裴 虎,熊才運,張亞輝,任文闖,李小琴,黃 君

(廣東省植物分子育種重點實驗室,華南農業(yè)大學 農學院,廣東 廣州 510642)

甜玉米(ZeamaysL.sacharatasturt)是玉米屬(ZeamaysL.)甜質型玉米亞種,是由su1、sh1、bt1、sh2等隱性突變基因引起的胚乳缺陷型玉米[1]。果皮是玉米籽粒的重要組成部分,具有保護胚和胚乳不受機械損傷或病蟲害侵害的作用[2]。與飼用玉米不同,食味品質是決定甜玉米品種優(yōu)劣和經濟價值的重要因素,果皮厚度與甜玉米的柔嫩性和皮渣感有關,是影響其食味品質最為重要的關鍵指標之一[3]。目前,改良甜玉米的食味品質,尤其是果皮柔嫩度,選育果皮較薄的甜玉米品種,提升甜玉米口感,是育種家一直追求的重要育種目標。因此,深入挖掘控制甜玉米果皮厚度關鍵基因,能夠為甜玉米品質改良提供基因資源,具有重要的研究意義。

截至目前,針對甜玉米果皮厚度的研究較少,主要集中在QTL(Quantitative trait locus)定位和遺傳方式分析。玉米果皮厚度的遺傳方式涉及顯性效應、加性效應和上位性效應,其中加性效應和上位性效應起到主要作用[4-6]。前人研究表明,在玉米的10條染色體中除第7號染色體外,其余9條染色體均定位到玉米果皮厚度相關QTLs[5,7-8],但多數QTL難以在不同研究中被重復檢測到。2020年,華南農業(yè)大學農學院甜玉米課題組利用甜玉米高代導入系群體對甜玉米果皮厚度進行QTL定位和轉錄組分析,在第10染色體上鑒定到一個控制果皮厚度的主效QTL-qPT10-5,能夠解釋表型變異的7.78%～35.38%,結合轉錄組測序和基因注釋分析,認為AUX/IAA 轉錄因子,ZIM 轉錄因子和FATTY ACID EXPORT是控制甜玉米果皮厚度的關鍵候選基因[9]。

目前,通過正向遺傳學方法已鑒定出多個與甜玉米果皮厚度相關的QTLs,但至今未有相關基因被克隆的報道。加權基因共表達網絡分析(Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)是以轉錄組、基因芯片等獲得的基因表達量數據為基礎,將表達趨勢相近的基因模塊分類并得到具有高度生物學意義的模塊和基因[10]。近年來,WGCNA方法已經廣泛應用于玉米、水稻、高粱等農作物的遺傳改良研究[11-14]。然而目前尚未有利用WGCNA對甜玉米果皮厚度相關的基因共表達模塊被鑒定。

本研究以薄果皮甜玉米自交系M03和厚果皮甜玉米自交系M08為材料,在3個時間梯度(授粉后15,19,23 d)分析其果皮厚度變化,結合轉錄組和WGCNA分析構建果皮厚度特異性模塊并挖掘出調控玉米果皮厚度的核心基因,為后續(xù)甜玉米果皮厚度分子遺傳機制的進一步研究提供新的線索。

1 材料和方法

1.1 玉米材料及轉錄組測序數據

利用本課題組選育的2個甜玉米自交系M03(果皮厚度71.1～135.9 μm)和M08(果皮厚度111.7～171.7 μm)為研究材料。于2017年種植在華南農業(yè)大學增城教學實驗基地,行距70 cm、株距25 cm、種植密度為52 500株/hm2。為避免材料出現其他品種玉米植株造成的花粉直感現象,采取人工套袋授粉的方式進行授粉,分別在授粉后15,19,23 d對2個自交系進行取樣。每個自交系隨機選取3個玉米果穗作為3個生物學重復,取10～15粒果穗中部的籽粒,用雙刃刀片沿胚側輕輕劃開籽粒,用鑷子剝取果皮并立即放入液氮冷凍,最后放入-80 ℃冰箱保存,用于后續(xù)表型鑒定及轉錄組測序。每個果穗取6粒籽粒進行掃描電鏡觀察測量果皮厚度。使用SPSS(Version 19)進行表型數據分析。

