喻義杭 陳園園 蔡青山 孔 嬌 趙亞芳

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性傳染性疾病。隨著新型冠狀病毒的大流行，2022 年結(jié)核病成為全球僅次于新型冠狀病毒感染傳染病死因[1]，嚴重危害全球人民的生命與健康。雖然目前有眾多的檢測手段，但據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）估計仍有近一半的病例未能確診。近年來基于成簇規(guī)律間隔短回文重復序列及其相關(guān)蛋白（clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas，CRISPRCas）系統(tǒng)發(fā)展迅速，其研發(fā)成果已應用于基因編輯和體外分子診斷，國外已開發(fā)出多種用于高敏感性核酸檢測的通用系統(tǒng)，例如Viqilant[2]、RAA-cas12atg[3]和ACasB[4]。本文通過對目前CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的研究現(xiàn)狀進行綜述，進而探討其應用前景和面臨的挑戰(zhàn)。

1 CRISPR-Cas 系統(tǒng)簡介

1.1 發(fā)展歷史 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是細菌和古細菌在長期的斗爭中形成的適應性免疫系統(tǒng)，其利用RNA 引導的核酸酶靶向并降解外源核酸，保護細菌和古細菌免受外來遺傳物質(zhì)的干擾[5]。1987 年日本科學家Ishino 首次在大腸埃希菌基因組中發(fā)現(xiàn)了一段具有重復DNA 序列的遺傳物質(zhì)[6]，隨后的1991 年在結(jié)核分枝桿菌中也發(fā)現(xiàn)了這一重復序列[7]。后來這段重復的遺傳物質(zhì)被命名為CRISPR，與其相關(guān)的蛋白就被叫做Cas 蛋白。2012 年Jinek 等在由結(jié)合CrRNA（CRISPR RNA）組成的雙RNA 結(jié)構(gòu)中，指導CRISPR相關(guān)蛋白在靶DNA 中進行切割并與相應序列互補位點的結(jié)合，揭示了CRISPR-Cas 系統(tǒng)在基因編輯方面的價值[8]。2016 年P(guān)ardee 等[9-11]將CRISPR-Cas9系統(tǒng)與核酸依賴性擴增檢測技術(shù)相結(jié)合，成功地從病毒性獼猴的血漿中檢測出寨卡病毒，其檢測限達到了1 fmol 并能檢測區(qū)分具有單堿基差異的不同病毒亞型，這表明了該項技術(shù)具有在體外檢測病原體的能力。后來張鋒團隊開發(fā)的SHERLOCK 可將三種不同序列偏好的Cas13 蛋白與一種Cas12 蛋白放在同一個體系中，同時實現(xiàn)對四種不同病原體的檢測，提高了檢測效率，擴展了臨床應用范圍[12]。目前第二代的SHERLOCK[13]通過將Cas13a 與Csm6（一種輔助的CRISPR 核酸酶）相結(jié)合，并用稀釋的方法對等溫擴增引物非飽和反應，敏感性提高了3 倍以上，實現(xiàn)了從定性到定量的跨越。CRISPR-Cas 系統(tǒng)作為一項革命性的技術(shù)，自誕生起迅速成為了生命科學的研究熱點，特別是在生物醫(yī)學及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域。

1.2 工作流程 CRISPR-Cas 系統(tǒng)是由前導區(qū)（leader）、重復序列（repeat）、間區(qū)（spacer）及CRISPR相關(guān)蛋白四個部分構(gòu)成，不同物種Cas 基因編碼形成不同功能的Cas 蛋白[14]。前導區(qū)是CRISPR 轉(zhuǎn)錄的啟動區(qū)域和結(jié)合位點，當外來病毒入侵細菌時，為了獲取外源基因，細菌會表達出相應的Cas 蛋白，主要是Cas1 和Cas2 的參與，可通過識別特異的前間隔序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），將其附近的原間隔序列DNA 加工成一定長度的新的間隔序列，插入自身基因組（CRISPR 序列）中。當外源基因再次入侵時，CRISPR 基因組轉(zhuǎn)錄出帶有間隔區(qū)序列的CrRNA 與Cas 蛋白形成Cas 蛋白/CrRNA/靶DNA 復合體發(fā)揮切割作用，這個復合物可產(chǎn)生兩種核酸酶活性[10-11，15]，一種是在PAM 序列遠端特異切割dsDNA（順式切割活性），另一種是非特異性切割周圍的ssDNA（反式切割活性）。通過設(shè)計crRNA 的序列，使Cas 蛋白/CrRNA/靶DNA 復合體特異識別外源片段，激活Cas 蛋白的核酸剪切酶活性，對體外的外源性遺傳物質(zhì)片段發(fā)揮分割作用。

