達(dá)布西力特 鄭 皓 韓承新 肖晶晶

SWI/SNF 染色質(zhì)重塑在包括組織發(fā)育、分化和 DNA 復(fù)制在內(nèi)的各種細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中起著關(guān)鍵的作用[1]。SWI/SNF 復(fù)合物通過(guò)ATP 來(lái)動(dòng)員核小體,從而調(diào)節(jié)啟動(dòng)子對(duì)轉(zhuǎn)錄激活或抑制[2]。富含AT的相互作用域 1A 基因 (ARID1A) 負(fù)責(zé)編碼SWI1結(jié)構(gòu)和功能,它包含 DNA 結(jié)合基序,是 SWI/SNF 復(fù)合物的一個(gè)重要組成部分[3]。因此,ARID1A 對(duì) SWI/SNF 復(fù)合物抑制 DNA 合成至關(guān)重要,并且已被證明對(duì)正常細(xì)胞周期停滯也同樣重要。

近年來(lái),相關(guān)研究報(bào)道ARID1A 為一種抑癌基因[4,5]。ARID1A 在子宮內(nèi)膜來(lái)源的腫瘤中具有很高的體細(xì)胞突變發(fā)生率,許多ARID1A突變是插入或缺失突變,這將導(dǎo)致編碼蛋白質(zhì)的缺失。有關(guān)研究已經(jīng)表明,ARID1A 蛋白表達(dá)的喪失與 ARID1A 突變密切相關(guān)[6,7]。此外,據(jù)報(bào)道ARID1A 表達(dá)的降低與膠質(zhì)瘤的病理分級(jí)相關(guān),并且ARID1A 的缺失與 EBV(-)MLH1 保留的胃癌中的腫瘤直徑、晚期浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后相關(guān)[8]。

編碼SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物亞單位的基因在所有人類(lèi)癌癥中累積突變20%以上。ARID1A是最常見(jiàn)的SWI/SNF亞單位基因,并在分子和組織學(xué)亞型癌癥下發(fā)生突變。近年來(lái)研究確定了ARID1A在SWI/SNF復(fù)合物定向到組織特異性維護(hù)其染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能中起到了關(guān)鍵作用[9,10]。在ARID1A缺陷的情況下,將會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)的廣泛失調(diào),從而導(dǎo)致腫瘤的形成。ARID1A突變的晚期癌癥患者免疫治療的總體存活時(shí)間大幅延長(zhǎng),表明其可以用于預(yù)測(cè)免疫治療在多種癌癥類(lèi)型的生存受益情況[11]。目前,ARID1A 的臨床意義及其在甲狀腺癌中的生物學(xué)功能仍未明確。本研究分析了甲狀腺癌中ARID1A蛋白的表達(dá)情況,并分析了ARID1A表達(dá)與臨床病理因素之間的相關(guān)性。此外,本研究通過(guò)檢查甲狀腺癌細(xì)胞系的增殖和紫杉醇耐藥性來(lái)探究 ARID1A 在甲狀腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制。

材料與方法

1.腫瘤組織樣本:選取納入2019年8月～2020年8月筆者醫(yī)院病例檔案中檢索到的106例甲狀腺癌患者病例資料。此外,組織學(xué)診斷和分化分級(jí)由筆者醫(yī)院兩名病理科醫(yī)師根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)獨(dú)立進(jìn)行評(píng)估。研究已獲得患者及家屬知情同意,并簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)筆者醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)[倫理學(xué)審批號(hào):(2019)倫審第(42)]。