植物總 RNA 利用RNA提取試劑盒(Vazyme,中國南京)進行提取。提取的 RNA使用Nanodrop 2000分光光度計(Thermofisher,美國)、Qubit 2.0熒光計(Life Technologies)和Aglient 2100生物分析儀系統(Agilent Technologies,CA,美國)來評估純度(OD260/280≥1.8;OD260/230≥1.0),濃縮RNA樣品(總RNA≥250 ng/μL)和完整性(RIN≥8.0,28S/18S≥0.5)。轉錄組測序文庫構建主要使用寡核苷酸(dT)磁珠(Invitrogen,Carlsbadcity,CA,美國)從總RNA中分離出每個樣品1.5 μg mRNA,片段化并反向轉錄成cDNA,并通過 PCR進行擴增。使用Illumina HiSeq 2000平臺(San Diego,CA,美國)進行了轉錄組測序。使用 FastQC軟件對原始測序數據進行質量評估,去除低質量和未知堿基數目超過15%的 reads。利用 Hisat 2 軟件將Clean reads 比對到玉米B73參考基因組(ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/release63/fasta/zea_mays/Zea_mays.B73_RefGen_v4.dna.top_level.fa.gz),利用Cufflinks v2.2.1軟件計算樣品中基因的表達量,每千個堿基外顯子百萬片段數(Fragments per kilobase of exon per million fragments mapped,FPKM)值衡量基因的表達水平。DESeq2 軟件(Version 1.10.1)用于差異表達基因的計算[15]。只有當不同組間|Log2Fold Change|>1 且P值<0.05的基因被認定為差異表達基因。

1.2 加權基因共表達網絡分析

通過TBtools v1.09[16]軟件中的WGCNA shinny plugin對共表達模塊進行劃分。去除掉FPKM值小于1的基因,本研究共得到14 126個基因用于樣品聚類。通過SFT and Power Select 選項進行軟閾值(Soft Thresholding Power)的篩選,計算得到閾值為14(圖1)。利用Module-net中的Cluster選項將min Module Size調整為30,Module Cuttree Height調整為0.25,選擇Max Block Size為15 000對數據進行模塊聚類和剪切。利用Module-trait選項計算基因在模塊內的連接度(Eigengene connectivity,KME),取KME值排名靠前且差異表達的基因作為該模塊內核心基因(Hub gene)進行后續(xù)分析,利用Cytoscape v3.6.0[17]對核心基因網絡進行可視化。

B縱坐標代表每一個軟閾值對應的網絡平均連接程度;C、D.在power值為14時拓撲網絡符合程度的檢測。The vertical coordinate of Fig.B represents the mean connectivity corresponding to each soft threshold;C and D .The detection of topological network compliance at a power value of 14.圖1 基因共表達網絡軟閾值的確定Fig.1 Soft threshold determination of gene co-expression network

1.3 差異表達基因及特異性模塊功能富集分析

將篩選出的差異表達基因和特異性模塊內所包含的基因利用R程序中的 clusterProfiler 軟件包[18]進行GO(Gene Ontology)和 KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集分析。當P值(P-value)小于0.05時認為此 GO功能和 KEGG pathway 功能存在顯著富集情況。使用 Tbtools 軟件和Omicshare平臺制作熱圖對基因表達量進行可視化。

1.4 轉錄組測序數據的qRT-PCR驗證

利用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)驗證RNA-seq結果的可靠性。使用HiScriptⅢ RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒將果皮RNA反轉錄成cDNA作為qRT-PCR模板。以ubiquitin(登錄號:NM_001138130)為內參基因,使用CFX96(Bio-Rad)實時熒光定量 PCR 系統,選用2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR GreenI)(TsingKe)試劑盒,熒光染料為SYBR Green。所有反應均在20 μL的體系下進行,其中包含200 ng cDNA、0.8 μmol/L核心基因特異性引物以及10 μL的2×T5 Fast qPCR Mix。qPCR反應程序:95 ℃預變性1 min;95 ℃ 10 s,55 ℃ 5 s,40個循環(huán);溶解曲線95 ℃ 10 s,55 ℃ 10 s,72 ℃ 15 s。使用2-ΔΔCT法分析基因相對表達量[19],所用基因引物見表1。

