何 斐,李 川,Shah Faisal,劉富強,段園鵬,王 夢,阮 佳,魏夢琳,姜 浩,馬星光,王 卓

(1.安康學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物科技學(xué)院,陜西 安康 725000;2.白沙瓦農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)系,巴基斯坦 開伯爾-普赫圖赫瓦省白沙瓦 23060)

間作是我國傳統(tǒng)的種植方式之一,合理間作不僅能提高作物利用光、水分、養(yǎng)分等資源利用效率,而且還能控制病蟲草害發(fā)生頻度和強度,從而減少化學(xué)農(nóng)藥的使用和肥料投入[1-2],對促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要作用。

花魔芋(Amorphophalluskonjac)是目前自然界唯一能大量提取葡甘聚糖的重要經(jīng)濟作物,也是湖北、云南、四川、陜南等貧困山區(qū)鄉(xiāng)村振興的支柱產(chǎn)業(yè)[3]。葡甘聚糖是一種高分子水溶性膳食纖維,廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品、醫(yī)藥、保健、化工、紡織等許多領(lǐng)域,具有極大的商業(yè)價值[4]。刺槐(RobiniapseudoacaciaL.)是豆科落葉喬木,具有耐旱耐貧瘠、速生、適應(yīng)性強且固氮效果好等優(yōu)點,是干旱半干旱地區(qū)的主要造林樹種,被我國北方地區(qū)廣泛引種栽培[5-6]。研究表明,與刺槐間作能維持花魔芋根際微生物多樣性,改善微生態(tài)環(huán)境,有效規(guī)避花魔芋軟腐病和白絹病等病害,減輕經(jīng)濟損失。刺槐林下種植魔芋是我國陜南地區(qū)一種典型的種植方式,具有控病增產(chǎn)等優(yōu)勢[7-8]。間作增產(chǎn)優(yōu)勢主要源于作物間互作[9],根系形態(tài)、生理性狀及基因表達(dá)等決定植株對土壤養(yǎng)分、水分的高效利用[10]。許多學(xué)者研究了花魔芋間套作的作物生長和效益[11-13],但其根系互作和基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)研究報道較少。因此,研究刺槐間作花魔芋能進(jìn)一步探究該模式的控病增產(chǎn)機理,對刺槐林下魔芋栽培技術(shù)水平的提高及推廣具有重要意義。

根系是植物獲取水分和養(yǎng)分的重要器官,易受環(huán)境因子的影響[14]。本研究以刺槐和花魔芋不同根系分隔方式為研究對象,利用Illumina NovaSeq高通量測序技術(shù)對花魔芋根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究,結(jié)合生信分析法對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG代謝通路富集分析,研究與刺槐間作的花魔芋差異基因的表達(dá),為間作花魔芋根系中相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控及響應(yīng)機制提供分子基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗設(shè)計

試驗于2021年5月3日在安康學(xué)院農(nóng)學(xué)大棚進(jìn)行。采用兩室根箱隔網(wǎng)裝置(圖1),試驗按照根系不同分隔方式設(shè)置3個處理:塑料膜分隔(Film separation,FS);尼龍網(wǎng)分隔(Mesh separation,MS),尼龍網(wǎng)孔徑為25 μm,水分、養(yǎng)分可穿過,根系不能通過;不分隔(Non-separation,NS)。A室種植刺槐5株,B室種植花魔芋3株,每處理重復(fù)3次。于2021年9月10日球莖膨大期采集各處理花魔芋根系,將采集的9個樣本放入液氮速凍后轉(zhuǎn)存于-80 ℃超低溫冰箱。每個樣本單獨提取RNA,分別用于轉(zhuǎn)錄組測序和分析。

圖1 兩室根箱隔網(wǎng)系統(tǒng)Fig.1 Two compartments system

1.2 總RNA提取、建庫及測序

使用TRIzol(Invitrogen,USA)RNA提取試劑盒提取花魔芋根系中的總RNA,用Bioanalyzer 2100 system(Agilent Technologies,USA)檢測RNA完整性,使用Nanodrop檢測RNA純度?？俁NA檢測合格后委托上海派森諾生物科技有限公司構(gòu)建cDNA文庫,利用Illumina NovaSeq 6000平臺測序。

