馬戈甲 ,裴蛟淼,李 楊,韓 巖

(1.西安市中心醫(yī)院燒傷整形美容外科,陜西 西安 710004;2.空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院西京整形醫(yī)院,陜西 西安 710032;3.解放軍總醫(yī)院整復(fù)外科,北京 100853)

近年來,隨著社會(huì)發(fā)展,各種意外傷害造成大量患者因外傷導(dǎo)致了各種皮膚軟組織的缺損[1],部分缺損已經(jīng)不能用傳統(tǒng)的整形外科手段進(jìn)行治療,因此整形外科醫(yī)生加強(qiáng)了在異體復(fù)合組織移植技術(shù)領(lǐng)域的研究探索,并先后在臨床上進(jìn)行了手、顏面、喉、舌、耳、腹壁等異體復(fù)合組織移植[2]。上述異體復(fù)合組織移植手術(shù)后,雖然大部分異體復(fù)合組織移植的患者發(fā)生了急性排斥反應(yīng),但多數(shù)是可逆性的,采用新型免疫抑制藥物,一部分可以抑制免疫排斥反應(yīng),維持移植組織的成活。大劑量應(yīng)用免疫抑制藥物,雖然能夠抑制排斥反應(yīng),但會(huì)產(chǎn)生很多不良反應(yīng),如肝腎等臟器功能損害、 糖尿病等,如果長(zhǎng)期使用,甚至可能面臨腫瘤和致死性感染的危險(xiǎn)。因此,尋找一個(gè)有效的方法,減少術(shù)后早期全身性免疫抑制劑的用量成了一個(gè)關(guān)鍵的問題。因?yàn)?淋巴結(jié)主要是特異性細(xì)胞免疫的必需場(chǎng)所。異體器官或組織移植后,供體抗原經(jīng)供體或受體的抗原提呈細(xì)胞攝取后,進(jìn)入淋巴結(jié)激活初始T細(xì)胞,增殖為效應(yīng)T細(xì)胞,經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入移植物破壞供體組織。所以本課題將目光放在了移植物局部的引流淋巴結(jié)上,希望從此突破,尋找一個(gè)更加有效并且不良反應(yīng)低的免疫抑制方案。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 8～10周雄性Lewis大鼠和Brown Norway(BN)大鼠,均購(gòu)買自空軍軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,在清潔室內(nèi)飼養(yǎng),給予正常飼料和水。Lewis大鼠為受體,BN大鼠為供體。

1.2 分組與移植方法 實(shí)驗(yàn)采取下腹部游離皮瓣移植。大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉(1%戊巴比妥溶液)下腹部取3 cm×3 cm大小皮瓣,從BN大鼠移植到Lewis大鼠。首先確定移植區(qū)域局部表淺引流淋巴結(jié)位置,確保受體在移植時(shí)淋巴結(jié)不會(huì)遭到破壞,供體皮瓣不包含供體引流淋巴結(jié)。將大鼠隨機(jī)分為三組:A組(n=8),正常移植; B組(n=8),術(shù)中去除移植區(qū)域引流淋巴結(jié);C組(n=8),將皮瓣卷成皮管,利用硅膠管隔離移植物和受體之間的皮膚接觸,僅保留血管相通。

1.3 觀察項(xiàng)目

1.3.1 大體觀察:通過皮瓣外觀觀察移植物的變化,通過移植后水腫期、紫癜期及排斥期大體區(qū)分皮瓣移植后的免疫排斥變化。觀察移植皮瓣的色澤、血運(yùn)及溫度,記錄皮瓣存活時(shí)間。根據(jù)臨床皮膚排斥反應(yīng)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),將大體表現(xiàn)分為Grade Ⅰ-Ⅳ 4級(jí),分別為Ⅰ級(jí)紅斑;Ⅱ級(jí)進(jìn)行性的紅斑、水腫;Ⅲ級(jí)表皮組織糜爛壞死;Ⅳ級(jí)干性壞疽。Grade Ⅲ級(jí)作為發(fā)生急性排斥反應(yīng)的標(biāo)志。

1.3.2 HE染色組織學(xué)觀察:術(shù)后3、7 d取材,通過HE染色確定皮瓣免疫排斥的變化。排斥反應(yīng)分級(jí)根據(jù) Banff 2007 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行[3]:0級(jí)為沒有或者僅少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);Ⅰ級(jí)為輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),未涉及表皮組織;Ⅱ級(jí)為血管周圍中度或重度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),無表皮組織角質(zhì)層斷裂或消失,伴有或者不伴輕度表皮及其附屬器的受累;Ⅲ級(jí)為淋巴細(xì)胞廣泛密集的浸潤(rùn)皮膚全層,上皮細(xì)胞凋亡,角質(zhì)層斷裂,角蛋白溶解;Ⅳ級(jí)為表皮組織及其他皮膚結(jié)構(gòu)壞死空泡形成,發(fā)生急性排斥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)將Ⅲ級(jí)作為排斥終點(diǎn)。