2 結果與分析

2.1 不同材料果皮厚度變化分析

在相同的栽培條件下,分別取自交系M03和M08授粉后15,19,23 d的果皮進行掃描電鏡觀察(Scanning electron microscope,SEM)(圖2-A—F)。研究結果顯示,隨著授粉時間的增加,甜玉米籽粒果皮厚度整體呈現逐漸降低的趨勢,授粉后15～19 d的果皮厚度降低的速度較為緩慢,從授粉后19 d開始果皮厚度呈現出快速變薄的趨勢。其中,M08的果皮厚度相比M03更厚,不同自交系間果皮厚度的差異隨時間的推移逐漸增加,在乳熟期(授粉后19 d)開始達到顯著水平(圖2-G)。

A—C.M03授粉后15,19,23 d的果皮掃描電鏡結果;D—F.M08授粉后15,19,23 d的掃描電鏡結果;G.M03和M08的果皮厚度變化,柱中字母為 Duncan′s多重比較結果,不同字母表示材料間在P<0.05水平差異顯著。A—C.SEM results of 15,19 and 23 days after M03 pollination;D—F.SEM results of 15,19 and 23 days after M08 pollination;G.The change of pericarp thickness of M03 and M08.The letters in the column are Duncan′s multiple comparison results,different letters indicate significant difference between materials at the level of P<0.05.圖2 M08和M03在3個不同時期的籽粒果皮掃描電鏡圖片以及果皮厚度變化Fig.2 SEM of seed pericarp and changes in pericarp thickness of M08 and M03 at three different periods

2.2 差異表達基因篩選及GO和KEEG富集分析

2.2.1 轉錄組數據分析 去除含有接頭污染和低質量的reads,共得到480 628 079條高質量reads,與玉米B73參考基因組進行序列比對,其比對率為78.82%～ 84.50%,外顯子比對率為87.38%～91.97%(表2)。

表2 參試樣品轉錄組數據質量Tab.2 Quality of the transcriptome data of each sample

通過M03和M08自交系內部不同發(fā)育時期以及不同發(fā)育時期材料間的比較,共篩選出4 748個DEGs。其中,M03材料內部比較(M03-DAP15 vs M03-DAP23)共鑒定到1 234個DEGs(上調641個,下調593個);M08材料在不同發(fā)育時期的果皮厚度差異相對于M03較少,其內部比較(M08-DAP15 vs M08-DAP23)獲得了較少的差異基因,為471個DEGs(上調255個,下調216個)。相同發(fā)育時期的材料間比較(M03-DAP15 vs M08-DAP15;M03-DAP19 vs M08-DAP19;M03-DAP23 vs M08-DAP23)獲得了更多的差異基因,分別為2 334,2 238和2 039個DEGs(圖3-A)。材料內部與材料間比較共有的差異基因為11個(圖3-B)。

圖3 不同材料不同時期DEGs數量統計及韋恩圖Fig.3 Number of DEGs in different datasets and venn diagram

2.2.2 差異基因富集分析 對同一材料不同發(fā)育時期及不同材料相同發(fā)育時期進行差異表達基因鑒定,對獲得的差異表達基因進行GO功能注釋,GO富集條目主要分為生物過程、分子功能及細胞組分3 類。結果顯示,差異表達基因GO功能富集主要富集到細胞組分組織(GO:0071840)、對刺激的反應(GO:0050896)、生物過程調節(jié)(GO:0050789)等生物過程;結構分子活性(GO:0005198)、核酸結合轉錄物(GO:0001071)、轉運活性(GO:0005215)等分子功能;膜(GO:0016020)、細胞組分(GO:0044464)、細胞(GO:0005623)等細胞組分(圖4)。

KEGG代謝通路富集分析結果顯示差異表達基因主要參與丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝(Alanine,aspartate and glutamate metabolism)、萜類骨架的生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis)和植物MAPK信號通路(MAPK signaling pathway-plant);M03與M08材料內部的不同發(fā)育時期比較(M03-DAP15 vs M03-DAP23與M08-DAP15 vs M08-DAP23)結果顯示,差異表達基因還可共同富集到氨基酸生物合成(Biosynthesis of amino acids)、淀粉和蔗糖代謝(Starch and sucrose metabolism);相同時期不同材料之間比較得出差異表達基因主要參與β-丙氨酸代謝(Beta-alanine metabolism)、精氨酸和脯氨酸代謝(Arginine and proline metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝(Cysteine and methionine metabolism)途徑(圖4)。