1.3 測序數(shù)據(jù)分析

對測序獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控,經(jīng)過匹配、過濾低質(zhì)量堿基從而得到高質(zhì)量的質(zhì)控數(shù)據(jù)以保證后續(xù)分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。花魔芋無參考基因組,采用Trinity軟件[15]對高質(zhì)量數(shù)據(jù)(Clean data)進(jìn)行組裝拼接成轉(zhuǎn)錄本。去冗余后獲得Unigenes,使用GO[16]、KEGG[17]、Pfam[18]、eggNOG[19]和Swissprot[20]和Nr數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋。

差異表達(dá)基因(DEGs)篩選:用FPKM值(每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的片段數(shù))[21]計算基因表達(dá)量。采用DESeq對基因表達(dá)進(jìn)行差異分析,篩選差異表達(dá)基因條件為:表達(dá)差異倍數(shù)|log2Fold Change|>1(Fold Change,FC),顯著性P-value<0.05[22]。

差異表達(dá)基因GO注釋和KEGG富集分析:利用eggnog-mapper軟件進(jìn)行差異表達(dá)基因的GO注釋,使用topGO軟件進(jìn)行GO富集分析,通過P值(P<0.05)找出差異基因顯著富集的GO term,從而確定差異基因行使的生物學(xué)功能。采用KOBAS注釋系統(tǒng)(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)完成KEGG注釋統(tǒng)計,以P值(Padjust)<0.05作為顯著富集標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行差異表達(dá)基因的通路富集分析[23]。

1.4 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

隨機選取6個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR表達(dá)量的驗證,利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物,選用EF1-a為內(nèi)參基因[24],引物序列見表1。使用CFX96 Real-Time System(BIO-RAD)儀器,利用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qPCR,總反應(yīng)體系20 μL:2×SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、cDNA模板(50 ng/μL)1 μL、8 μL ddH2O。反應(yīng)程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,60 ℃ 25 s,40個循環(huán)。每個樣本設(shè)置3個重復(fù),樣本數(shù)值按照2-ΔΔCT法[25]計算相關(guān)基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

表1 用于qRT-PCR驗證的引物Tab.1 Primers used for qRT-PCR validation

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估與組裝分析

對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析和質(zhì)量評估結(jié)果顯示(表2),各樣品測序數(shù)據(jù)的高質(zhì)量序列條數(shù)在40 561 598～52 236 882(NCBI SRA數(shù)據(jù)庫登錄號:PRJNA841227,各樣本序列登錄號:SAMN28577734—SAMN28577742),Q20達(dá)到96.4%以上,Q30達(dá)到92.0%以上,表明測序樣品的文庫構(gòu)建質(zhì)量和測序質(zhì)量結(jié)果良好,可用于后續(xù)分析。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.2 Statistics of sequencing data

皮爾遜相關(guān)系數(shù)表示樣品間基因的表達(dá)水平相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)越接近1,表明樣品間表達(dá)模式的相似度越高。一般來說,相關(guān)系數(shù)在0.8～1屬于極強相關(guān),如果生物學(xué)重復(fù)的樣本之間相關(guān)系數(shù)低于0.8,表示樣品之間的相關(guān)性較低。從圖2可以看出,以NS處理的樣本為例,NS_1和NS_2的相關(guān)系數(shù)為0.95,NS_1和NS_3的相關(guān)系數(shù)為0.94,NS_2和NS_3的相關(guān)系數(shù)為0.99,說明NS處理組內(nèi)樣本之間的生物學(xué)重復(fù)較好。而NS、MS和FS 3個處理組間樣本之間的相關(guān)系數(shù)均小于0.8,說明組間樣本之間的差異性較大。

圖2 基于皮爾遜相關(guān)系數(shù)的樣品間重復(fù)性分析Fig.2 Repeatability analysis between samples based on Pearson correlation coefficient