2.免疫組化實(shí)驗(yàn):所有手術(shù)切除的腫瘤標(biāo)本用10%中性甲醛溶液固定,石蠟包埋,制備4μm厚切片。用抗生物素蛋白-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物方法(中國(guó)Ultra SensitiveTM公司)進(jìn)行免疫染色。此外,切片在二甲苯中脫蠟,在分級(jí)乙醇系列中再水化,并在高壓滅菌器中在 0.01mol/L 檸檬酸鹽緩沖液(pH值為6.0)中煮沸2min。最后,使用過(guò)氧化氫 (0.3%) 抑制內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性,然后與正常山羊血清孵育以減少非特異性結(jié)合。ARID1A (1∶200, 美國(guó)Sigma公司) 的一抗在4℃下孵育過(guò)夜,切片用非免疫IgG平行染色以提供陰性對(duì)照。然后通過(guò)EliVision plus試劑盒(貨號(hào):KIT-9903,中國(guó)麥新公司)檢測(cè)抗體結(jié)合的情況,再使用DAB色原進(jìn)行可視化,其切片用蘇木精復(fù)染、脫水并封片。兩名獨(dú)立研究者隨機(jī)檢查所有腫瘤載片的5個(gè)視圖,在 400 倍放大倍數(shù)下每個(gè)視圖觀察 100 個(gè)細(xì)胞,通過(guò)評(píng)估代表性腫瘤區(qū)域、強(qiáng)度和細(xì)胞百分比,按照半定量標(biāo)準(zhǔn)對(duì) ARID1A 的免疫染色進(jìn)行評(píng)分。腫瘤細(xì)胞的核染色被認(rèn)為是陽(yáng)性免疫染色。ARID1A 染色的強(qiáng)度也被評(píng)分為 0(無(wú)染色)、1(弱)、2(強(qiáng))分。百分比分?jǐn)?shù)被指定為 1(1%～25%)、2(26%～50%)、3 (51%～75%) 和 4 (76%～100%)分。將每個(gè)腫瘤樣本的分?jǐn)?shù)相乘得到0～8分的最終分?jǐn)?shù),ARID1A的總表達(dá)被確定為評(píng)分<4分:ARID1A低表達(dá);評(píng)分≥4分:高表達(dá)。

3.細(xì)胞培養(yǎng)和小干擾 RNA:正常人甲狀腺上皮細(xì)胞 TEC、甲狀腺癌細(xì)胞系SW579、BCPAP、KAT18、TPC-1和FTC133購(gòu)自ATCC,將細(xì)胞放置在 RPMI-1640 (型號(hào):C11875500BT, 美國(guó)Invitrogen公司) 中培養(yǎng),并在 37℃ 和 5% CO2中添加 10% 胎牛血清,實(shí)驗(yàn)前 24h將細(xì)胞接種于6孔板。ARID1A SMARTpool 小干擾 RNA (siRNA) 混合物和對(duì)照 siRNA (型號(hào):M-00353,美國(guó)Dharmacon公司)。根據(jù)試劑使用的說(shuō)明,使用 DharmaFECT1 試劑(貨號(hào):T-2001-01,美國(guó)Dharmacon公司)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作。

4.蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn):在裂解緩沖液(Pierce,美國(guó)Rockford公司)中提取細(xì)胞的總蛋白,用 Bradford 法進(jìn)行定量。使用 10% SDSPAGE 分離30μg蛋白,并轉(zhuǎn)移到 PVDF 膜(貨號(hào):ISEQ00010,美國(guó)Millipore公司)。同時(shí)在4℃下與抗ARID1A(1∶500,美國(guó)Sigma公司)、細(xì)胞周期蛋白 D1(Cyclin D1)、Bcl-2、p-Akt(1∶1000,細(xì)胞信號(hào),英國(guó)Abcam公司)的兔抗體一起孵育。洗滌后,將膜與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗(美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)在 37℃ 下在繼續(xù)孵育2h。使用 ECL(Pierce)觀察蛋白質(zhì)條帶,并使用 BioImaging Systems (貨號(hào):CA94785,美國(guó)UVP公司) 進(jìn)行檢測(cè)。此外,基于對(duì)照組的 GAPDH 蛋白來(lái)計(jì)算其相對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。

5.MTT增殖試驗(yàn):轉(zhuǎn)染 24h后,將細(xì)胞接種于含有 10% FBS培養(yǎng)基的96 孔板中(每孔約 2000個(gè))。為定量細(xì)胞活力,將 20μl 5mg/ml MTT(3-4, 5-二甲基噻唑-2-基-2, 5-二苯基溴化四唑,美國(guó)Sigma公司)溶液添加到每個(gè)孔中并在37℃下持續(xù)孵育4h。棄培養(yǎng)基,并將所得的 MTT 甲臜溶解在 150μl DMSO 中。溶液在 490nm下進(jìn)行分光光度法測(cè)量。