2.3 共表達基因聚類和模塊構建

通過對FPKM值小于1的基因進行過濾,最終獲得14 126個基因用于構建基因聚類樹和共表達模塊分析。根據基因的FPKM值將表達模式相似的基因進行聚類,利用動態(tài)切割法(Dynamic tree cut)將得到的基因聚類樹切割成不同模塊(圖5-A)。將切割得到的18個不同模塊分別用不同的顏色進行區(qū)分,其中,基因數目最多的模塊是Turquoise模塊,最少的是Grey60模塊(圖5-B)。

A.基因聚類樹,每個聚類樹對應一個基因模塊,聚類等級相同的模塊用同樣的顏色表示;B.聚類出的18個模塊以及每個模塊所包含基因個數。A.A gene cluster tree,each cluster tree corresponds to a gene module,and with the same clustering level are represented by the same color;B.The 18 modules clustered and the number of genes contained in each module.圖5 基因共表達模塊以及各模塊所包含的基因數Fig.5 Gene co-expression module and the number of genes contained in each module

2.4 特異性模塊篩選及目標模塊KEGG富集分析

由于同一模塊內的基因表達模式相近,因此,這些基因很可能具有相似的生物學功能。結合果皮厚度表型數據計算每個模塊與果皮厚度之間的相關性,最終在18個模塊中得到了4個相關性系數絕對值大于0.60的模塊,分別是Pink模塊(-0.63)、Yellow模塊(-0.82)、Turquoise模塊(0.66)和Magenta模塊(0.81)(圖6)。通過模塊之間的相關性熱圖可以看出4個模塊之間具有較高的相關性,可將其作為目標模塊進行后續(xù)分析。為進一步探究與甜玉米果皮厚度顯著相關模塊的生物學功能,本研究利用OmicShare Tools(https://www.omicshare.com/)對模塊進行KEGG功能富集分析。結果表明,除Magenta模塊外,其他3個模塊均富集到氨基酸的生物合成、α-亞麻酸代謝(Alpha-linolenic acid metabolism)、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路。此外,泛酸和輔酶A生物合成(Terpenoid backbone biosynthesis)在Turquoise模塊被特異性富集;脂肪酸延長(Fatty acid elongation)在Yellow模塊特異富集;泛酸和輔酶A的生物合成(Pantothenate and CoA biosynthesis)在Pink模塊特異富集;植物MAPK信號通路、植物病原體相互作用等代謝通路只在Magenta模塊特異富集(圖7)。將不同材料及不同發(fā)育階段鑒定到的DEGs與所有所有模塊相關基因的KEGG富集結果進行對比,結果顯示,不同方法得到的基因可以共同富集到丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝、植物MAPK信號通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路。

A.各模塊與果皮厚度之間的相關系數熱圖,紅色框為特異性模塊;B.特異性模塊與DEGs共有基因數。A.The heat map of correlation coefficient between each module and peel thickness,and the red box is the specific module; B.The number of genes shared by specific modules and DEGs.圖6 表型-模塊相關性熱圖和模塊-DEGs共有基因數Fig.6 Phenotype-module correlation heatmap and number of genes shared by significant modules and DEGs

圖7 特異性模塊KEGG富集分析Fig.7 KEGG enrichment analysis of significant module

2.5 核心基因挖掘及互作網絡構建與分析

將不同模塊內的基因與不同材料、不同發(fā)育時期鑒定到的差異表達基因進行比對,選擇二者的交集進行基因互作網絡構建。通過篩選,Turquoise模塊中有1 351個基因、Yellow模塊中有543個基因、Pink模塊中有10個基因、Magenta模塊中有34個基因用于互作網絡構建。將每個模塊中與表型相關性較低(|GS|<0.5)的基因進行過濾,選取模塊內連通性(KME)最高的前20個基因作為核心基因的候選基因。為獲取候選基因的功能注釋信息,通過玉米參考基因組數據庫MaizeGDB(https://www.maizegdb.org/)和擬南芥同源注釋對相關基因的功能進行查找,最終篩選出與甜玉米果皮厚度相關的核心基因(Hub gene)。在Turquoise模塊共篩選出3個核心基因,Yellow模塊篩共選出4個核心基因,Pink模塊共篩選出2個核心基因,Magenta模塊共篩選出4個核心基因(表3)。將核心基因作為互作網絡的核心節(jié)點構建互作網絡,篩選基因網絡中的轉錄因子(Transcript factor,TF)和與果皮厚度相關的其他基因,并選擇權重值(Weight)最高的前50個基因繪圖,利用Cytoscape v3.6.0軟件進行可視化(圖8)。