1.3 分 類 原核生物的CRISPR/Cas 系統(tǒng)總體可以分為2 大類[16]，即Class1 和Class2，每類由幾種類型和亞型組成。CRISPR/Cas1 類系統(tǒng)，由多種效應部蛋白質(zhì)復合物組成，每種蛋白質(zhì)在CRISPR 過程中執(zhí)行的功能較為單一。第2 類CRISPR/Cas 系統(tǒng)雖然是一個單一的效應部蛋白，但是在CRISPR 過程中具有多種功能，因具有簡單高效的特點，廣泛地應用在分子診斷學領(lǐng)域。按照效應蛋白分類Class1 可分為3 種類型和12 個亞型[17]，Class2 分為3 種類型和9 個亞型[18]，包括Cas9、Cas12、Cas13，不同的Cas 蛋白具有不同的切割特點，Cas9 蛋白切割的是雙鏈DNA（dsDNA）、Cas13 切割的是單鏈RNA（ssRNA）、Cas12 切割的是單鏈DNA（ssDNA），三者都需要PAM 的協(xié)助，Cas9 蛋白識別的PAM 位點是NGG，Cas12 蛋白識別的PAM 位點是TTN，Cas13 蛋白識別位點為PAM 下游的A、U、C，當靶基因沒有其特異的PAM 位點時，會限制其應用。

2 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的研究現(xiàn)狀

Ai 等[19]開發(fā)了一種由CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)介導的，將結(jié)核分枝桿菌基因組中IS6110 作為檢驗靶標，結(jié)合重組酶多聚酶擴增（recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)的一種快速、簡便、靈敏的結(jié)核分枝桿菌檢測方法。在肺結(jié)核和肺外結(jié)核的隊列中，其總體敏感性和特異性分別為79%和98%，在肺結(jié)核的隊列中敏感性為90%，特異性為97%，達到了單拷貝分析敏感性，同時樣本輸入（500 μL）更少、花費的時間（1.5 h）也更少。有學者為了進一步提高敏感性，在結(jié)合RPA 技術(shù)的CRISPR-Cas12a 系統(tǒng)檢測平臺中，專門設(shè)計了一種具有熒光團和猝滅劑的長寡核苷酸探針，以識別核酸酶特異性切割的RPA 擴增子，將檢驗靶點改為IS1081，這種熒光分子是通過游離DNA 與淬滅劑連接在一起，只有二者分離，才能檢測出熒光信號，并能通過肉眼觀察顏色改變進行定性、且熒光的強弱與濃度存在良好的線性相關(guān)（R2=0.9775）[20]。其敏感性提高到了99.2%，特異性為100%，與金標準培養(yǎng)法的結(jié)果相當。但是其花費的時間與Xpert 相比處于劣勢，幾乎是后者花費時間的2 倍。Sam 等[21]運用Cas12b 蛋白結(jié)合環(huán)介導等溫擴增技術(shù)（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），建立了一種新型結(jié)核分枝桿菌DNA 檢測平臺（TBQUICK），檢測低限低至1.3 拷貝/μL。TB-QUICK 不僅在結(jié)核分枝桿菌檢測中表現(xiàn)出具有86%的總體敏感性，超過了WHO 推薦用于臨床實踐的Xpert[22]，而且在抗酸桿菌涂片鏡檢陰性的患者中也達到了80%的敏感性。這表明CRISPR-Cas 系統(tǒng)在涂片抗酸染色為陰性或者在標本含菌量很少出現(xiàn)的情況下也可以檢測識別出結(jié)核分枝桿菌。Wang 等[23]開發(fā)了一種新的檢測平臺，稱為LACD。在這套系統(tǒng)中可以檢測任何目標序列，通過觀察實時熒光儀信號的變化和橫向流生物傳感器上游離DNA 的降解進行檢測，其敏感性為79.5%、特異性為100%。正因為CRISPR-Cas系統(tǒng)對非侵入性標本如痰液、胃內(nèi)容物、糞便病原菌的檢出具有高度敏感性，在標本含菌量很少的情況下也能檢測出病原菌。Lyu 等[24]認為，基于CRISPRCas 系統(tǒng)的生物技術(shù)在兒童肺結(jié)核的病原學診斷方面有著很大的應用前景，這種技術(shù)能夠減少兒童的有創(chuàng)操作，減輕患兒的痛苦，提升就醫(yī)體驗，提高兒童結(jié)核病的診治能力。Huang 等[25]美國學者發(fā)現(xiàn)，CRISPR 對攜帶艾滋病病毒的兒童肺結(jié)核檢測具有高度敏感性，其敏感性和特異性分別為100%和85%，這主要是通過使用超靈敏的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)檢測結(jié)核桿菌的游離DNA 實現(xiàn)的。同時發(fā)現(xiàn)，血清中的游離DNA 濃度與抗結(jié)核藥物使用時間呈現(xiàn)負相關(guān)，說明它還具有監(jiān)測抗結(jié)核藥物治療作用的能力。Xiao 等[26]將Cas12a 蛋白與靶向rpoB 序列的物種特異性gRNA 探針相結(jié)合，首次實現(xiàn)了結(jié)核分枝桿菌和臨床常見的幾種非結(jié)核分枝桿菌的鑒別，正確率接近100%。但這項研究未在真實的臨床環(huán)境中進行驗證，無法得到真實世界的數(shù)據(jù)。為探索CRISPR-Cas 系統(tǒng)在耐藥基因檢測中的價值，有學者將鏈霉素耐藥基因中的Lys43Arg 和Lys88Arg 位點作為靶基因進行檢測，只需要1 h 就可以完成檢測，其敏感性為100%、特異性100%[27]。另一項研究運用Cas13a 蛋白檢測耐氟喹諾酮類結(jié)核桿菌中的gyrA基因，其特異性和敏感性分別為100%和91.4%[28]。

