肖劍偉， 蔡 旭， 黃新民， 洪易煒， 汪榮盛

（1. 深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，廣東 深圳 518000；2. 上海市光華中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，上海 200052）

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（gouty arthritis,GA）是一種常見的炎癥性關(guān)節(jié)炎，發(fā)作時常引起患者極大的痛苦。 研究顯示痛風(fēng)患病率從<1%到6.8%不等，其患病率和發(fā)病率在不斷上升[1-2]。GA是由于尿酸單鈉晶體（monosodium urate crystal, MSU）在關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié)周圍軟組織中沉積引起[3]。 MSU 誘發(fā)炎癥反應(yīng)，刺激局部炎癥細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子 （tumor necrosis factor，TNF）-α 和白介素（interleukin，IL）-1β 等炎癥因子，進(jìn)一步加重炎癥[4]。 鑒于目前部分患者對藥物治療反應(yīng)不佳，因而探索痛風(fēng)發(fā)病的潛在機(jī)制對于其治療具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA, lncRNA）為長度超過200 個核苷酸且未翻譯成功能性蛋白質(zhì)的RNA[5]，其主要通過在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)下游基因來實現(xiàn)其調(diào)控功能[6]。 多個研究動物模型研究顯示，lncRNA 可通過調(diào)控炎癥因子分泌等來促進(jìn)或減輕GA 的發(fā)展[7-8]。另一項研究顯示痛風(fēng)患者的外周血單個核細(xì)胞 （peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 中差異表達(dá)的AJ227913 可能參與痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制。 以上研究結(jié)果表明，探索異常表達(dá)的lncRNA 可為痛風(fēng)患者提供有希望的診斷和治療靶點[9]。

本研究從基因表達(dá)綜合 （Gene Expression Omnibus,GEO）數(shù)據(jù)庫下載痛風(fēng)相關(guān)微陣列數(shù)據(jù)集，基于機(jī)器學(xué)習(xí)的方式識別痛風(fēng)患者PBMC 中的關(guān)鍵lncRNA， 驗證關(guān)鍵lncRNA 表達(dá)情況及l(fā)ncRNA 與炎癥指標(biāo)及尿酸水平的相關(guān)性， 為進(jìn)一步深入了解痛風(fēng)的發(fā)病機(jī)制及診斷和治療提供新方向。

資料與方法

一、樣本和差異lncRNA 獲取

從GEO 數(shù)據(jù)庫中以“Gout”作為關(guān)鍵詞檢索，得到數(shù)據(jù)集GSE160170（檢測平臺為GPL21827），共包含6 個正常樣本和6 個痛風(fēng)樣本。 使用Perl 軟件 （版本號5.36.0）對GSE160170 數(shù)據(jù)集進(jìn)行基因重注釋，獲取mRNA 及l(fā)ncRNA表達(dá)量。

二、不同機(jī)器學(xué)習(xí)獲取關(guān)鍵基因

對得到的差異lncRNA 表達(dá)譜采用機(jī)器學(xué)習(xí)方法進(jìn)一步篩選關(guān)鍵基因。將數(shù)據(jù)分為訓(xùn)練集及測試集。使用R 語言中的glmnet 包， 通過LASSO 回歸對lncRNA 表達(dá)譜進(jìn)行篩選。 然后使用隨機(jī)森林（random forest，RF）方法，設(shè)置參數(shù)ntree=1 000，mtry=3， 取MeanDecreaseGini 排名前5 的基因作為核心基因。 將上述2 種方法計算的結(jié)果取交集得到關(guān)鍵基因。使用R 軟件ROCR 包繪制lncRNA 的受試者操作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC 曲線）用于評估lncRNA 的診斷能力。

三、與lncRNA 共表達(dá)編碼蛋白基因獲取

將得到的lncRNA 通過R 軟件limma 包，分析其共表達(dá)的蛋白編碼基因，將共表達(dá)基因通過String 網(wǎng)站（https://stringdb.org）進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析，導(dǎo)入Cytoscape 軟件（版本號3.8.2），通過cytoHubba 插件篩選HUB 基因。