1.3.3 尾靜脈血清白介素-2(IL-2)表達(dá)水平檢測(cè):術(shù)前和術(shù)后3、7、10 d及排斥終點(diǎn),采集鼠尾靜脈血0.5 ml進(jìn)行IL-2 ELISA 檢測(cè)(大鼠 IL-2 ELISA 試劑,Model680 型酶標(biāo)儀),按照說明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。生存評(píng)價(jià)采用Log-Rank (Mantel-Cox)檢驗(yàn);多組比較使用One-way ANOVA方差分析;P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 移植后皮瓣存活情況 術(shù)后各組動(dòng)物狀態(tài)良好,未有啃咬皮瓣的情況發(fā)生。A組皮瓣第3天開始出現(xiàn)水腫,并且有小面積的出血點(diǎn),其他各組沒有異常情況發(fā)生。第7天A組皮瓣基本全部被排斥(圖1A),平均存活天數(shù)為(6.38±0.52)d,其余各組逐漸出現(xiàn)水腫的情況,但是并沒有出血點(diǎn)出現(xiàn)。B組在第6、7天出現(xiàn)水腫,并且出現(xiàn)出血點(diǎn)(圖1B),平均存活時(shí)間為(10.00±0.76)d;C組第7天,皮管僅出現(xiàn)輕度水腫和少量出血點(diǎn)(圖1C),平均存活時(shí)間為(14.38±0.74)d。采用Log-Rank (Mantel-Cox)檢驗(yàn),B、C組皮瓣存活時(shí)間相較于A組明顯延長(zhǎng)(均P<0.05)。

A:A組術(shù)后第7天,可見表皮糜爛壞死,為典型的急性排斥反應(yīng),分級(jí)為Grade Ⅲ級(jí);B:B組術(shù)后第7天,出現(xiàn)出血點(diǎn)并水腫,皮溫升高,分級(jí)為Grade Ⅱ級(jí);C:C組術(shù)后第7天,皮管僅出現(xiàn)輕度水腫和少量出血點(diǎn),外觀正常

2.2 組織學(xué)檢查 各組皮瓣分別于術(shù)后第3、7天取材進(jìn)行HE染色。A組第3天可觀察到中度至重度血管、毛囊周圍炎癥,炎癥累及表皮,表皮部分發(fā)生剝落,中度真皮水腫,根據(jù)分級(jí)可判定為Grade Ⅱ級(jí);第7天出現(xiàn)廣泛的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),部分真皮組織壞死,累及表皮,出現(xiàn)表皮松解(圖2A)。B組和C組第3天只有少量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),沒有累積到表皮;第7天出現(xiàn)輕度的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),伴隨輕度的表皮水腫(圖2B、C)。

A:A組術(shù)后第7天,可見真皮及毛囊周圍大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),血管內(nèi)外膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn),管腔內(nèi)有血栓填塞,認(rèn)定為排斥終點(diǎn);B:B組術(shù)后第7天,皮下及毛囊周圍少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),真皮及皮下組織結(jié)構(gòu)正常,有輕微水腫;C:C組術(shù)后第7天,皮瓣僅出現(xiàn)輕度淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),伴輕度皮膚水腫

2.3 血清IL-2表達(dá)水平 各組分別在術(shù)前和術(shù)后第3、7、10天及排斥終點(diǎn),采集鼠尾靜脈血液進(jìn)行IL-2 表達(dá)水平檢測(cè)(圖3)。各組IL-2都有升高的情況發(fā)生,A組相較于其他各組,IL-2的升高非常明顯,在排斥終點(diǎn)(術(shù)后第7天)達(dá)到最大(245.94±10.21)ng/L;B、C組在術(shù)后第7天IL-2表達(dá)水平分別為(145.15±4.2)ng/L和(96.28±4.62)ng/L,A組與其他兩組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(均P<0.05)。B、C組相較于A組升高緩慢,但B組在第7天皮瓣出現(xiàn)出血點(diǎn)和有排斥現(xiàn)象發(fā)生后開始明顯升高,在排斥終點(diǎn)IL-2表達(dá)水平達(dá)到最高(221.35±5.46)ng/L。C組在術(shù)后第3天IL-2表達(dá)較穩(wěn)定,術(shù)后第7天后表達(dá)量增加,排斥終點(diǎn)時(shí)IL-2最高達(dá)到(189.97±4.76)ng/L。

