劉 潔,梅軍華,張立成

(黃岡市中心醫(yī)院,湖北 黃岡 438000)

子宮內(nèi)膜癌是發(fā)生在子宮內(nèi)膜的一組上皮惡性腫瘤,主要是由于刺激素過(guò)度刺激子宮內(nèi)膜引起,且肥胖、高血壓、月經(jīng)初潮、不孕不育及卵巢疾病等均為該疾病高危因素[1-2]。Sugiura 等[3]研究表明:子宮內(nèi)膜癌好發(fā)于絕經(jīng)期及絕經(jīng)后女性中,且70.0%～75.0%患者為絕經(jīng)后女性,且隨著人們生活方式改變,導(dǎo)致疾病發(fā)生率呈上升趨勢(shì),居?jì)D科惡性腫瘤首位[4-5]。手術(shù)、放化療是子宮內(nèi)膜癌患者常用的治療方法,但是患者5年生存率較低、預(yù)后較差[6]。瑞芬太尼屬于是阿片類藥物的一種,不僅能用于臨床麻醉,亦可通過(guò)抑制Akt通路、調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤(B cell lymphoma,Bcl)-2相關(guān)蛋白,可抑制細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其凋亡,但是藥物在子宮內(nèi)膜癌中的作用效果研究較少。近年來(lái),有報(bào)道[7]指出,多種微小RNA(microRNA,miRNA)能直接參與人類癌癥的發(fā)病過(guò)程,miRNA可作為癌基因和腫瘤因子發(fā)揮作用。miRNA是一類大約19～24個(gè)核苷酸構(gòu)成的非編碼小RNA分子,通過(guò)靶向下游mRNA影響其轉(zhuǎn)錄或翻譯,從而調(diào)控基因的表達(dá)。已有文獻(xiàn)[8]報(bào)道,miR-212-3p參與各種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,且在胃癌、骨肉瘤等實(shí)體瘤中呈低表達(dá),影響腫瘤細(xì)胞的遷移與侵襲,而LIN28B是其靶基因,在肝癌、宮頸癌等病灶組織中表達(dá)異常,能作為患者預(yù)后的生物指標(biāo)[9]。本研究以子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞為研究對(duì)象,探討瑞芬太尼在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖及遷移中的調(diào)節(jié)機(jī)制及對(duì)miR-212-3p/LIN28B通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,購(gòu)自于上海生化細(xì)胞研究所,并將其置于RPMI-1640培養(yǎng)基中,連續(xù)完成24 h培養(yǎng),培養(yǎng)溫度37 ℃,將最終獲得的細(xì)胞放置在4個(gè)不同試管中,備用。Transwell小室,購(gòu)自于美國(guó)Corning公司;Lipofcctaminc 2000購(gòu)自于Invitrogcn公司;四甲基偶氮唑藍(lán),購(gòu)自于美國(guó)Sigma公司;引物序列、miR-212-3p模擬物及抑制劑、LIN28B小干擾RNA等,均購(gòu)自于廣州銳博生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、處理及轉(zhuǎn)染:①細(xì)胞培養(yǎng):取子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,常規(guī)復(fù)蘇后,加入10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中,并將其置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞融合80.0%～90.0%時(shí),加入胰蛋白消化。常規(guī)制成細(xì)胞懸液后,進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個(gè)/ml子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,將其接種在6孔培養(yǎng)板中,連續(xù)完成24 h培養(yǎng),備用[10]。②細(xì)胞處理:取子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,隨機(jī)將其放置在4個(gè)試管中,分別給予瑞芬太尼5、50、500 ng/ml的培養(yǎng)基連續(xù)完成24 h培養(yǎng)備用[11],以瑞芬太尼0 ng/ml為對(duì)照組。③細(xì)胞轉(zhuǎn)染:取上述處理后的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,連續(xù)完成6 h轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-212-3p mimics、si-NC及si-LIN28B,連續(xù)完成24 h干預(yù),分別標(biāo)記為:miR-NC組、si-NC組、si-LIN28B組;將轉(zhuǎn)染anti-miR-NC和aiti-miR-212-3p的細(xì)胞采用500 ng/ml瑞芬太尼處理,并記為瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組和瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-miR-212-3p組。采用實(shí)時(shí)熒光PCR法測(cè)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞中miR-212-3p水平,驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果,并完成細(xì)胞收集、備用。

