高廷廷 郭元勛 曹 哲 張 鑫 陳 帥 陳浩男 陳建立

甲狀腺癌(thyroid cancer,TC)是最常見的內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤,在全球腫瘤發(fā)生率中居第9位,且發(fā)生率逐年上升[1]。晚期甲狀腺癌和碘耐藥甲狀腺癌相關(guān)的病死率高。lncRNA LINC00978又稱miR4435-2HG和AK001796,是一種新的癌基因,位于人類基因組2Q13區(qū)域,由Yang等[2]在研究白藜蘆醇抑制肺癌細胞增殖和生長的機制中首次發(fā)現(xiàn)。隨后,大量研究發(fā)現(xiàn)LINC00978在胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中異常高表達,同時可作為診斷標志物,為腫瘤的治療提供潛在的靶點[3～5]。MAPK信號通路在調(diào)節(jié)細胞增殖、生長、存活和去分化方面發(fā)揮重要作用,尤其在分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid carcinoma, DTC),MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的激活更為重要[6,7]。

碘難治性分化型甲狀腺癌(radioiodine-refractory differentiated thyroid cancer, RR-DTC)之所以碘劑治療效果差是因為其腫瘤的細胞發(fā)生了去分化即逐漸失去其特有的分化特征,這里面就包含促甲狀腺激素受體和鈉碘同向轉(zhuǎn)運體,這些重要受體的缺失或功能降低,直接導致內(nèi)分泌治療和碘劑治療對此類患者沒有作用[8,9]。其發(fā)病機制與MAPK/ERK信號通路密切相關(guān)[10]。有文獻報道,lncRNA LINC00978在肝癌中高表達,并通過激活MAPK信號通路促進肝癌細胞異常增殖及侵襲[11]。本實驗就LINC00978對甲狀腺乳頭狀癌細胞生物學行為的影響及其與MAPK/ERK信號通路的關(guān)系進行研究。

材料與方法

1.主要材料與試劑:人甲狀腺乳頭狀癌TPC-1細胞系購自中實基因科技有限公司;si-NC(5′-UUGUACUACACAAAAGUACUG-3′)、si-LINC00978-1(轉(zhuǎn)染組1)(5′-GCAGAAGACAAAGCCGAAUUU-3′)、si-LINC00978-2(轉(zhuǎn)染組2)(5′-CCACAAGCUUUCCUUAACUUU-3′)、si-LINC00978-3(轉(zhuǎn)染組3)(5′-CUAGGUCACUACUGCUUUAUU-3′)均由中實基因科技有限公司設(shè)計合成;1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;兔抗人ERK1/2單克隆抗體、兔抗人P-ERK1/2單克隆抗體購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;GAPDH抗體、二抗 Anti-rabbit IgG購自美國Cell Signaling Technology公司;qRT-PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;Trizol試劑購自美國Invitrogen公司;RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;Transwell小室購自美國Corning公司;CCK-8試劑盒購自美國SAB公司。

2.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染:用完全1640培養(yǎng)基(將1640培養(yǎng)基、10%FBS、青鏈霉素雙抗按照9∶1∶0.1比例配制)培養(yǎng)TPC-1細胞,并將其放置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中,待細胞生長密度達80%以上時,按照1∶2進行傳代繼續(xù)培養(yǎng),定期觀察細胞貼壁生長狀況,篩選同一批次生長狀態(tài)良好且處于對數(shù)生長期的細胞按照3×106個/孔標準接種細胞,依據(jù)Lipofectamine 2000的操作說明進行轉(zhuǎn)染,分別將轉(zhuǎn)染si-RNA、si-NC、PBS作為轉(zhuǎn)染組、對照組、空白組,轉(zhuǎn)染6h后更換為新鮮無雙抗的培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng),并進行后續(xù)實驗。

3.qRT-PCR檢測各組的LINC00978的相對表達量:利用Trizol試劑提取各組中的總RNA,隨后進行RNA純度檢測,當1.8

4.CCK-8法檢測各組細胞增殖活力:選取同一批次生長狀態(tài)良好的細胞,對其進行消化、細胞計數(shù),計數(shù)完成后按照(1～5)×103個/孔的接種密度對細胞進行重新接種鋪96孔板,每組設(shè)置6個復孔,檢測前用新的完全1640培養(yǎng)基取代100毫升/孔,加入適量的CCK-8,并放置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),使用酶標儀檢測樣本孔在450nm波長處A值。觀察轉(zhuǎn)染后24h(T24)、48h(T48)、72h(T72)、96h(T96)的各組細胞A值變化情況。