圖3 各組血清 IL-2 表達(dá)水平比較

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)主要目的是要證明移植物局部的引流淋巴結(jié)在異體復(fù)合組織移植中是否參與了早期的排斥反應(yīng),干預(yù)淋巴結(jié)后能否延長(zhǎng)皮瓣存活時(shí)間。研究主要集中在局部引流淋巴結(jié)上,通過設(shè)計(jì)不同的實(shí)驗(yàn)方案,觀察研究引流淋巴結(jié)對(duì)于異體復(fù)合組織移植的影響。在實(shí)驗(yàn)組中,我們?cè)O(shè)計(jì)了針對(duì)淋巴結(jié)和淋巴引流的一系列實(shí)驗(yàn),分別利用物理去除淋巴結(jié)及隔離淋巴引流的方法來驗(yàn)證我們的設(shè)想。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察,局部引流淋巴結(jié)的確在早期的急性排斥反應(yīng)起到了一定的關(guān)鍵作用。與對(duì)照組(A組)相比,其余實(shí)驗(yàn)各組都能有效地延長(zhǎng)皮瓣的存活。

相較于內(nèi)臟器官的移植,皮膚組織移植后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的排斥反應(yīng),因此認(rèn)為皮膚組織是抗原性最高的組織[4]。而異體復(fù)合組織移植一般都含有皮膚組織,因此認(rèn)為復(fù)合組織移植的排斥幾率要高于內(nèi)臟器官[5]。同種異體的排斥反應(yīng)被認(rèn)為是以T細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答為主的排斥反應(yīng)過程[6]。初始T細(xì)胞在次級(jí)淋巴組織(Secondary lymphoid tissues,SLTs)與載有抗原的抗原提呈細(xì)胞(APCs)經(jīng)過反復(fù)接觸、識(shí)別,使初始T細(xì)胞逐漸成熟,并增殖成為效應(yīng)T細(xì)胞,然后進(jìn)入血液循環(huán),到達(dá)異體移植物局部后,促使移植物發(fā)生排斥反應(yīng)。而APCs攝取含皮膚移植物的異體抗原后,只能沿著淋巴引流進(jìn)入引流淋巴結(jié),因此很難有大量的抗原通過血液進(jìn)入脾或其他部位的淋巴結(jié)[7]。次級(jí)淋巴組織既是成熟T細(xì)胞、B細(xì)胞等免疫細(xì)胞定居的場(chǎng)所,同時(shí)也是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的部位?？乖騍LTs定向移動(dòng)并被截留其中,這決定了淋巴結(jié)在免疫應(yīng)答中的重要性。

有研究[8]發(fā)現(xiàn),在異體皮膚組織與受體真皮移植床建立新的血管化連接之前,由于淋巴引流受阻,推遲或阻止了移植物的排斥。這提示淋巴結(jié)是針對(duì)皮膚移植物發(fā)生免疫應(yīng)答的主要部位[9]。我們實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn),將皮瓣卷成皮管并用硅膠管隔絕供受體皮膚之間的接觸是能夠延長(zhǎng)移植物的存活時(shí)間(C組),并且移植物的水腫情況比較嚴(yán)重,一般要在第10～12天能消腫,并且消腫后很快出現(xiàn)了排斥反應(yīng)。這有可能和皮膚后期生長(zhǎng)越過硅膠管使皮膚接觸有關(guān),也有可能是依賴于SLTs,使初次免疫應(yīng)答和初始T細(xì)胞激活產(chǎn)生效應(yīng)細(xì)胞導(dǎo)致移植物的排斥[10-12]。一旦激活,初始T細(xì)胞分化成效應(yīng)T細(xì)胞,可以遷移至外周組織,通過血液循環(huán)到達(dá)移植部位,從而發(fā)生移植物排斥[10]。

T細(xì)胞的激活需要兩個(gè)激活信號(hào)[13]。第一信號(hào)為抗原特異性T細(xì)胞的受體識(shí)別抗原提呈細(xì)胞表面的MHC抗原肽復(fù)合物;第二信號(hào),又稱作共刺激信號(hào),是T細(xì)胞表面受體識(shí)別抗原提呈細(xì)胞的相應(yīng)配體。RAS -絲裂原活化蛋白激酶通路、鈣調(diào)磷酸酶通路等數(shù)個(gè)信號(hào)通路經(jīng)過這兩個(gè)信號(hào)活化,激活數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄因子,如IL-2。IL-2可激活下游細(xì)胞因子的增殖,也稱為第三信號(hào)。經(jīng)過一系列信號(hào)傳導(dǎo)及活化,最終導(dǎo)致效應(yīng)T細(xì)胞的CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞克隆增殖[14]。在我們的試驗(yàn)中,A組相較于其他各組,IL-2的升高非常明顯,在排斥終點(diǎn)達(dá)到(245.94±10.21)ng/L,其他各組在該時(shí)間點(diǎn)略有增加,但是隨著IL-2的增加,慢慢也出現(xiàn)了排斥反應(yīng),最終在不外加其他任何干預(yù)的情況下,皮瓣全部壞死。