四、基因本體論（Gene Ontology，GO）富集分析及京都基因與基因組百科全書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）信號通路分析

將得到的共表達(dá)蛋白編碼基因，使用R 軟件“clusterProfiler”包及“org.Hs.eg.db”進(jìn)行GO 富集分析及KEGG 信號通路分析。 以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

五、實驗驗證

1. 臨床樣本資料： 選取深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院風(fēng)濕免疫科符合2012 美國風(fēng)濕病協(xié)會制定的痛風(fēng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，排除合并有惡性腫瘤、發(fā)病前3 d 服用過非甾類藥物或激素類藥物以及嚴(yán)重肝功能、腎功能障礙的患者。納入2021年4—10月確診的急性GA 發(fā)作患者共10 例， 其中男性9例，女性1 例，年齡33～57 歲，平均（40.9±9.2）歲。 收集患者紅細(xì)胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）、C 反應(yīng)蛋白（C reactive protein，CRP）、IL-6 及血尿酸等臨床資料。按照痛風(fēng)患者性別、年齡比例選擇10 名我院健康體檢者作為對照組，其中男性8 名，女性2 名，年齡40～56 歲，平均（46.2±5.7） 歲。 2 組之間年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （t=-1.554，P=0.196）。 本研究通過醫(yī)院倫理委員會審查 （倫理審查編號：FS202110002），研究對象均自愿參與，簽署知情同意書。

2. 試劑：淋巴細(xì)胞Ficoll-Hypaque 分離液購自上海善然生物科技公司，TRIzol 試劑購自美國賽默飛世爾科技公司，PrimeScript RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq Ⅱ熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa 公司。

3. RNA 提取及實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）： 使用含有乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA）的采血管收集對照組及痛風(fēng)組患者的外周血3 mL，通過Ficoll-Hypaque 密度梯度離心法分離和純化PBMC， 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）沖洗3 次，置于-80 ℃保存。 各研究對象取PBMC 約3×106個， 使用TRIzol 試劑從PBMC 中提取總RNA， 并使用NanoDrop One 超微量紫外分光光度計檢測RNA 吸光度（A），取A260nm/A280nm值為1.8～2.0 的樣本用于后續(xù)實驗。 RNA 樣本置于-80 ℃保存。

按照PrimeScript RT 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作。 將2 μL RNA 樣本逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA （complementary DNA，cDNA），隨后按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ說明書在Applied Biosystems 7500 實時PCR 系統(tǒng)上進(jìn)行qRT-PCR。引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, GAPDH）為內(nèi)參，其中LINC01465 引物序列（5’- 3’）上游為AAGCAAGCCTGGGCAATG，下游為TAACAAATCACCCTGAAAC；GAPDH引物序列（5’- 3’）上游為GCCCAATACGACCAAATCC，下游為AGCCACATCGCTCAG ACAC。LINC01465 的qRT-PCR 反應(yīng)系統(tǒng)包含2 μL cDNA、正向和反向引物各0.8 μL、10×ROX reference dye Ⅱ0.4 μL、2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ10 μL、RNase Free ddH2O 6 μL， 總體積為20 μL。 循環(huán)參數(shù)：97 ℃10 min；95 ℃15 s，62 ℃60 s，共40 個循環(huán)。 LINC01465 于62 ℃時使用High Resolution Melting Software v3.0.1 軟件采集熒光信號，并分析熔解曲線。采用2-△△Ct法以GAPDH 為內(nèi)參計算LINC01465 的表達(dá)水平，并計算LINC01465 與ESR、CRP、IL-6 及尿酸水平的相關(guān)性。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果

