李海倫，高寧寧，李曉慧，康利允，常高正，梁 慎，王慧穎，徐小利，趙衛(wèi)星

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所 鄭州 450002）

甜瓜（Cucumis meloL.）是葫蘆科甜瓜屬一年生草本植物，具有豐富的營養(yǎng)價值和可觀的經(jīng)濟價值，在全球范圍內(nèi)廣泛種植。甜瓜產(chǎn)業(yè)在我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)中占據(jù)重要地位，具有廣闊的前景。目前，甜瓜優(yōu)異種質(zhì)資源更新滯后且無法滿足市場需求，因此亟需加速育種工作的進度。單倍體培養(yǎng)是創(chuàng)制新種質(zhì)的重要手段，利用甜瓜未授粉子房或胚珠離體培養(yǎng)獲得單倍體，將有效加速甜瓜育種進程，其中，材料是培養(yǎng)成功的先決條件。同時甜瓜離體雌核培養(yǎng)獲取單倍體技術(shù)還處于初級階段，并未獲得較成熟的技術(shù)，加快培養(yǎng)進度需大量的供試材料，而甜瓜未授粉子房的取材受生長季節(jié)的限制。為解決材料供應(yīng)問題，筆者通過在甜瓜生長季節(jié)大量取樣，并進行超低溫保存，增加供材量和延長供樣期，從而加速甜瓜單倍體的培育進程。

適宜的保存條件可以使細(xì)胞分裂和代謝暫時處于停滯狀態(tài)從而延長生命周期，還可以最大程度保持材料的遺傳穩(wěn)定性。其中，超低溫保存方法是將植物的細(xì)胞、組織、器官等離體材料存放于液氮（-196 ℃）中保存[1]，該方法備受青睞，在花粉、莖尖、休眠芽、愈傷組織等離體組織中被廣泛應(yīng)用[2-6]，但對甜瓜子房的保存鮮見報道。筆者的研究結(jié)合包埋法和玻璃化法對超低溫保存方法進行改良，旨在探索最適合甜瓜子房的保存方法，最大限度減少材料損傷，并保持較高的活性，以期加速甜瓜單倍體育種的進度，為創(chuàng)制新種質(zhì)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

供試厚皮甜瓜品種為晚熟品種眾云18（網(wǎng)紋紅肉）和早熟品種錦繡（白皮紅肉），均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所西瓜甜瓜課題室提供。

1.2 設(shè)計

眾云18 和錦繡于2019 年5 月在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)開發(fā)研究基地連棟大棚種植，采用常規(guī)管理。每個材料種植20 株。在甜瓜花期，于開花前一天09：00—11：00 取長勢健壯無損傷的未授粉子房，帶回實驗室4 ℃暗處理2 d。2 種材料的每一批取樣的樣本數(shù)量相同，每個處理各取30 個甜瓜子房，每個處理每個材料分別設(shè)置3 次重復(fù)。

1.3 方法

1.3.1 甜瓜子房消毒滅菌 把2 d 暗處理后的子房用流水沖洗0.5～1.0 h，去除子房表面茸毛，洗凈后在超凈工作臺上用70%乙醇消毒30 s，再用無菌水清洗3 遍，接著用0.2%次氯酸鈉滅菌10 min，最后用無菌水沖洗3～5 遍，備用。

1.3.2 改良超低溫保存方法建立 （1）預(yù)處理：把子房分別進行縱切和橫切，放入0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中，置于培養(yǎng)間中暗培養(yǎng)8、24、48、72、96 h。（2）包埋：取出預(yù)培養(yǎng)的子房，晾干表面液體，用3%海藻酸鈉將子房完全包裹，再用0.1 mol·L-1氯化鈣固定10 min，取出晾干。（3）加載：把包裹的子房放入加載液（1/2 MS+136 g·L-1蔗糖+180 g·L-1甘油）中，處理20 min，取出晾干。（4）脫水：用PVS2 玻璃化液（MS+300 ml·L-1甘油+150 ml·L-1乙二醇+150 ml·L-1二甲基亞砜+136 g·L-1蔗糖）給予30、60、90 min 處理，取出晾干。（5）低溫保存：用無菌鋁箔紙把處理過的子房包裹好迅速放入液氮（-196 ℃）中保存。