6.集落形成試驗(yàn):轉(zhuǎn)染48h后,將細(xì)胞種植到6cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中(每皿1000個(gè)細(xì)胞)孵育14天。然后用吉姆薩染色細(xì)胞,并計(jì)數(shù)超過(guò)50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)。

7.細(xì)胞凋亡檢測(cè):細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Annexin V/PI雙染法。轉(zhuǎn)染48h后,用0.25%胰蛋白酶收集細(xì)胞,冷 PBS 洗滌兩次,然后重懸在250μl結(jié)合緩沖液中。在細(xì)胞懸液中加入含有 Annexin V/FITC 和碘化丙啶的染色溶液,并在黑暗中孵育30min后,最后通過(guò)FACSCalibur流式細(xì)胞儀(貨號(hào):BD FACSCalibur,美國(guó)Becton Dickinson公司)分析。

結(jié) 果

1.ARID1A在甲狀腺癌中表達(dá)的臨床意義:通過(guò)免疫組化研究了106例甲狀腺癌組織和10例正常甲狀腺組織中ARID1A的表達(dá)情況。ARID1A的核染色被認(rèn)為是陽(yáng)性的,在正常甲狀腺組織中,癌旁組織中觀察到強(qiáng)核染色(圖1中A、B)。甲狀腺癌組織中,70例核ARID1A染色強(qiáng),36例染色減弱(圖1中C～F),即ARID1A蛋白主要積累在腫瘤細(xì)胞核中。分析ARID1A下調(diào)與臨床病理因素之間的關(guān)系發(fā)現(xiàn),ARID1A下調(diào)與腫瘤分化差(P=0.024)、TNM分期(P=0.009)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況(P=0.024)等相關(guān)性顯著, 但在年齡、性別和腫瘤組織學(xué)中,未觀察到 ARID1A 明顯的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),詳見(jiàn)表1。

圖1 ARID1A在甲狀腺正常組織及甲狀腺癌中的表達(dá)情況(×400)

表1 甲狀腺癌組織中ARID1A基因的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系(n)

2.ARID1A缺失促進(jìn)甲狀腺癌的細(xì)胞增殖和存活:在一組甲狀腺癌細(xì)胞系中通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析ARID1A的相對(duì)表達(dá)水平,并根據(jù)組織樣本,與正常TEC 細(xì)胞系比較,甲狀腺癌細(xì)胞系中的ARID1A蛋白表達(dá)顯著降低,尤其是在SW579和KAT18中(圖2A)。FTC133和BCPAP細(xì)胞系具有相對(duì)較高的ARID1A水平。使用ARID1A特異性siRNA抑制了ARID1A的表達(dá),并通過(guò)蛋白質(zhì)印跡分析證實(shí)了ARID1A表達(dá)缺陷的情況(圖2B)。ARID1A 缺失大大提高了細(xì)胞的增殖率(對(duì)照siRNA vs ARID1A siRNA, FTC133:1.281±0.062 vs 1.737±0.034,P<0.05;BCPAP:0.925±0.028 vs 1.208±0.025,P<0.05)和集落形成的潛力(siRNA對(duì)照 vs ARID1A siRNA, FTC133: 129±15 vs 215±19,P<0.05;BCPAP:179±15 vs 369±18,P<0.05,圖3中A、B)。細(xì)胞凋亡能力如圖3C所示,與對(duì)照siRNA(FTC133:25.5%;BCPAP:16.4%)比較,在 ARID1A敲低的細(xì)胞中觀察到早期和晚期顯著降低的凋亡百分比(FTC133:18.8%;BCPAP:10.5%),該實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明 ARID1A 敲低抑制甲狀腺癌細(xì)胞凋亡(圖3C)。