表3 模塊中核心基因在擬南芥中的同源基因功能注釋Tab.3 Functional notes of homologous genes of hub genes in module in Arabidopsis

A～D分別為Turquoise模塊、Yellow模塊、Pink模塊、Magenta模塊的基因網絡;紅色大點為核心基因,灰色矩形為模塊內與表型相關基因的標注。A—D are the gene networks of Turquoise module,Yellow module,Pink module and Magenta module respectively; the large red dot is the hub gene,and the gray rectangle is the annotation of phenotype related genes in the module.圖8 特異性模塊的基因共表達網絡及其核心基因Fig.8 Gene co-expression network and hub genes of significant modules

通過基因功能注釋發(fā)現核心基因與已報道的可能與果皮厚度發(fā)育相關的基因具有互作網絡關系。例如:Turquoise模塊中的核心基因與細胞分裂素N-葡萄糖基轉移酶ZmCNGT(Zm00001d019265),GA2氧化酶GA2ox9(Zm00001d008909)和果膠甲酯酶ZmPME(Zm00001d050082)等具有互作網絡關系;Yellow模塊中的核心基因與聚半乳糖醛酸酶PGL23(Zm00001d013032)具有互作網絡關系。這些核心基因互作網絡中還包含ARF、AUX/IAA、bZIP、MYB、ERF、WRKY等可能與細胞分裂與果皮厚度發(fā)育相關的轉錄因子。

2.6 核心基因的實時熒光定量PCR驗證

為驗證轉錄組測序結果中基因表達量的可靠性,本研究挑選了9個核心基因進行qRT-PCR表達量驗證。結果表明,這些基因在2個不同的甜玉米自交系授粉后15,19,23 d的果皮組織中的表達量水平與轉錄組測序結果一致(圖9),進一步說明了轉錄組測序結果的可靠性以及數據的可重復性。

3 結論與討論

甜玉米作為鮮食玉米的一種,果皮厚度是決定其口感優(yōu)劣的重要因素[20]。果皮角質化程度、細胞大小、細胞數量細胞壁厚度以及細胞的排布等因素都可能會影響果皮的厚度[21]。這些因素除受基因型影響外還與栽培環(huán)境、氣候變化、采收時間等有關。因此,本研究在同等的栽培條件下,嚴格控制了授粉時間和采收時間,最大程度避免了上述因素對甜玉米果皮厚度表型的影響。為解析甜玉米果皮厚度的遺傳基因,鑒定控制甜玉米果皮厚度的關鍵候選基因,本研究選擇果皮厚度有明顯差異的2個甜玉米自交系(M03和M08)進行轉錄組測序,通過基因差異表達分析和加權基因共表達網絡分析,選取二者的交集進行后續(xù)研究。WGCNA作為識別基因與樣本間相關性模式的常用方法,可以特異性的篩選出與目標性狀相關的基因并聚類成共表達模塊,是相關性狀協同表達調控控制解析的重要工具[22]。

3.1 差異表達基因和特異性模塊內基因與碳水化合物代謝、淀粉和蔗糖代謝及MAPK信號通路有關

本研究利用乳熟期果皮較薄的甜玉米自交系M03和果皮較厚自交系M08的乳熟期果皮材料的RNA-seq數據為基礎進行了差異表達分析,在相同材料的不同發(fā)育時期及不同材料的相同發(fā)育時期共鑒定了4 748個差異表達基因,對相關基因進行GO和KEGG功能富集分析發(fā)現“碳水化合物代謝過程”、 “淀粉和蔗糖代謝”等與甜玉米果皮厚度發(fā)育有關。在禾本科植物研究中,如小麥、高粱等作物,發(fā)現其籽粒果皮中含有較多的淀粉顆粒,果皮中淀粉的含量會隨著籽粒的發(fā)育而變化[23-24]。在小麥果皮厚度發(fā)育研究中發(fā)現小麥植株受精后珠被開始發(fā)育為果皮,淀粉隨著果皮的發(fā)育不斷積累,在DAP(Day after pollination)5左右果皮中淀粉含量到達峰值,隨后逐漸分解并在DAP22左右消失殆盡,在果皮細胞淀粉含量處于峰值時可以明顯觀察到細胞呈現出輕微的膨脹變形,說明果皮細胞中的淀粉含量可以通過影響細胞大小進而影響果皮厚度,不同的淀粉含量可能會造成果皮厚度的差異,與本研究結果一致,甜玉米果皮厚度發(fā)育的關鍵基因均與碳水化合物代謝、淀粉和蔗糖代謝相關[24]。