對原始測序數(shù)據(jù)去除接頭序列及低質(zhì)量reads,共獲得59.82 Gb Clean data,Trinity組裝后共獲得92 358條Transcript和40 122條Unigene序列,平均長度分別為1 047.36,912.36 bp,N50長度分別為1 478,1 441 bp,GC含量分別為48.49%和49.36%(表3)。

表3 組裝結(jié)果分析Tab.3 Analysis of assembly

2.2 Unigene基本注釋統(tǒng)計

花魔芋40 122個Unigene與Nr、GO、KEGG、Pfam、eggNOG和Swissprot數(shù)據(jù)庫分別比對到23 960,12 517,11 934,16 531,23 066,20 994個。其中Nr數(shù)據(jù)庫注釋的信息最多,占總Unigene的59.72%,KEGG數(shù)據(jù)庫注釋的信息最少,占總Unigene的29.74%。在6大數(shù)據(jù)庫中均注釋到Unigene 5 377個,占總Unigene的13.40%。

2.3 基因差異表達(dá)分析

對不同處理進(jìn)行兩兩比較(圖3)結(jié)果顯示,在FS_vs_MS組內(nèi),共有1 776個差異表達(dá)基因,其中588個上調(diào)表達(dá)(上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量占差異表達(dá)基因比例為33.1%),1 188個下調(diào)表達(dá)。FS_vs_NS組內(nèi)有差異表達(dá)基因733個,其中上調(diào)表達(dá)167個(上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量占比22.8%),下調(diào)表達(dá)566個。MS_vs_NS組內(nèi)有896個差異表達(dá)基因,有455個上調(diào)表達(dá)(上調(diào)表達(dá)基因數(shù)量占比50.8%),441個下調(diào)表達(dá)。通過對處理間差異表達(dá)基因篩選分析發(fā)現(xiàn),FS_vs_MS的差異表達(dá)基因數(shù)量最多,是FS_vs_NS組內(nèi)差異基因數(shù)量的2.4倍,說明尼龍網(wǎng)分隔的花魔芋根系中有更多基因參與表達(dá)調(diào)控來響應(yīng)與刺槐的半交互互作,而塑料膜分隔的花魔芋根系差異基因數(shù)量較少,表明其受到地下根系交互作用影響較小。

圖3 處理間差異表達(dá)基因的火山圖與統(tǒng)計分析Fig.3 The volcano plot and statistical analysis of DEGs between treatments

2.4 差異表達(dá)基因的GO功能注釋和富集分析

FS_vs_MS、FS_vs_NS和MS_vs_NS 3個處理的差異表達(dá)基因GO功能注釋分析結(jié)果顯示(圖4),在生物過程大類中,差異表達(dá)較多的功能組是細(xì)胞進(jìn)程、新陳代謝過程、有機物代謝過程、細(xì)胞代謝過程、初級代謝過程、氮化合物代謝過程和刺激響應(yīng);在細(xì)胞組分大類中,差異表達(dá)較多的功能組是有機氮化合物代謝過程、細(xì)胞、細(xì)胞內(nèi)、細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器等;在分子功能大類中,差異表達(dá)較多的功能組主要是催化活性。其中,FS_vs_MS處理間差異表達(dá)基因GO功能注釋到以上的生物過程、細(xì)胞組分和分子功能的基因數(shù)量最多,表明尼龍網(wǎng)分隔的花魔芋根系在這三大類功能方面與塑料膜分隔花魔芋相比存在較大區(qū)別,尼龍網(wǎng)分隔花魔芋根系的生長調(diào)控更復(fù)雜。尼龍網(wǎng)隔根使刺槐和魔芋土壤中水肥可以運移,但根系相互隔離,而塑料膜隔根使2種作物水肥轉(zhuǎn)運和根系互作完全隔離,減小了群體根系對土壤資源的利用。與塑料膜隔根相比,尼龍網(wǎng)分隔的刺槐與魔芋存在半交互作用,從而影響了花魔芋根系基因的表達(dá)。