圖2 ARID1A在甲狀腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)及其敲低效果

圖3 ARID1A缺陷促進(jìn)細(xì)胞增殖,并抑制細(xì)胞凋亡

3.ARID1A 調(diào)節(jié)Cyclin D1、Bcl-2 和 Akt 磷酸化:檢測(cè)ARID1A缺陷細(xì)胞和對(duì)照細(xì)胞之間的一組生長(zhǎng)相關(guān)蛋白發(fā)現(xiàn),ARID1A敲低顯著提高了Cyclin D1、Bcl-2和Akt磷酸化水平(圖4)。

圖4 ARID1A敲低后Cyclin D1、Bcl-2和Akt磷酸化蛋白表達(dá)情況

討 論

ARID1A 表達(dá)的缺失已在各種癌癥中得到證實(shí),ARID1A表達(dá)降低與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤(rùn)和患者預(yù)后不良有關(guān)[12]。此外,ARID1A缺失還與上皮性卵巢癌的化學(xué)耐藥性和子宮內(nèi)膜癌的腫瘤進(jìn)展相關(guān)[13]。本研究證明了甲狀腺癌組織中ARID1A蛋白表達(dá)降低,這與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和pTNM分期顯著相關(guān)。此外,甲狀腺癌細(xì)胞系中ARID1A的表達(dá)缺失促進(jìn)增殖并抑制細(xì)胞凋亡,這與先前顯示ARID1A作為腫瘤抑制因子的觀點(diǎn)保持一致。

相關(guān)研究表明了ARID1A作為腫瘤抑制因子的證據(jù)?；謴?fù)ARID1A的表達(dá)能夠抑制小鼠模型的腫瘤細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)[14]。相反,沉默ARID1A表達(dá)可增強(qiáng)小鼠腫瘤異種移植模型中的細(xì)胞增殖和致瘤作用,這也與本研究結(jié)果一致。此外,在白血病細(xì)胞系中敲低ARID1A可以抵抗Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[15]。本研究發(fā)現(xiàn)ARID1A缺失可以抑制紫杉醇敏感度并提高甲狀腺癌存活率。通過(guò)進(jìn)一步檢查幾種細(xì)胞凋亡和增殖相關(guān)蛋白,發(fā)現(xiàn)ARID1A耗竭上調(diào)了Cyclin D1和Bcl-2的表達(dá),Cyclin D1在甲狀腺癌中過(guò)度表達(dá),并在G1-S檢查點(diǎn)促進(jìn)癌細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)程。Bcl-2是多種癌癥中的一種抗細(xì)胞凋亡蛋白,其上調(diào)會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞不死亡的現(xiàn)象[16]。這些結(jié)果都表明ARID1A可以通過(guò)調(diào)節(jié)Cyclin D1和Bcl-2來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡。

目前對(duì)ARID1A功能喪失導(dǎo)致癌癥進(jìn)展的機(jī)制知之甚少。在分子水平上,ARID1A/BRG1復(fù)合物已被證明與p53直接相互作用,轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)由p21、SMAD3等編碼的下游因子[17]。此外,研究證明ARID1A可以調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系中的磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)通路活性,ARID1A過(guò)表達(dá)通過(guò)PI3K途徑抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖以及降低p-Akt和p-S6K的表達(dá)[18,19]。本研究表明,ARID1A缺失明顯激活甲狀腺癌細(xì)胞系中的Akt磷酸化,Akt通過(guò)BAD磷酸化和促存活基因的激活來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和存活,并且Akt的激活也被證明可以克服G1期的細(xì)胞周期停滯。Akt已被證明是一種有前景的癌癥治療靶點(diǎn)。因此,ARID1A的生物學(xué)作用可能取決于其與Akt通路的相互作用。

綜上所述,本研究證實(shí)了ARID1A蛋白在甲狀腺癌中的表達(dá)下調(diào)及其與pTNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等的相關(guān)性。此外,本研究結(jié)果表明ARID1A缺失可以促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞的增殖,抑制細(xì)胞凋亡,這可能是通過(guò)Akt介導(dǎo)的Cyclin D1和Bcl-2調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。鑒于這些發(fā)現(xiàn),ARID1A在甲狀腺癌中是一個(gè)重要的腫瘤抑制因子,未來(lái)需要開(kāi)展深入研究探討其分子機(jī)制。