郭文文 袁圓 王浩 羅豪 魏華鋒 李靈玉 呂興華

腎缺血- 再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）是引起急性腎損傷的主要原因之一，發(fā)生在腎移植、腎動(dòng)脈狹窄、部分腎切除術(shù)期間，可導(dǎo)致移植物功能延遲恢復(fù)、多器官功能障礙等嚴(yán)重后果，病死率極高[1-2]。腎IRI 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及凋亡、壞死、氧化應(yīng)激、炎癥、線粒體功能障礙等[3-4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，壞死性凋亡存在于腎IRI的病理?yè)p傷過(guò)程，抑制壞死性凋亡可能是減輕腎IRI 的方法之一[5-6]。瞬時(shí)受體電位陽(yáng)離子通道蛋白（transient receptor potential canonical，TRPC）6 是一種非選擇性Ca2+滲透性陽(yáng)離子通道，TRPC6 可通過(guò)下游聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly adenosine-diphosphate-ribose polymerase，PARP）1 作用抑制腎小管上皮細(xì)胞壞死性凋亡，減輕腎IRI[7]。研究表明，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源外泌體（human umbilical cord mesenchymal stem cell-derived exosome，hucMSC-Exo）可通過(guò)抑制壞死性凋亡來(lái)減輕腎IRI[8]，然而具體信號(hào)通路尚不清楚。因此，本研究采用超速離心法提取hucMSCExo，研究其在腎IRI 中的保護(hù)作用，進(jìn)一步評(píng)價(jià)TRPC6/PARP1 信號(hào)通路在hucMSC-Exo 減輕腎IRI中的作用，為治療腎IRI 提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑

30 只雄性健康無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF） 級(jí)SD 大鼠，體質(zhì)量200～250 g，購(gòu)于蘭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cell，hucMSC）購(gòu)自商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司。本研究獲蘭州大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（審批號(hào)：LDYYLL2022-399）。

TRPC6 抑 制 劑SKF96365 購(gòu) 于 美 國(guó)MedChemExpress 公司，胎牛血清、培養(yǎng)基、0.25 %胰蛋白酶購(gòu)于上海逍鵬生物科技有限公司，BCA 蛋白定量試劑盒、血清肌酐和血尿素氮檢測(cè)試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司，CD9、CD63 抗體購(gòu)于美國(guó)Proteintech 公司；CD81 抗體購(gòu)于美國(guó)ABclonal公司，兔源甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 抗體、β-actin抗體購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司；受體相互作用蛋白激酶（receptor-interacting protein kinase，RIPK）1、混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣蛋白（mixed-lineage kinase domainlike protein，MLKL）抗體購(gòu)于美國(guó)Affinity 公司；RIPK3、TRPC6、PARP1 抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

1.2 動(dòng)物分組與處理

采用隨機(jī)數(shù)表法將大鼠分成5 組：假手術(shù)組（S 組）、假手術(shù)+TRPC6 抑制劑SKF96365 組（SS 組）、腎IRI 組（IRI 組）、外泌體處理組（EXO 組）、外泌體+TRPC6 抑制劑SKF96365 組（ES 組），每組6 只。

建立腎IRI 模型：將大鼠麻醉后，俯臥位固定，備皮，0.5%碘伏消毒，在背部?jī)蓚?cè)行1～2 cm 切口，游離出雙側(cè)腎臟并找到雙側(cè)腎蒂，用無(wú)創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎蒂，腎臟由紅色轉(zhuǎn)為紫黑色，代表腎血管阻斷成功。用生理鹽水浸濕的紗布覆蓋切口，45 min 后松開(kāi)動(dòng)脈夾，觀察腎臟迅速由紫黑色轉(zhuǎn)為紅色，說(shuō)明再灌注成功。S 組和SS 組只游離雙側(cè)腎蒂，不進(jìn)行夾閉。SS 組游離雙側(cè)腎蒂前5 min 尾靜脈注射SKF96365 1.5 mg/kg；S 組和IRI 組注射200 μL 磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）；EXO 組和ES 組在夾閉雙側(cè)腎蒂前15 min 將20 μg 外泌體溶液（20 μg 外泌體稀釋于200 μL PBS）隨機(jī)注射到左腎的5 個(gè)部位[9-10]；ES 組夾閉腎蒂前5 min 尾靜脈注射SKF96365 1.5 mg/kg[11]。再灌注24 h 后麻醉大鼠，左心室取血及留取腎組織后頸椎脫臼處死大鼠。留取大鼠血液標(biāo)本于EP 管中，于室溫靜置1 h 后，4 ℃離心15 min，取上層血清；大鼠部分腎組織用4 %多聚甲醛固定，常溫保存，另一部分保存于-80 ℃冰箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng) 將hucMSC 接種于培養(yǎng)瓶中，加入適量含10 %胎牛血清和1 %青鏈霉素的培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90 %時(shí)，以1∶3 比例傳代。