一、差異分析結(jié)果

與健康體檢者對比，GA 患者共有37 個lncRNA 差異表達(dá)（見圖1）。

圖1 健康體檢者與GA 患者差異表達(dá)lncRNA

二、機(jī)器學(xué)習(xí)結(jié)果

Lasso 回歸篩選得到3 個關(guān)鍵基因（LINC01465、LINC01355、LINC02100），RF 算 法 篩 選 得 到5 個 關(guān) 鍵 基 因（FARP1.AS1、LINC01465、FAM242C、IFNG.AS1、PACERR），2 個結(jié)果取交集，得到潛在生物標(biāo)志物L(fēng)INC01465（見圖2）。ROC 診斷曲線下面積 （area under the curve， AUC）=0.889，P=0.001（見圖3）。

圖2 Lasso 回歸與RF 算法篩選關(guān)鍵基因

圖3 ROC 診斷曲線

三、LINC01465 共表達(dá)基因分析結(jié)果

共表達(dá)結(jié)果顯示， 共有1 516 個蛋白編碼基因余LINC01465 共表達(dá)。 HUB 基因篩選結(jié)果顯示， 在整個網(wǎng)絡(luò)中，缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor 1α，HIF1α）、磷脂酰肌醇-3 激酶催化亞基α （phosphoinositide-3 kinase catalytic alpha polypeptide，PIK3CA）、IL-6、 哈維大鼠肉瘤病毒腫瘤基因同源物 （Harvey rat sarcoma viral oncogene homolog, HRAS）、β-連環(huán)素1（β-catenin 1, CTNNB1）處于網(wǎng)絡(luò)核心，其表達(dá)與LINC01465 表達(dá)均呈正相關(guān)（見圖4）。

圖4 LINC01465 共表達(dá)分析及HUB 基因

四、GO 富集分析及KEGG 信號通路分析

GO 富集分析結(jié)果顯示，其生物過程（biological process,BP）包括RNA 剪接、氧化磷酸化等，分子功能主要包括抗氧化活性、 還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 （reduced nicotinamide adenine dinucleotide，NADH） 脫氫酶活性等功能，細(xì)胞成分顯示主要定位于線粒體內(nèi)膜、呼吸鏈復(fù)合體等（見圖5A）。 KEGG 信號通路分析顯示主要富集于煙酸和煙酰胺代謝、TNF 信號通路、PI3K-Akt 信號通路、 趨化因子信號通路等代謝及炎癥通路（見圖5B）。

圖5 GO 富集分析及KEGG 信號通路分析結(jié)果

五、實驗結(jié)果

qRT-PCR 結(jié)果顯示， 在痛風(fēng)患者中LINC01465 表達(dá)明顯升高（P=0.030）（見圖6）。 相關(guān)性分析顯示，LINC01465 表達(dá)與ESR （r=0.658，P=0.030）、CRP （r=0.660，P=0.040）、IL-6（r=0.794，P=0.008） 表達(dá)呈正相關(guān)， 與尿酸無相關(guān)性 （r=0.450，P=0.190）（見圖7）。 ROC 診斷曲線顯示AUC=0.860，P=0.001（見圖8）。

圖6 LINC01465 在對照組及GA 組中qRT-PCR 結(jié)果

圖8 ROC 診斷曲線

討論

機(jī)器學(xué)習(xí)在風(fēng)濕免疫疾病風(fēng)險因素預(yù)測、治療愈后效果預(yù)測等方面得到廣泛應(yīng)用。 筆者通過使用機(jī)器學(xué)習(xí)鑒定類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在關(guān)鍵基因[10]。另一項研究通過多種機(jī)器學(xué)習(xí)方法，構(gòu)建了系統(tǒng)性紅斑狼瘡風(fēng)險概率指數(shù)，用于狼瘡患者的早期診斷和治療[11]。與傳統(tǒng)通過不同分組尋找差異表達(dá)的方法相比，機(jī)器學(xué)習(xí)的方法能夠更加準(zhǔn)確地識別出GA 診斷及治療潛在相關(guān)的lncRNA。