初始T細(xì)胞和大部分記憶性T細(xì)胞的活化部位是SLTs,同時(shí)該部位也是引發(fā)同種異體移植物排斥反應(yīng)所必需的場(chǎng)所。在非血管化的皮膚、角膜移植實(shí)驗(yàn)中證實(shí),引流淋巴結(jié)對(duì)異體移植物的排斥起促進(jìn)作用。有實(shí)驗(yàn)研究[15-16]發(fā)現(xiàn),在大鼠異體角膜移植中,去除角膜的引流淋巴結(jié)(下頜淋巴結(jié)、頸淺淋巴結(jié))可以延長(zhǎng)正?；蚋呶＝悄ひ浦参锏拇婊顣r(shí)間。在小鼠、豚鼠、兔進(jìn)行了去除引流淋巴結(jié)的皮片移植研究,證實(shí)可以延長(zhǎng)皮片的移植時(shí)間[9,17]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們也進(jìn)行了大鼠復(fù)合組織移植局部的淋巴結(jié)摘除。首先利用ICG的顯影技術(shù),確定了該區(qū)域淋巴引流的方向和范圍(其引流方向是向腋下淋巴結(jié)處引流),切除移植物局部引流淋巴結(jié)后發(fā)現(xiàn),相較于對(duì)照組(A組)第3天出現(xiàn)的水腫和出血點(diǎn)情況,實(shí)驗(yàn)組(B組)水腫和出血點(diǎn)等排斥跡象發(fā)生在第7天,該組皮瓣存活時(shí)間為(10.00±0.76)d,要高于對(duì)照組(A組),但是要低于C組。通過 IL-2 的變化(圖3),發(fā)現(xiàn)去除引流淋巴結(jié)在早期確實(shí)可以降低機(jī)體急性排斥反應(yīng)強(qiáng)度。同時(shí)有研究[18-19]表明,在皮膚、角膜的移植中脾可能具有調(diào)節(jié)作用。我們實(shí)驗(yàn)組在下一步的實(shí)驗(yàn)中也將驗(yàn)證這種排斥反應(yīng)的發(fā)生是否和脾臟有著密切的關(guān)系。

總體從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看,移植物局部的引流淋巴結(jié)在移植早期的確起著非常重要的作用。雖然到后期在不添加任何其他干預(yù)手段的情況下,皮瓣最終都會(huì)壞死,但是相較于對(duì)照組,的確起到了延緩排斥反應(yīng)發(fā)生的作用。從臨床上看,現(xiàn)在的抗免疫排斥方面主要是早期全身給予大量免疫抑制劑或者激素,但是長(zhǎng)期全身大量的用藥帶來了一系列的不良反應(yīng),主要有:機(jī)體代謝紊亂(糖尿病、庫欣綜合征等)、機(jī)會(huì)性感染(條件致病菌、真菌、皰疹病毒等)及腫瘤的發(fā)生等[20]。因此,局部用藥和減少用藥劑量就成了大家關(guān)心的一個(gè)問題。從我們的試驗(yàn)中可以看出,早期干預(yù)移植物局部引流淋巴結(jié)可以延緩排斥反應(yīng)的發(fā)生,延長(zhǎng)皮瓣存活時(shí)間。淋巴結(jié)是特異性細(xì)胞免疫的必需場(chǎng)所。異體器官或組織移植后,供體抗原經(jīng)供體或受體的抗原提呈細(xì)胞攝取后,進(jìn)入淋巴結(jié)激活初始T細(xì)胞,增殖為效應(yīng)T細(xì)胞,經(jīng)過血液循環(huán)進(jìn)入移植物破壞供體組織。根據(jù)角膜移植的研究可見,局部引流淋巴結(jié)對(duì)非血管化組織的免疫排斥起主要作用,而對(duì)于血管化的內(nèi)臟器官移植來說,引流淋巴結(jié)眾多,分布復(fù)雜、廣泛,不易對(duì)其操作,而對(duì)于血管化的頭面、四肢異體復(fù)合組織移植來說,引流淋巴結(jié)相對(duì)集中局限,容易干預(yù)。

在未來的研究中,我們將使用小劑量的免疫抑制藥物聯(lián)合移植物局部引流淋巴結(jié)的處理,對(duì)其進(jìn)行有效干預(yù),可能會(huì)降低術(shù)后(特別是術(shù)后早期)全身免疫抑制藥物的應(yīng)用劑量,減少或避免全身大劑量用藥的不良反應(yīng),為異體復(fù)合組織移植探索一種新的安全有效的免疫抑制治療策略與方法,從而推動(dòng)異體復(fù)合組織移植在臨床的廣泛應(yīng)用。