1.3.3 低溫保存后恢復(fù)培養(yǎng) （1）解凍：將保存0、20、40、60 d 的子房放入25、38、40、42 ℃恒溫的卸載液（MS+410 g·L-1蔗糖）中解凍5 min，最后再用新卸載液清洗一遍，晾干。（2）接種：將解凍的子房接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（MS+0.03 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1KT+150 mL·L-1椰汁+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂）。（3）培養(yǎng)：接種后的子房在黑暗條件下，培養(yǎng)箱中34 ℃熱激3 d，光照度1500～2000 lx、16 h/8 h 光暗周期的培養(yǎng)室中進行培養(yǎng)。（4）恢復(fù)培養(yǎng)后甜瓜子房存活率：子房存活率/%=接入子房成活數(shù)/接入子房的總數(shù)×100。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2016 工具進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析和制圖，采用SPASS 21 軟件進行One-way ANOVA 法單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)培養(yǎng)時間對甜瓜子房存活率的影響

預(yù)培養(yǎng)可通過減少細(xì)胞內(nèi)含水量和提高細(xì)胞分裂分化能力來改善材料的生理狀態(tài)，提高材料的抗凍性。筆者通過高濃度蔗糖溶液進行預(yù)培養(yǎng)來提高超低溫保存后材料的存活率。如圖1 所示，子房預(yù)培養(yǎng)的時間不同，超低溫保存后子房的存活率也存在差異。隨著預(yù)培養(yǎng)時間的增加，子房的存活率呈先增高后降低的趨勢。預(yù)培養(yǎng)8 h 時，冷凍20 d后子房的存活率只有55%左右；預(yù)培養(yǎng)24 h 時，眾云18 和錦繡的子房存活率分別高達82.30%和82.80%；預(yù)培養(yǎng)48 h 時，子房存活率開始降到71%左右；預(yù)培養(yǎng)72 h 時，子房存活率持續(xù)降低到50%左右；預(yù)培養(yǎng)96 h 時，子房存活率低至45%左右。預(yù)培養(yǎng)的時間過長易導(dǎo)致細(xì)胞過度脫水而造成損傷，進而影響子房的存活率。在0.4 mol·L-1的蔗糖溶液中預(yù)培養(yǎng)24 h 和48 h 時子房存活率的差異不顯著，但24 h 的預(yù)培養(yǎng)極大地縮短了培養(yǎng)時間，所以預(yù)培養(yǎng)24 h 效果最佳。

圖1 預(yù)培養(yǎng)時間對低溫保存子房存活率的影響

2.2 PVS2 玻璃化液處理時間對甜瓜子房存活率的影響

超低溫保存的程序中玻璃化過程是最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，其中，玻璃化液處理時間也至關(guān)重要。由圖2可知，隨著PVS2 處理時間的增加，子房凍后的存活率逐漸降低。處理30 min 時存活率最高，2 個甜瓜品種的子房存活率均在82%以上。處理60 min時也均在81%左右，與處理30 min 時存活率無顯著差異，但都顯著高于處理90 min。隨著PVS2 脫水處理時間的增加，PVS2 的毒害作用也逐漸增強，從而導(dǎo)致子房存活率下降。為避免PVS2 玻璃液的毒害作用加劇，以30 min 為最佳處理時間。

圖2 PVS2 處理時間對低溫保存子房的影響

2.3 解凍溫度對甜瓜子房存活率的影響

解凍是材料恢復(fù)培養(yǎng)最關(guān)鍵的一步，迅速解凍可以避免細(xì)胞內(nèi)再次出現(xiàn)結(jié)冰而造成細(xì)胞死亡。采用MS+410 g·L-1 蔗糖卸載液解凍，分析不同解凍溫度對子房存活率的影響，由圖3 可知，當(dāng)解凍溫度為25 ℃時，子房的存活率遠(yuǎn)低于50%，隨著解凍溫度的升高，子房的存活率也隨之增高。解凍溫度在38 ℃時，子房存活率最高，晚熟品種眾云18 和早熟品種錦繡都在80%左右；解凍溫度在40 ℃和42 ℃時，子房存活率略低于38 ℃，但無顯著差異，以38 ℃為最佳解凍溫度。