目前，GA 的診斷主要依賴于血清尿酸水平的升高。 但研究表明，GA 與高尿酸血癥的相關(guān)性尚不明確。 高尿酸血癥使患者容易出現(xiàn)痛風(fēng)急性發(fā)作， 但也有很多高尿酸血癥患者無明顯癥狀，部分GA 患者尿酸亦無明顯升高[12]。 血液尿酸水平不能預(yù)測GA 的發(fā)作， 也并非GA 診斷的標(biāo)志物。尋找有效的生物標(biāo)志物，對GA 進(jìn)行早期診斷及治療對于預(yù)防關(guān)節(jié)畸形及提高患者的生活質(zhì)量有重要意義，闡明GA 的發(fā)病機(jī)制對于疾病的早期診斷和治療至關(guān)重要。

大量研究表明，lncRNA 調(diào)控在各種風(fēng)濕性疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用[13]。 目前關(guān)于lncRNA 在GA 患者中的研究仍較少。本研究中GA 急性發(fā)作患者LINC01465 表達(dá)明顯上調(diào)。 芯片數(shù)據(jù)及實驗驗證均顯示其具有良好的分類診斷功能，AUC 均大于0.8， 提示LINC01465 能作為GA 患者的診斷標(biāo)志物之一。 同時，LINC01465 與ESR、CRP、IL-6等炎癥因子表達(dá)呈正相關(guān)，而與血清尿酸水平無明顯相關(guān)，提示LINC01465 與痛風(fēng)急性發(fā)作有關(guān)， 也可能是急性期發(fā)作的生物標(biāo)志物。

本研究通過與LINC01465 共表達(dá)的蛋白來推測其潛在功能。 HUB 基因篩選得到5 個關(guān)鍵基因， 分別是HIF1α、PIK3CA、IL-6、HRAS、CTNNB1。其中，PIK3CA 由1 個85 kDa的調(diào)節(jié)亞基和1 個110 kDa 的催化亞基組成， 是PI3K 通路的組成部分[14]。 研究顯示，尿酸結(jié)晶會觸發(fā)脾酪酸激酶（spleen tyrosine kinase，Syk）激活PI3K 信號通路誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生導(dǎo)致炎癥[15]。HRAS 是腎素-血管緊張素系統(tǒng)（reninangiotensin system, RAS）基因產(chǎn)生4 種主要的蛋白質(zhì)產(chǎn)物之一， 另外3 個為Kirsten 大鼠肉瘤病毒腫瘤基因同源物（Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog，KRAS4） 的2 個異構(gòu)體KRAS4A 和KRAS4 以及神經(jīng)母細(xì)胞瘤RAS 病毒腫瘤基因同源物 （neuroblastoma RAS viral oncogene homolog,NRAS）。 這4 個蛋白具有高度同源性的序列和結(jié)構(gòu)，且都具有保守的G 結(jié)構(gòu)域和C 端高突變區(qū)。RAS 屬于鳥苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶家族，是細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和存活的調(diào)節(jié)劑[16]。 RAS 蛋白與鳥苷二磷酸（guanosine diphosphate，GDP）結(jié)合時處于非活性狀態(tài)（RASGDP），與GTP 結(jié)合處于活性狀態(tài)（RAS-GTP）。 RAS-GTP 與下游效應(yīng)器[包括Raf、PI3K、Ral 鳥嘌呤核苷酸交換因子（Ral guanine nucleotide exchange factors，RalGEF）]結(jié)合，轉(zhuǎn)導(dǎo)信號以調(diào)節(jié)生物行為[17-19]。 前2 個相應(yīng)的通路RAS-Raf-絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（mitogen extracellular signal regulated kinase, MEK）-細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal regulated kinase, ERK）和RAS-PI3K-Akt-哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物 （mammalian target of rapamycin complex,mTORC），是RAS 蛋白的基本信號通路[18]。 由此可見，PIK3CA蛋白與HRAS 之間相互聯(lián)系，HRAS 可能通過激活PIK3CA進(jìn)而激活PI3K-Akt 信號通路。 Cavalcanti 等[20]觀察到痛風(fēng)患者血清中IL-6 水平與痛風(fēng)石（P=0.005）和關(guān)節(jié)畸形（P=0.000 8）相關(guān)。動物實驗發(fā)現(xiàn)，尿酸結(jié)晶可刺激M1 巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥級聯(lián)反應(yīng)，加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)[21]。 提示IL-6 在GA 中發(fā)揮重要作用。HIF 由HIF1α 和HIF1β 2 個亞基組成。當(dāng)局部炎癥發(fā)生時，血流速度減慢，炎癥細(xì)胞耗氧量增加導(dǎo)致局部環(huán)境缺氧，HIF 活化，參與NF-κB 活化和糖酵解[22]。 糖酵解可誘發(fā)炎癥反應(yīng)， 還可促進(jìn)NLRP3 炎性小體的活化以及IL-6 和IL-1β 等炎性細(xì)胞因子的分泌[23]。有研究表明，幾丁質(zhì)可通過抑制巨噬細(xì)胞中HIF1α 和NLRP3 的表達(dá)來減少IL-1β 的分泌，從而治療GA[24]，表明HIF1α 可能通過調(diào)節(jié)NLRP3 通路對GA 產(chǎn)生影響。 CTNNB1 蛋白又名為β-連環(huán)素， 是經(jīng)典Wnt 信號通路的關(guān)鍵下游組分。 研究發(fā)現(xiàn)，尿酸能夠顯著促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞中β-連環(huán)素的表達(dá)， 促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1 極化和遷移，從而促進(jìn)炎癥[25]。

