及脅迫時(shí)間有不同的響應(yīng)模式,表明其參與了番茄抵御低溫過程,并在其中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

CaM蛋白在植物中的表達(dá)具有器官差異性。油茶CoCaM1在花芽到子房形成中的表達(dá)量較高;而CoCaM2在果實(shí)發(fā)育以及油脂積累過程中的表達(dá)量較高[29]。鴨梨PbCaM1和PbCaM2在成葉、盛花期花瓣和幼果期表達(dá)量較高[30]。百脈根LjCaM3在根及根瘤中的相對(duì)表達(dá)量顯著高于莖、葉、花和豆莢[31]。本研究中,SlCaM5基因在Heinz1706的不同組織中表達(dá)水平差異不明顯,而SlCaM3和SlCaM4在分生組織活躍的花、根和果實(shí)發(fā)育初期中具有較高的表達(dá),而在葉和成熟果實(shí)中的表達(dá)水平較低。這表明它們?cè)诨?、果?shí)形成以及根的發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用,同時(shí)也提示了基因調(diào)控的多樣性。

克隆獲得了番茄SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因,三者編碼相同的蛋白序列,啟動(dòng)子區(qū)域含有多種響應(yīng)生物及非生物脅迫的順式作用元件。SlCaM3、SlCaM4和SlCaM5基因在番茄不同組織中表達(dá)差異性明顯,在不同番茄品種中對(duì)低溫脅迫較為敏感,預(yù)示著番茄CaM基因可能在番茄抵御低溫過程中發(fā)揮著作用。