5.單層細胞愈合實驗檢測各組細胞遷移能力:選取處于對數(shù)生長期的細胞,加入適量0.25%胰蛋白酶,消化、計數(shù),按照3×105個/孔的密度將細胞接種于6孔板中,每組設(shè)置3個復孔,待細胞培養(yǎng)至100%,用同一規(guī)格的無菌槍頭沿細胞板底部劃一條直線,用無菌PBS緩沖液沖洗細胞板,加入空白1640培養(yǎng)基,繼續(xù)放置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),分別在0、48h拍照記錄劃痕面積,并用Image J 軟件計算48h后的細胞遷移率(%)=(0h遷移面積-48h遷移面積)/0h遷移面積×100%,以上實驗至少重復3次。

6.Transwell侵襲實驗檢測各組細胞侵襲能力:將Matrigel膠放置于4℃冰箱中融化,按照Matrigel膠∶1640培養(yǎng)基=1∶9比例進行稀釋,均勻加入上層小室底部,同時將轉(zhuǎn)染后的細胞按照10000/小室加入,下室加入適量含有血清的培養(yǎng)基,放置于37℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,每組設(shè)置3個復孔。之后對小室進行甲醛固定,結(jié)晶紫染色,放置顯微鏡下進行拍照計算穿過小室背面的細胞數(shù)即侵襲細胞數(shù),重復以上實驗3次。

7. Western blot法檢測各組ERK、P-ERK的蛋白表達情況:提取各組細胞的總蛋白(全程冰上進行),用BCA蛋白定量法確定上樣量,加入2×上樣緩沖液和1×上樣緩沖液后煮沸使蛋白變性,制備10%分離膠及5%濃縮膠,上樣后開始電泳,先90V 30min然后120V 40min,剪切合適大小的PVDF膜,并用甲醛激活后進行濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜,300mA恒流 90min,轉(zhuǎn)膜完成后放置5%BSA溶液中進行封閉1h,加入一抗,4℃搖床過夜,再將膜與二抗孵育2h,ECL發(fā)光試劑盒進行顯影,Image J軟件分析條帶灰度值,以GAPDH為內(nèi)參,重復以上實驗3次,蛋白相對表達量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參GAPDH灰度值。

結(jié) 果

1.qRT-PCR檢測各組中LINC00978的相對表達量:空白組的基因相對表達量為1.00±0.09,對照組的基因相對表達量為0.95±0.03,轉(zhuǎn)染組1的LINC00978相對表達量為0.28±0.01,轉(zhuǎn)染組2的LINC00978相對表達量為0.39±0.03,轉(zhuǎn)染組3的LINC00978相對表達量為0.10±0.01,3個干擾基因轉(zhuǎn)染成功并且基因干擾有效結(jié)果如圖1所示。選擇轉(zhuǎn)染組3進行后續(xù)實驗。

圖1 各組中LINC00978的表達量

2.干擾LINC00978對TPC-1細胞增殖、遷移及侵襲的影響:轉(zhuǎn)染24、48、72、96h后,轉(zhuǎn)染組的細胞增殖能力均低于對照組及空白組(P<0.01),差異有統(tǒng)計學意義。且3組在不同時間點增殖能力皆有差異(P<0.01,表1、圖2)。轉(zhuǎn)染組的48h細胞遷移率較對照組和空白組低,差異有統(tǒng)計學意義(28.14%±1.84% vs 45.26%±2.71%、47.33%±6.95%,P<0.01,圖3)。轉(zhuǎn)染組較對照組及空白組侵襲細胞數(shù)減少,差異有統(tǒng)計學意義(184.00%±10.82% vs 404.00%±6.56%、411.00%±14.93%,P<0.01,圖4)。以上實驗結(jié)果可見干擾LINC00978后可以抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力,但是其具體機制仍不清楚。

圖2 各組不同時間點的吸光度

圖3 倒置顯微鏡下觀察TPC-1細胞空白組、對照組、實驗組的細胞遷移情況(×100)

圖4 結(jié)晶紫染色觀察空白組、對照組、實驗組的細胞侵襲情況(×200)

表1 各組在不同時間點的A值

3.干擾LINC00978對MAPK/ERK信號通路的影響:Weatern blot法檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染組的P-ERK1/2的表達量較對照組和轉(zhuǎn)染組減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。ERK1/2表達量在3組之間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,表2、圖5),說明lncRNA LINC00978可以影響P-ERK1/2的表達。干擾LINC00978后可以抑制MAPK/ERK信號通路中P-ERK蛋白的表達。