5個關(guān)鍵基因涉及PI3K/Akt、NF-κB及Wnt 信號通路，功能涉及到炎癥反應(yīng)、 糖酵解等， 這與GO 富集分析及KEGG 信號通路分析一致。 而3 個通路之間存在交互作用，其中PI3K-Akt 處于幾個通路的核心地位。 研究顯示，PI3KAkt 通路通過激活NF-κB 在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，而NF-κB 也是激活NLRP3 炎性體的上游信號之一[26]。 PI3K 抑制劑可減少骨關(guān)節(jié)炎大鼠的中性粒細(xì)胞凋亡和軟骨細(xì)胞炎癥[27]。 β-連環(huán)素與NF-κB 形成復(fù)合物，負(fù)調(diào)節(jié)NF-κB 活性，導(dǎo)致NF-κB 靶基因表達(dá)降低[28]。在樹突細(xì)胞中，敲低β-連環(huán)素增強(qiáng)了脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)的NF-κB 活化和促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[29]。 這些研究揭示了β-連環(huán)素的抗炎作用， 并且β-連環(huán)素信號傳導(dǎo)使樹突細(xì)胞進(jìn)入耐受狀態(tài)， 從而限制炎癥反應(yīng)。 多項研究顯示HIF1α 受PI3K/Akt/mTOR 信 號 通 路 的 調(diào) 節(jié)[30-31]。 PI3K 抑 制 劑LY294002[32]和PI3K/mTOR 雙重抑制劑NVP-BEZ235[33]可抑制由缺氧引起的Akt 活化和HIF1α 的表達(dá)。 HIF1α 激活可上調(diào)己糖激酶的表達(dá)水平[34]，己糖激酶是一種限速酶，能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)葡萄糖不可逆磷酸化為6-磷酸葡萄糖， 使葡萄糖分子進(jìn)入糖酵解循環(huán)，從而增強(qiáng)糖酵解。 這種多個通路之間的相互作用高度提示5 個關(guān)鍵基因通過復(fù)雜的調(diào)控在GA 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用， 而LINC01465 可能影響1 個或多個關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯來達(dá)到調(diào)控的目的。

綜上，本研究確定了LINC01465 為GA 潛在的診斷和治療靶點，并在患者中對其表達(dá)進(jìn)行了驗證。 然而，對于其具體的作用機(jī)制及生物學(xué)功能仍需進(jìn)一步研究來驗證。