圖3 解凍溫度對低溫保存子房的影響

2.4 超低溫保存時長對甜瓜子房存活率的影響

理論上材料保存在液氮中保存時間的長短不會影響其存活率。采用改良的超低溫保存方法把眾云18 和錦繡未授粉子房預(yù)培養(yǎng)24 h，經(jīng)過3%海藻酸鈉包埋，0.1 mol·L-1氯化鈣固定，加載液處理20 min，PVS2 脫水30 min，鋁箔紙包裹迅速放入液氮中保存。為分析保存時長對材料存活率的影響，將保存了0、20、40、60 d 的子房在38 ℃的卸載液中處理5 min 進行解凍，再接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果如表1 所示，0 d 時2 個甜瓜材料子房的存活率都在92%以上；隨著保存時間的延長，子房的存活率也開始降低；保存20、40 d 和60 d 時存活率在80%～87%之間，子房存活率無顯著差異，表明液氮保存時長對凍后子房的存活率無明顯影響，且保存60 d 時子房的存活率仍在80%以上。

表1 低溫保存不同時間未授粉子房的存活率%

3 討論與結(jié)論

超低溫保存法可以保持材料正常的細(xì)胞活性、全能性和遺傳性，且操作簡單、成本低，并能長期保存，適用于細(xì)胞、組織等離體材料的保存。筆者采用包埋法和玻璃化法結(jié)合的改良超低溫保存法對甜瓜離體子房進行保存。經(jīng)過4 ℃暗處理2 d 的子房，先用0.4 mol·L-1蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)24 h，再用3%海藻酸鈉包埋并用0.1 mol·L-1氯化鈣固定，經(jīng)過加載液（1/2 MS+136 g·L-1蔗糖+180 g·L-1甘油）處理后，再用PVS2（MS+300 ml·L-1甘油+150 ml·L-1乙二醇+150 ml·L-1二甲基亞砜+136 g·L-1蔗糖）脫水，接著用鋁箔紙包裹迅速放入液氮中保存，最后用卸載液（MS+1.2 mol·L-1蔗糖）解凍接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行恢復(fù)培養(yǎng)。筆者使用改良超低溫保存法對甜瓜離體子房組織進行保存，可解決甜瓜未授粉子房離體培養(yǎng)材料受生長季節(jié)和生長期的影響而導(dǎo)致的供應(yīng)不足的問題。

材料的選擇對超低溫保存后植物的存活率起決定性作用[7]。已報道的超低溫保存的研究材料有胚性愈傷組織、原生質(zhì)體、體細(xì)胞胚、小孢子、花粉、不定芽、腋芽、休眠芽、莖尖、種子、幼苗等[6，8-17]，但還未發(fā)現(xiàn)對甜瓜子房保存研究的相關(guān)報道。甜瓜子房體積偏大，在超低溫保存的程序中需要先通過預(yù)處理來減少細(xì)胞內(nèi)含水量，避免其在PVS2 脫水過程中細(xì)胞脫水死亡而影響存活率。預(yù)培養(yǎng)、低溫鍛煉等[18-19]是常用的預(yù)處理方法。預(yù)處理的目的是改善材料的生理狀態(tài)，使細(xì)胞內(nèi)自由水含量減少以提高材料的抗凍性[20]。筆者采用0.4 mol·L-1的蔗糖保護液預(yù)培養(yǎng)24 h，眾云18 和錦繡子房的存活率均在82%以上。白建明等[21]在馬鈴薯莖尖研究中用0.3 mol·L-1的蔗糖溶液，李泳[22]在羅漢果莖尖中用0.7 mol·L-1蔗糖溶液，均預(yù)培養(yǎng)24 h，獲得最高的存活率。也有研究表明，高潔等[23]在紅掌腋芽中用0.4 mol·L-1蔗糖溶液預(yù)培養(yǎng)96 h 效果最佳，說明不同種植物的預(yù)培養(yǎng)時間可能與其保存的組織部位以及預(yù)培養(yǎng)液的濃度有關(guān)。