通過WGCNA分析,本研究共鑒定到了4個具有高度生物學意義并與果皮厚度顯著相關的模塊,通過富集分析揭示了這些模塊的生物學功能。將所有模塊的KEGG富集結果與差異表達基因的功能富集結果進行比較,鑒定到天冬氨酸、丙氨酸與谷氨酸代謝、植物MAPK信號通路、半胱氨酸和蛋氨酸代謝等通路與甜玉米果皮厚度的發(fā)育有關。其中MAPK信號通路涉及包含細胞防御、抗逆、細胞增殖和細胞凋亡在內的多種生命活動,推測該通路在調節(jié)甜玉米果皮厚度發(fā)育過程中具有十分重要的作用。

3.2 MYB轉錄因子、脫落酸、細胞壁pH值及細胞周期蛋白能夠影響甜玉米果皮厚度

在4個特異性模塊中選擇與差異表達基因的交集進行后續(xù)分析,共篩選到13個核心基因,這些核心基因可能在參與調控果皮厚度發(fā)育過程中具有重要作用。Turquoise模塊的Zm00001d023282和Yellow模塊的Zm00001d022227分別為MYB69和MYB70轉錄因子,編碼MYB結構域蛋白。前人在玉米MYB轉錄因子的研究中發(fā)現,ZmFDL1/MYB94功能的缺失導致ω-羥基脂肪酸和多羥基脂肪酸的合成顯著降低,而角質層又是由這些超長鏈脂肪酸(VLCFA)化合物組成,該基因的功能缺失會造成玉米發(fā)育前期包括籽粒、幼苗葉片等部位的角質層形成受阻,同時該研究還指出干旱脅迫介導ABA的產生會抑制ZmFDL1的表達,從而增加角質層的厚度防止水分過快蒸發(fā)[25]。在擬南芥研究中發(fā)現幾個與表皮蠟質生物合成的基因受MYB轉錄因子家族成員調控,包括AtMYB30、AtMYB94和AtMYB96[26-28]。本研究鑒定到的核心基因Zm00001d005884為bZIP轉錄因子基因,在擬南芥的同源基因為AT1G49720,該基因與脫落酸反應元件結合,介導ABA反應的轉錄調控。核心基因Zm00001d014291在擬南芥的同源基因為AT4G33500,該基因編碼蛋白磷酸酶2C家族蛋白,在番茄中的研究表明,ABA與受體結合會影響編碼蛋白磷酸酶蛋白的基因SIPP2C5的表達,該基因表達量的變化會影響果實的各種性狀,包括果形、果皮厚度、可溶性固形物含量等[29]。核心基因Zm00001d012460編碼BAG家族蛋白,該蛋白與細胞凋亡調節(jié)有關,Earp等[23]通過對禾本科作物的研究發(fā)現,除了高粱以外其他大部分禾本科作物隨著籽粒的成熟,果皮細胞將經歷PCD過程,使果皮呈現出厚度逐漸降低的趨勢。Magenta模塊中的核心基因Zm00001d041214編碼種質膜H+-ATP酶,該基因的突變會導致擬南芥植株發(fā)育受限,生長素誘導的信號級聯反應中,最終作用到質膜H+-ATP 酶,被生長素信號激活增強的質子泵將H+送進細胞壁降低pH值,激活細胞壁內對pH值敏感的酶和蛋白質,造成細胞壁松動、延伸和生長[30]。核心基因Zm00001d048143編碼一種細胞周期蛋白,細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)是一個重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族,在細胞有絲分裂中起著重要的作用[31-32]。前人在番茄果皮發(fā)育的研究中發(fā)現,過表達或抑制CDK蛋白相關基因的表達會顯著影響番茄果皮的細胞層數和厚度[33]。