1.生物過程;2.細(xì)胞進(jìn)程;3.新陳代謝過程;4.有機物代謝過程;5.細(xì)胞代謝過程;6.初級代謝過程;7.氮化合物代謝過程;8.刺激響應(yīng);9.細(xì)胞組分;10.有機氮化合物代謝過程;11.細(xì)胞;12.細(xì)胞內(nèi);13.細(xì)胞器;14.細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器;15.細(xì)胞質(zhì);16.膜結(jié)合細(xì)胞器;17.細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器;18.細(xì)胞膜;19.分子功能;20.催化活性。1.Biological process;2.Cellular process;3.Metabolic process;4.Organic substance metabolic process;5.Cellular metabolic process;6.Primary metabolic process;7.Nitrogen compound metabolic process;8.Response to stimulus;9.Cellular component;10.Organonitrogen compound metabolic process;11.Cell;12.Intracellular;13.Organelle;14.Intracellular organelle;15.Cytoplasm;16.Membrane-bounded organelle;17.Intracellular membrane-bounded organelle;18.Membrane;19.Molecular function;20.Catalytic activity.圖4 處理間差異表達(dá)基因的GO注釋分析Fig.4 The GO annotations analysis of DEGs between treatments

GO富集分析結(jié)果顯示,FS_vs_MS處理間差異表達(dá)基因中,GO功能富集程度顯著的前20條GO term主要有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞外圍、細(xì)胞壁、外部囊狀結(jié)構(gòu)、細(xì)胞膜內(nèi)在成分、質(zhì)膜內(nèi)在成分等(圖5-A);FS_vs_NS處理間差異基因GO顯著富集的主要有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜、細(xì)胞外圍等(圖5-B);MS_vs_NS處理間差異基因GO顯著富集的主要有類囊體膜、類囊體、基質(zhì)類囊體、光合膜等(圖5-C)。由此可知,與塑料膜分隔單作相比,尼龍網(wǎng)分隔和未分隔間作花魔芋根系較大的變化主要在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)膜和細(xì)胞外圍方面。

圖5 處理間差異表達(dá)基因的GO富集分析Fig.5 The GO enrichment analysis of DEGs between treatments

2.5 差異表達(dá)基因的KEGG富集分析

對差異表達(dá)基因富集最顯著的前20條KEGG pathway繪制氣泡圖。結(jié)果顯示(圖6),在FS_vs_MS處理間較顯著富集的KEGG通路有核糖體、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物MAPK信號通路、過氧化物酶體、氧化磷酸化等(圖6-A);在FS_vs_NS處理間較顯著富集的KEGG通路有核糖體、氧化磷酸化、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等(圖6-B);在MS_vs_NS處理間較顯著富集的KEGG通路包括光合作用-天線蛋白、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、泛素酮和其他萜類醌的生物合成、光合作用等(圖6-C)。根據(jù)以上3個處理組的結(jié)果,可看出尼龍網(wǎng)分隔和未分隔間作花魔芋根系相對于塑料膜分隔單作花魔芋較顯著的差別在于核糖體、氧化磷酸化和植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

圖6 處理間差異表達(dá)基因的KEGG富集分析Fig.6 The KEGG enrichment analysis of DEGs between treatments

2.6 差異表達(dá)基因的qRT-PCR驗證

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中隨機挑取6個DEGs,推測為阿拉伯半乳聚糖蛋白(TRINITY_ DN5161_c0_g1)、磷脂酶A2(TRINITY_DN1055_c0_g1)、三角狀五肽重復(fù)蛋白(TRINITY_DN41977_c0_g2)、水孔蛋白PIP2-8(TRINITY_DN1454_c0_g1)、DNA損傷修復(fù)蛋白(TRINITY_DN22369_c0_g1)、受體胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RBK2(TRINITY_DN1700_c0_g1),利用qRT-PCR試驗對這些基因表達(dá)進(jìn)行進(jìn)一步分析,結(jié)果顯示(圖7),6個DEGs的表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)趨勢一致,證實了轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果的可靠性。