玻璃化液處理是將細(xì)胞內(nèi)的自由水從液態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)椴ＡЩ癄顟B(tài)，避免細(xì)胞內(nèi)形成冰晶來提高細(xì)胞的抗凍能力[24]。PVS2 是最常使用且效果最佳的玻璃化保護液。筆者采用PVS2 玻璃化液處理30 min，眾云18 和錦繡子房存活率分別高達82.13%、83.40%，軟棗獼猴桃莖尖用PVS2 處理40～60 min，而休眠芽需要120 min 效果最好[4，14]；扁桃休眠芽則需要70 min[25]；羽狀雞冠花幼苗需要處理60 min[17]；越橘腋芽需要40 min[13]；九里香種子處理30 min[26]。但也有研究表明，PVS2 處理反而降低存活率[27]。不同材料的組織部位PVS2 處理存在較大的差異，因此，需要篩選適合的PVS2 玻璃化液處理時間。晉玲等[28]認(rèn)為PVS2 處理時間一般是在20～100 min。

解凍是超低溫保存過程中防止材料受到損傷的關(guān)鍵，在解凍過程中若不能快速解凍材料，容易使細(xì)胞內(nèi)再次結(jié)冰造成細(xì)胞死亡，所以要針對保存的材料選擇適合的解凍方式。理論上一般采用37～40 ℃恒溫解凍。梨莖尖在25 ℃水浴解凍效果好[29]；白菜小孢子37 ℃恒溫水浴40 s 解凍效果最佳[10]；柿子休眠芽在40 ℃時快速解凍的效果較好[30]；而密花石斛花粉在室溫和37 ℃解凍無明顯差異[27]。筆者的研究中甜瓜子房在卸載液中恒溫38 ℃解凍5 min 效果最好。在解凍時為避免PVS2在材料細(xì)胞內(nèi)的毒害作用，需要卸載液洗滌。筆者的試驗使用的卸載液是MS+410 g·L-1蔗糖。有研究表明，在解凍時高濃度的蔗糖可防止水分的快速進入，降低冰晶對細(xì)胞的損傷。軟棗獼猴桃休眠芽[14]和藍果忍冬莖尖[31]在卸載液MS+1.2 mol·L-1蔗糖中處理30 min 達到最好效果，與筆者試驗的卸載液配方相同，但筆者的研究縮短了解凍時間。九里香種子[26]只要40 ℃溫水解凍2 min 就能達到理想效果，說明解凍方式以及解凍的溫度和時間與物種及材料部位和大小密切相關(guān)。

材料在超低溫保存的過程中生理活動處于近乎停止的狀態(tài)，理論上可以長久保存。早在1997年對櫻桃莖尖超低溫保存1 d 和10 min 的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者并沒有表現(xiàn)出明顯差異[32]；芍藥花粉超低溫保存4 a 和美國山核桃花粉保存10 a 以上都還具有生活力[33-34]；秦艽休眠芽在超低溫保存1、14、28、46 d 存活率也沒差異[35]；軟棗獼猴桃莖尖在液氮中保存時間長短并未對材料的存活力造成明顯區(qū)別[4]。這些報道與筆者的研究結(jié)果一致，甜瓜子房在超低溫保存20、40、60 d 后子房存活率并無顯著差異，說明超低溫保存時長對子房的存活率影響不明顯。本試驗結(jié)果表明，甜瓜子房在超低溫保存60 d 后仍可維持較高的存活率，隨著低溫保存時間的延長，其存活率雖然開始降低，但保存時長之間的差異并不顯著。

筆者首次嘗試以子房作為保存材料進行研究，甜瓜子房通過預(yù)培養(yǎng)24 h，用海藻酸鈉包埋，氯化鈉固定，經(jīng)加載液處理20 min，PVS2 脫水30 min，用鋁箔紙包裹放入液氮中保存，之后卸載液在38 ℃恒溫解凍5 min，接入誘導(dǎo)培養(yǎng)基中即可恢復(fù)培養(yǎng)。初步得到甜瓜子房超低溫保存的條件，建立適合甜瓜子房超低溫保存及恢復(fù)培養(yǎng)的體系。該技術(shù)有效地解決了甜瓜大孢子培養(yǎng)供體不足且無法長期持續(xù)供應(yīng)的問題，為葫蘆科作物大孢子超低溫保存提供了可靠的技術(shù)參考。