1.2.2 增殖抑制率檢測(cè):取各組處理后的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,將其接種在96孔板中,每孔細(xì)胞200 μl,連續(xù)完成12 h培養(yǎng),并加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl,37 ℃下進(jìn)行72 h培養(yǎng)。加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl,10 min孵育振蕩,于24、48、72 h采用酶標(biāo)儀在490 nm下完成吸光度值測(cè)定[12]。

1.2.3 miR-212-3p、LIN28B mRNA水平測(cè)定:取各組處理后的細(xì)胞,采用Trizol試劑完成細(xì)胞總RNA的提取,借助微量核酸儀完成RNA濃度提純后,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并進(jìn)行PCR測(cè)定。借助實(shí)時(shí)熒光PCR法測(cè)定miR-212-3p、LIN28B mRNA水平,設(shè)定條件:95 ℃變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,72 ℃下延伸30 s,連續(xù)完成循環(huán)45個(gè),測(cè)定Ct值。以β-actin作為內(nèi)參,采用2-△△Ct完成水平miR-212-3p、LIN28B mRNA測(cè)定[13]。

1.2.4 Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白測(cè)定:取上述細(xì)胞,完成總蛋白提取后,利用二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度,待上述操作完畢后,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。將獲得的蛋白轉(zhuǎn)移于聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,采用濃度為5%的脫脂牛奶常規(guī)下完成1 h封閉,4 ℃下加入細(xì)胞周期蛋白(Cyclin D1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及LIN28B蛋白一抗孵育,洗膜后加入二抗,1 h孵育后加入顯影劑,避光顯影,借助全能型成像分析系統(tǒng)拍照,分析目標(biāo)蛋白含量[14]。

1.2.5 遷移及侵襲檢測(cè):取上述處理后的子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞,將其接種在6孔板中,濃度為2.5×104個(gè)/ml,連續(xù)完成12 h培養(yǎng)后,去除培養(yǎng)基,整細(xì)胞濃度為1.0×105個(gè)/ml。①細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn):取處理后細(xì)胞10 μl,放于Transwell小室內(nèi),保證細(xì)胞懸液100 μl,并加入含有500 μl 10%FBS的培養(yǎng)基,連續(xù)完成24 h培養(yǎng)后去除培養(yǎng)基,采用4%多聚甲醛連續(xù)完成15 min固定,0.1%結(jié)晶紫染色后顯微鏡下觀察[15];②細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn):測(cè)定前在Transwell小室鋪設(shè)基質(zhì)膠,自然晾干后加入細(xì)胞懸液100 μl,其余操作同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)[16]。

2 結(jié) 果

2.1 四組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率比較 隨著時(shí)間延長(zhǎng)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率較為明顯,四組24 h細(xì)胞增殖率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P>0.05);且細(xì)胞增殖抑制率呈瑞芬太尼藥物劑量依賴性(500 ng/ml瑞芬太尼細(xì)胞增殖抑制率最高)。見表1。

表1 四組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖抑制率比較(%)

2.2 四組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞miR-212-3p、LIN28B mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)比較 四組不同濃度瑞芬太尼處理后miR-212-3p mRNA表達(dá)水平呈上升趨勢(shì)(均P<0.05),而LIN28B mRNA水平呈下降趨勢(shì)(均P<0.05),并呈劑量依賴性;Western Blot結(jié)果表明:四組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白表達(dá)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),隨著瑞芬太尼藥物劑量增加,其表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。見表2。

表2 四組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞miR-212-3p、LIN28B mRNA及相關(guān)蛋白表達(dá)比較

2.3 四組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移及侵襲情況比較 隨著瑞芬太尼濃度增加,遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)下降明顯,并表現(xiàn)出劑量依賴;不同濃度細(xì)胞遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表3。

表3 四組子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞遷移及侵襲情況比較(個(gè))

2.4 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲結(jié)果比較 miR-NC組細(xì)胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics(P<0.05),遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)高于miR-212-3p mimics組(均P<0.05),見表4。

表4 子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖、遷移及侵襲結(jié)果比較

2.5 抑制LIN28B蛋白對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響 抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B組細(xì)胞增殖抑制率高于si-NC組(P<0.05);遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及LIN28蛋白表達(dá)水平均低于si-NC組(均P<0.05),見表5。

表5 抑制LIN28B蛋白對(duì)子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞增殖、遷移及侵襲的影響