3.3 特異性模塊內與果皮厚度相關基因挖掘

甜玉米乳熟期果皮厚度容易受環(huán)境因素影響,目前尚未有控制甜玉米果皮厚度發(fā)育相關基因被克隆的報道。本研究通過基因共表達網絡構建與基因功能注釋信息分析,鑒定到與甜玉米乳熟期果皮厚度相關的重要候選基因。在Turquoise模塊中包含編碼細胞分裂素N-葡萄糖基轉移酶的基因ZmCNGT(Zm00001d019265),研究表明,該基因控制玉米籽粒中細胞分裂素的含量,并且該基因還可以觸發(fā)玉米生殖器官細胞的程序性死亡[34]。Fahima等[35]對荔枝施用外源細胞分裂素,發(fā)現荔枝果皮的細胞分裂受到顯著影響,荔枝果皮厚度變厚。在Turquoise模塊中鑒定到編碼赤霉素氧化酶的GA2ox9(Zm00001d008909),該基因影響玉米組織器官中的赤霉素(Gibberellin,GA)含量,通過對玉米葉片不同部位的激素含量測定,發(fā)現在細胞分裂區(qū)(Division zone)的赤霉素含量顯著高于其他部位,GA含量對細胞分裂的速度以及組織伸長具有重要的影響[36]。果膠是植物細胞壁的主要組成成分,它被合成后作為高度甲基酯化的聚合物分泌到細胞壁,Turquoise模塊中的ZmPME(Zm00001d050082)編碼果膠甲基酯酶,該酶可以將高度甲基酯化的聚合物去甲酯化,它的活性影響細胞與細胞之間的聚合力,進而影響細胞壁松弛或緊密程度[37-39]。細胞壁的松弛程度會直接影響到細胞壁的厚度以及果皮細胞之間的排布緊密程度,而這2個因素是影響果皮厚度關鍵因素[40]。Yellow模塊中的PGL17(Zm00001d052103)控制聚半乳糖醛酸酶的合成,該酶是果膠降解的關鍵酶,參與各種發(fā)育過程,如果實成熟、細胞擴增和器官脫落[41],可能是參與甜玉米果皮厚度調控的重要候選基因。

本研究鑒定的4個與果皮厚度顯著相關的模塊均與生長素轉錄因子構成網絡關系,如ARF1、ARF7、ARF22、IAA2、IAA25等。其他作物研究發(fā)現,生長素相關基因與果皮的厚度有關,例如Liu等[42]利用番茄的gib-3突變體對番茄果皮細胞層數進行研究發(fā)現,施加IAA的突變體番茄果皮的平均細胞層數為24.5,而沒有施加IAA的番茄果皮的平均細胞層數只有13.3。除生長素轉錄因子外共表達網絡分析還鑒定到bZIP、ERF和MYB等轉錄因子與甜玉米果皮厚度具有共表達關系。bZIP轉錄因子可以調節(jié)多種生物過程,如種子成熟、生殖器官的發(fā)育、蔗糖信號轉導和病原體防御等[43]。通過前人的研究證實生長素、細胞分裂素、赤霉素、脫落酸等植物激素在植物的果皮發(fā)育過程中可能起著關鍵的作用,對果皮厚度和層數的變化都有著十分重要的影響。

本研究利用乳熟期不同果皮厚度甜玉米自交系M03和M08的籽粒果皮為材料,結合果皮厚度表型數據和轉錄組測序數據,聯合差異表達基因分析和WGCNA分析共鑒定了4個與果皮厚度顯著相關的共表達模塊和13個核心基因。通過基因功能注釋發(fā)現這些模塊及其核心基因與果皮厚度調控緊密相關。同時,在對模塊內基因網絡關系的分析過程中發(fā)現了可能參與調控甜玉米乳熟期果皮厚度的其他基因和轉錄因子。結果表明,淀粉含量、細胞分裂和細胞凋亡等相關基因在甜玉米乳熟期果皮厚度的調控中發(fā)揮著重要的作用。本研究結果為甜玉米果皮厚度發(fā)育的分子機制研究提供了線索,也為培育優(yōu)質口感的甜玉米品種提供理論支持。