1.3.2 外泌體的提取與鑒定 取生長(zhǎng)良好的3～8 代hucMSC，待細(xì)胞融合度達(dá)到80%～90%時(shí)更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h 后收集細(xì)胞上清液，將上清液進(jìn)行梯度離心，所得貼于試管底壁淡黃沉淀物即為外泌體，用1 mL PBS 輕柔充分地吹打混勻，使外泌體充分重懸，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

通過(guò)透射電子顯微鏡（透射電鏡）觀察外泌體形態(tài)、用納米顆粒追蹤分析檢測(cè)外泌體粒徑分布范圍。BCA 法測(cè)蛋白含量，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)CD9、CD63 和CD81 蛋白表達(dá)。

1.3.3 血清肌酐和血尿素氮檢測(cè) 血清樣本按照試劑盒說(shuō)明，分別檢測(cè)各組血清肌酐和血尿素氮水平。

1.3.4 病理學(xué)檢查 大鼠腎組織用4 %多聚甲醛固定，行蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，觀察小鼠腎臟病理學(xué)變化，在光鏡下（×400）隨機(jī)選取10 個(gè)視野觀察腎小管損傷程度，并采用Paller 評(píng)分法評(píng)估[12]。

1.3.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè) 采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6、PARP1 的表達(dá)。將腎組織充分裂解后，4 ℃離心，取上清，嚴(yán)格按照BCA 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行各組蛋白濃度測(cè)定。電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入稀釋好的 RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6、PARP1 一抗液，4 ℃孵育過(guò)夜。室溫下二抗孵育1 h。在凝膠成像儀曝光檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體的鑒定

對(duì)所提取物質(zhì)進(jìn)行鑒定，透射電鏡下觀察到類圓形或杯狀圓形的膜性小囊泡，邊界清晰，呈外泌體典型茶托樣結(jié)構(gòu)（圖1A）。納米顆粒追蹤分析結(jié)果顯示，所提取物質(zhì)的平均直徑為125.9 nm，符合外泌體30～150 nm 的粒徑范圍（圖1B）。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示，所提取物質(zhì)有外泌體標(biāo)記蛋白CD9、CD63、CD81 的表達(dá)（圖1C）。

圖1 hucMSC-Exo 的鑒定Figure 1 Characterization of hucMSC-Exo

2.2 腎組織病理學(xué)變化及Paller 評(píng)分

腎組織病理學(xué)變化及Paller 評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖2。與S 組比較，SS 組未見(jiàn)腎組織異常病理改變，兩組間Paller 評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IRI 組腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落、顆粒樣變性、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管刷狀緣消失，可見(jiàn)胞漿空泡、管狀管型形成，Paller 評(píng)分較S 組升高（P＜0.05）；與IRI 組比較，EXO 組腎組織病理?yè)p傷明顯減輕，Paller 評(píng)分降低（P＜0.05）；與EXO 組比較，ES 組腎組織病理?yè)p傷加重，Paller評(píng)分升高（P＜0.05）。

圖2 各組腎組織HE 染色及Paller 評(píng)分Figure 2 HE staining and Paller score of renal tissues in each group

2.3 血清肌酐和血尿素氮變化

各組血清肌酐和血尿素氮水平比較見(jiàn)圖3。S 組與SS 組的血清肌酐和血尿素氮水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＞0.05）。與S 組比較，IRI 組血清肌酐和血尿素氮水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）；與IRI 組比較，EXO 組血清肌酐和血尿素氮水平均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）；與EXO 組比較，ES 組血清肌酐和血尿素氮水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。

圖3 各組血清肌酐和血尿素氮水平Figure 3 Serum creatinine and blood urea nitrogen levels in each group

2.4 腎組織RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6 和PARP1 蛋白水平

各組腎組織RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6和PARP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較見(jiàn)圖4。與S 組比較，IRI 組RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加，TRPC6、PARP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）；與IRI 組比較，EXO組RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降，TRPC6、PARP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）；與EXO 組相比，ES 組RIPK1、RIPK3、MLKL 蛋白相對(duì)表達(dá)量均增加，TRPC6、PARP1 蛋白相對(duì)表達(dá)量均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均為P＜0.05）。

圖4 各組腎組織RIPK1、RIPK3、MLKL、TRPC6、PARP1 蛋白表達(dá)水平Figure 4 The protein expression levels of RIPK1,RIPK3,MLKL,TRPC6 and PARP1 of renal tissues in each group

3 討論

外泌體是細(xì)胞外囊泡的一種亞群，是直徑在30～150 nm 范圍內(nèi)的一類納米顆粒[13-15]。外泌體攜帶蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等，參與細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和通訊[16]。在外泌體中，特征蛋白包括CD9、CD63 和CD81，是外泌體膜上常見(jiàn)的四次跨膜蛋白，在膜融合、信號(hào)傳遞和蛋白質(zhì)運(yùn)輸中發(fā)揮作用[17]。本實(shí)驗(yàn)的提取物在透射電鏡下觀察，為直徑在30～150 nm 之間，呈典型茶托樣結(jié)構(gòu)，大小均一的膜性小囊泡。用納米顆粒追蹤分析檢測(cè)粒徑大小、濃度符合外泌體特征。而蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果顯示有特征性膜蛋白CD9、CD63、CD81 的表達(dá)，證實(shí)提取物為外泌體。