表2 各組P-ERK1/2、ERK1/2的表達

圖5 Western blot法檢測各組P-ERK1/2、ERK1/2的表達

討 論

近年來,lncRNA成為惡性腫瘤研究中的重點和熱點,其功能多樣,作用機制復雜多元化,在調(diào)控細胞功能和惡性腫瘤進展方面具有重要作用,同時對于臨床治療而言也有很重要的意義,其可以作為診斷惡性腫瘤及評估癌癥預后的重要的分子標志物[12]。LINC00978是一種新的癌基因,近年來有文獻報道,LINC00978在宮頸癌中發(fā)揮促癌基因的作用,其可通過負調(diào)控miR128-3p促進宮頸癌細胞的活力、遷移能力和體外侵襲能力[13]。目前靶向治療是除了手術(shù)、131I、內(nèi)分泌治療甲狀腺癌的第4種治療手段,大量分子生物學及基礎(chǔ)實驗研究是發(fā)展靶向治療的重要基石[14]。由細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)誘發(fā)的MAPK/ERK信號轉(zhuǎn)導途徑被認為是主要的MAPK信號通道。研究證明MAPK/ERK通路在腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮非常重要的作用,尤其在加速腫瘤進展方面[15]。

本研究使用si-RNA轉(zhuǎn)染來構(gòu)建抑制靶基因的細胞模型[16,17]。因LINC00978堿基數(shù)目多,不容易抑制,于是選取針對不同靶點的3個siRNA進行干擾,qRT-PCR顯示3個siRNA都可以有效抑制靶基因LINC00978,于是選取抑制效果最佳的干擾小RNA進行后續(xù)實驗。通過下調(diào)LINC00978研究其對甲狀腺癌一些腫瘤性行為的影響,結(jié)果表明,其可以顯著抑制甲狀腺乳頭狀癌細胞的增殖能力,且抑制增殖的作用與時間呈正相關(guān),同時干擾LINC00978后對細胞的遷移能力及侵襲能力也有一定程度的抑制作用,而對照組和空白組之間的細胞增殖能力、遷移能力、侵襲能力無明顯差異,這表明實驗操作的過程不影響本次實驗結(jié)果。上述的3個細胞功能實驗顯示甲狀腺乳頭狀癌細胞內(nèi)的lncRNA LINC00978可以促進腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲。隨后通過免疫印跡實驗技術(shù)對MAPK/ERK信號通路的關(guān)鍵分子ERK1/2、P-ERK1/2的表達情況進行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染si-LINC00978后可以降低TPC-1細胞中P-ERK1/2表達,而對ERK1/2表達無明顯影響。這說明了LINC00978可以對ERK發(fā)揮作用,主要是提高P-ERK1/2水平,Western blot法結(jié)果在一定程度上說明LINC00978可能會激活MAPK/ERK信號通路。

在甲狀腺癌的發(fā)生機制中,RET-RAS-RAF-MEK-MAPK/ERK信號通路,發(fā)揮著重要作用,尤其在碘難治性甲狀腺癌的發(fā)病機制中,MAPK/ERK信號通路激活后使磷酸化的ERK進入細胞核內(nèi)與特定轉(zhuǎn)錄因子或核蛋白發(fā)生反應,下調(diào)甲狀腺特異基因的表達即促甲狀腺激素受體、鈉碘同向轉(zhuǎn)運體、甲狀腺球蛋白等,最終導致細胞膜上的鈉碘同向轉(zhuǎn)運體表達降低,與碘劑親和性變差,對碘劑不敏感[10]。因此可以通過抑制這些通路關(guān)鍵分子而阻斷通路信號分子對鈉碘同向轉(zhuǎn)運體表達的影響,或者抑制相關(guān)基因從而阻斷因基因異常表達而激發(fā)的信號通路激活導致鈉碘同向轉(zhuǎn)運體低表達,這對于提高甲狀腺癌的預后具有重大意義。

綜上所述,LINC0098對甲狀腺乳頭狀癌細胞的腫瘤性生物學行為產(chǎn)生了一定的影響,其可能通過MAPK/ERK信號通路促進甲狀腺癌乳頭狀癌進展。LINC00978有望成為甲狀腺癌治療的新靶點,也有可能為臨床治療RR-DTC提供潛在的靶點,但是關(guān)于LINC00978調(diào)控甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生、發(fā)展的具體機制有待于深入研究。LINC00978與甲狀腺特異基因表達之間的關(guān)系尚待進一步開展實驗予以驗證,這些研究將成為甲狀腺癌靶向治療的理論基礎(chǔ),甚至為臨床上碘難治性甲狀腺癌的靶向治療提供了新思路。