1.阿拉伯半乳聚糖蛋白;2.磷脂酶A2;3.三角狀五肽重復(fù)蛋白;4.水孔蛋白PIP2-8;5.DNA損傷修復(fù)蛋白;6.受體胞質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶RBK2。1.Arabinogalactan protein;2.Phospholipase A2;3.Pentatricopeptide repeat-containing protein;4.Aquaporin PIP2-8;5.DNA damage repair protein;6.Receptor-like cytosolic serine/threonine-protein kinase RBK2.圖7 6個差異表達(dá)基因qRT-PCR驗證Fig.7 qRT-PCR analysis of six selected DEGs

3 結(jié)論與討論

本研究以刺槐和花魔芋不同根系分隔方式為研究對象,利用Illumina Novaseq 6000平臺,對不同處理花魔芋根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序和分析,獲得Q30均達(dá)到92.0%以上的高質(zhì)量序列數(shù)據(jù)。通過對間作花魔芋根系轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析,了解花魔芋根系在與刺槐不同根系分隔方式下的生物學(xué)過程及代謝通路,研究結(jié)果有助于探究間作花魔芋根系基因在與刺槐間作條件下的表達(dá)調(diào)控機制。

植物在環(huán)境脅迫條件下,通過改變自身的基因表達(dá)來調(diào)控代謝途徑與物質(zhì)合成[26]。本研究對處理間進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn),FS_vs_MS的差異表達(dá)基因數(shù)量最多,是FS_vs_NS組內(nèi)差異基因數(shù)量的2.4倍,說明尼龍網(wǎng)分隔的花魔芋根系中有更多基因被激活表達(dá)來響應(yīng)與刺槐的半交互互作。差異表達(dá)基因GO功能注釋分析后發(fā)現(xiàn),在FS_vs_MS和FS_vs_NS處理間差異基因顯著富集的GO term主要集中在植物生長比如細(xì)胞膜和細(xì)胞外圍等。這些與植物生長相關(guān)的GO term可能影響間作花魔芋的生物量或產(chǎn)量,這從另一方面驗證了前人關(guān)于間作花魔芋生理方面的研究結(jié)果,間作花魔芋的生長性狀和產(chǎn)量品質(zhì)優(yōu)于單作[27-28]。

在差異表達(dá)基因的KEGG通路中,與塑料膜分隔相比,尼龍網(wǎng)分隔和未分隔間作花魔芋根系的植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路顯著富集,說明植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是花魔芋根系響應(yīng)與刺槐間作栽培的重要途徑,該結(jié)果與黃瓜[29]和刺角瓜[30]根系受到生物和非生物脅迫而顯著富集的通路相似。激素是植物響應(yīng)環(huán)境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要成員[31],在間作花魔芋生長過程中發(fā)揮重要作用,因此,本研究也說明了尼龍網(wǎng)分隔和未分隔間作花魔芋具有更活躍的細(xì)胞代謝水平和更強的抗逆性。在FS_vs_MS和FS_vs_NS處理間較顯著富集的KEGG通路還有核糖體和氧化磷酸化,這可能與尼龍網(wǎng)分隔的半交互和間作條件下花魔芋植株啟動大量基因在核糖體翻譯有關(guān),氧化磷酸化途徑與能量代謝有關(guān)[32],推測半交互狀態(tài)和間作的花魔芋產(chǎn)生大量能量以更好地適應(yīng)環(huán)境。

本研究對刺槐與花魔芋間作系統(tǒng)中塑料膜分隔、尼龍網(wǎng)分隔和未分隔的花魔芋根系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序與分析。將各處理獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行兩兩比較,FS_vs_MS、FS_vs_NS和MS_vs_NS的差異表達(dá)基因數(shù)分別為1 776,733,896個,其中上調(diào)表達(dá)基因分別占33.1%,22.8%和50.8%。通過對差異表達(dá)基因的GO和KEGG富集分析表明,尼龍網(wǎng)分隔的花魔芋根系中有更多差異表達(dá)基因參與調(diào)控,這些通路中的功能基因在間作花魔芋的生長過程中發(fā)揮重要作用,該結(jié)果為研究間作花魔芋根系基因表達(dá)調(diào)控提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)資料。