越來(lái)越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體（MSC-derived exosome，MSC-Exo）可能是一種新的無(wú)細(xì)胞療法的載體，具有比間充質(zhì)干細(xì)胞更顯著的優(yōu)勢(shì)[18-19]。MSC-Exo 穩(wěn)定且易于儲(chǔ)存，不會(huì)被免疫系統(tǒng)排斥，是極具生物相容性的非免疫原性囊泡，且具有歸巢效應(yīng)、多重負(fù)載能力和易于表面修飾等內(nèi)在特性，使其成為一種新的藥物傳遞載體[20-21]。已有大量研究表明，MSC-Exo 在腦、心、肝、腎、腸、肺IRI中發(fā)揮保護(hù)作用，為治療IRI提供了新的策略[22]。本研究通過(guò)大鼠腎實(shí)質(zhì)注射外泌體后，腎組織病理?yè)p傷明顯減輕，Paller 評(píng)分、血清肌酐和血尿素氮水平顯著降低，提示外泌體減輕了大鼠腎IRI。在腎IRI 中，壞死性凋亡是導(dǎo)致組織損傷的機(jī)制之一[23-24]。壞死性凋亡是Degterev 等[25]在2005年首次提出的一種新型程序性細(xì)胞死亡方式，細(xì)胞壞死性凋亡的啟動(dòng)和執(zhí)行依賴于RIPK1、RIPK3 以及MLKL 的活化[26]。研究表明，壞死性凋亡抑制劑Necrostatin-1 可通過(guò)靶向抑制RIPK1，改善腎IRI 誘導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)[27]。此外，Liu 等[28]研究發(fā)現(xiàn)在腎IRI 后，壞死性凋亡核心分子RIPK1、RIPK3 和MLKL 的表達(dá)上調(diào)，抑制壞死性凋亡可減輕腎IRI 介導(dǎo)的急性肺損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，腎IRI 后RIPK1、RIPK3、MLKL 表達(dá)水平增加，給予hucMSC-Exo 治療后上述指標(biāo)顯著降低，與Yuan 等[29]的研究一致，進(jìn)一步證實(shí)外泌體通過(guò)抑制壞死性凋亡在腎IRI 中發(fā)揮保護(hù)作用。

TRPC6 是一種非選擇性Ca2+滲透性陽(yáng)離子通道，廣泛表達(dá)于腎組織，是維持正常腎功能的重要蛋白[30-31]。已有研究表明TRPC6 參與器官I(mǎi)RI 的過(guò)程，是IRI 發(fā)病機(jī)制中上調(diào)的差異表達(dá)基因，提示其可能是治療IRI 的潛在分子靶點(diǎn)[32-34]。研究發(fā)現(xiàn)，腎IRI 在體內(nèi)和在體外均可導(dǎo)致TRPC6 表達(dá)下調(diào)，TRPC6 可通過(guò)促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞鋅離子內(nèi)流和自噬，抑制壞死和炎癥反應(yīng)，最終減輕腎IRI[35-36]。腎IRI 后，壞死性凋亡相關(guān)通路被激活，TRPC6 可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+，減輕鈣超載，抑制腎小管上皮細(xì)胞壞死性凋亡來(lái)減輕腎IRI，改善腎功能[7]。此外，Shen 等[11]研究發(fā)現(xiàn)PARP1 的活性是鈣依賴的，TRPC6 可通過(guò)下游PARP1 作用抑制腎小管上皮細(xì)胞壞死性凋亡保護(hù)腎IRI。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，尾靜脈注射TRPC6 抑制劑SKF96365 后，大鼠腎組織形態(tài)、Paller 評(píng)分及血清肌酐、血尿素氮水平未見(jiàn)異常改變，表明此劑量的SKF96365 在安全劑量范圍內(nèi)，未對(duì)大鼠腎組織產(chǎn)生損害。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，外泌體治療后TRPC6、PARP1 表達(dá)增加，提示TRPC6 參與了外泌體對(duì)腎IRI 的保護(hù)作用。進(jìn)一步給予TRPC6 抑制劑SKF96365 后，TRPC6、PARP1 表達(dá)降低，腎組織病理?yè)p傷加重，Paller 評(píng)分、血清肌酐和血尿素氮水平增加，RIPK1、RIPK3、MLKL 表達(dá)水平增加，逆轉(zhuǎn)了外泌體的保護(hù)作用，提示外泌體可通過(guò)調(diào)節(jié)TRPC6/PARP1 通路減輕腎IRI 誘導(dǎo)的壞死性凋亡，發(fā)揮對(duì)腎IRI 保護(hù)作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明hucMSC-Exo 可減輕大鼠腎IRI 所致的壞死性凋亡，其保護(hù)機(jī)制與TRPC6/PARP1 通路激活有關(guān)，為腎IRI 提供了一種新的潛在治療方法。