2.6 抑制miR-212-3p對(duì)500 ng/ml瑞芬太尼處理后細(xì)胞活性的影響 瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-212-3p組miR-212-3p、細(xì)胞增殖抑制率低于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組(均P<0.05),LIN28B蛋白表達(dá)、遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)高于瑞芬太尼500 ng/ml+anti-miR-NC組(P<0.05),見表6。

表6 抑制miR-212-3p對(duì)500ng/ml瑞芬太尼處理后細(xì)胞活性的影響

3 討 論

子宮內(nèi)膜癌屬于女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤,具有較高的發(fā)病率、致死率,對(duì)女性生命健康造成極大的威脅。Smith 等[17]研究表明:子宮內(nèi)膜癌病因較多,藥物、肥胖、生殖因素、糖尿病及飲食等,均會(huì)增加疾病發(fā)生率。目前,臨床上對(duì)于子宮內(nèi)膜癌以子宮切除手術(shù)、雙側(cè)輸卵管卵巢切除術(shù)及盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)為主,借助手術(shù)雖然能切除病灶組織,但是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)率較高。

阿片類藥物在晚期癌痛的治療中使用較多,而瑞芬太尼是芬太尼類μ型阿片受體激動(dòng)劑,在人體內(nèi)1 min左右可迅速達(dá)到血腦平衡,在組織和血液中可迅速被水解,具有起效速度快、維持時(shí)間短等優(yōu)勢(shì)[18]。夏瑩等[19]研究表明:瑞芬太尼的鎮(zhèn)痛、不良反應(yīng)呈劑量依賴性,對(duì)于μ型阿片受體激動(dòng)作用能被納洛酮拮抗。同時(shí),瑞芬太尼能通過(guò)抑制Akt通路及調(diào)控B細(xì)胞淋巴瘤(bcl)-2/Bcal-2相關(guān)蛋白表達(dá),抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,加快其凋亡速度。羅星等[20]研究表明:惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展常伴有細(xì)胞增殖的失控,而Cyclin D1可通過(guò)調(diào)節(jié)、激活細(xì)胞周期依賴性酶完成細(xì)胞的增殖與分裂,參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展。本研究中,四組不同濃度瑞芬太尼處理后miR-212-3p mRNA呈上升趨勢(shì),而LIN28B mRNA水平呈下降趨勢(shì);四組Cyclin D1、MMP-2、MMP-9及LIN28B蛋白比較差異具有統(tǒng)計(jì)意義,從本研究結(jié)果看出,瑞芬太尼作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中,能通過(guò)調(diào)節(jié)Cyclin D1、MMP-2及LIN28B蛋白影響細(xì)胞的增殖與分化。

miR-212-3p屬于是一種miRNA,在骨肉瘤、胰腺癌、胃癌等細(xì)胞中呈低表達(dá),與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等緊密相關(guān),可作為潛在的治療靶點(diǎn)。生物學(xué)軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明:LIN28同源物可能是miR-212-3p的基因靶點(diǎn)。LIN28屬于高度保守的鋅指家族蛋白成員,在肝癌、胃癌及宮頸癌等實(shí)體瘤中表達(dá)升高,可作為患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。而子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移與侵襲亦是惡性腫瘤重要的特征之一,發(fā)病后常伴有miRNA基因表達(dá)異常,可參與細(xì)胞的增殖、凋亡及分化過(guò)程。本研究中,隨著瑞芬太尼濃度增加,遷移細(xì)胞數(shù)與侵襲細(xì)胞數(shù)呈下降趨勢(shì),呈劑量依賴性;miR-NC組細(xì)胞增殖抑制率低于miR-212-3p mimics組;遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)多于miR-212-3p mimics組;抑制LIN28B蛋白后si-LIN28B細(xì)胞增殖抑制率高于si-NC組;遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)及LIN28蛋白均低于si-NC組。從本研究結(jié)果看出,miR-212-3p在子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮了重要的作用,能通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá),調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖與遷移,miR-212-3p有望成為子宮內(nèi)膜癌新的治療靶點(diǎn),通過(guò)有效的方法提高患者體內(nèi)miR-212-3p水平,能延緩病情發(fā)展,降低患者病死率。

綜上所述,瑞芬太尼能抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生物學(xué)活性,可能與藥物調(diào)控miR-212-3p/LIN28B通路有關(guān)。