3 CRISPR-Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌檢測中的局限性

CRISPR/Cas 系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌的檢測中也存在一些局限：（1）主要存在著脫靶的風險，且隨時間的延長，其脫靶率也隨之上升，后期其脫靶效應可高達66%[29]，這主要是PAM 序列與單向?qū)NA（single guide RNA，sgRNA）序列[30]存在一定概率的錯配引起的；（2）DNA 擴增過程中存在的假陽性；（3）目前的研究只選擇大分子的Cas 蛋白作為載體；（4）目前基于CRISPR-Cas 系統(tǒng)的檢測技術(shù)大多數(shù)需要事先核酸擴增，擴增過程中存在交叉污染的可能；（5）現(xiàn)有研究只針對結(jié)核分枝桿菌單個靶基因的檢測、有一定的假陰性，而且無法進行定量檢測。

4 總結(jié)與展望

結(jié)核病是全國第二大傳染病死亡原因，盡管有眾多的檢測手段，但仍有一半的病例未能確診，因此急需一種簡便快捷、低成本、高靈敏的檢測方案，而CRISPR-Cas 系統(tǒng)正好滿足這些要求。CRISPR-Cas系統(tǒng)作為一項新技術(shù)也并非完美，筆者認為未來可以從以下方面進行研究：（1）針對結(jié)核分枝桿菌不同基因的多重檢測方法；（2）CRISPR-Cas 系統(tǒng)與納米電子學、液滴微流控、免疫色譜法、酶促重組酶擴增等其他技術(shù)進行結(jié)合，往多重耐藥基因、定量、自動化、免核酸擴增方向進行研究；（3）選擇不同切割能力的Cas 蛋白，如Cas9、Cas13、Cas14 等；（4）16S rRNA[31-32]是分枝桿菌屬菌種共有高度保守又有高度多態(tài)性序列，我們可以把這種既含屬特異性位點，又有種特異性位點的基因作為分枝桿菌屬種鑒定的靶基因，同時將IS6110、IS1081 等保守區(qū)域作為結(jié)核分枝桿菌的靶基因，研發(fā)肉眼即可判讀檢測結(jié)果且不需要特殊設(shè)備的快速分枝桿菌分型檢測平臺?？傊?，基于CRISPR 的檢測方法具有花費時間少、低成本、可視化、高敏感性的特點，能有效提高廣大基層醫(yī)院結(jié)核病的防治水平，實施更加精準的治療，及時調(diào)整抗生素方案，為結(jié)核分枝桿菌檢測提供新的思路。