金 銘 王寧寧 鄭夢(mèng)琳 武 楠 林樹東 張智龍 才奇博 鄭玉婷 張 昊 胡 瑩 周宇忱 李雪巖 楊秀靜 邱長(zhǎng)春 李靜平

腦卒中是多基因、遲發(fā)性和極具破壞性的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,約80%是缺血性腦卒中,其遺傳病因?qū)W尚未完全闡明[1]。我國(guó)腦卒中發(fā)生率存在明顯地域化差異,呈現(xiàn)北高南低,黑龍江省腦卒中發(fā)生率居全國(guó)第一[2,3]。雖然,許多研究認(rèn)為血漿同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)水平升高是缺血性腦卒中的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素,但是其分子作用機(jī)制仍缺少實(shí)質(zhì)性了解[4～6]。

Hcy是葉酸代謝狀態(tài)最敏感的標(biāo)志物。Hcy水平來(lái)自食物平衡、遺傳因素和(或)兩者協(xié)同作用。葉酸代謝是復(fù)雜的過(guò)程,包括多種互相依賴可提供甲硫氨酸合成和DNA、RNA及蛋白質(zhì)甲基化作用所需甲基供體的酶促反應(yīng)構(gòu)成的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[7,8]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶(5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, MTHFR)是葉酸代謝通路中的重要酶,也是Hcy生成的關(guān)鍵限速酶。MTHFR的功能是催化5,10-甲基四氫葉酸生成5-甲基四氫葉酸,它是Hcy向甲硫氨酸轉(zhuǎn)化所需甲基供體的前體物[9～11]。本研究以Hcy作為中介表型,探討血漿同型半胱氨酸水平,MTHFR基因C677T多態(tài)性與LAA IS易感風(fēng)險(xiǎn)性。

材料與方法

1.研究人群:本研究采用基于群體的病例/對(duì)照研究,已獲得齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn){倫理學(xué)審批號(hào):齊倫審[2022]52號(hào)},并征得每位參加者的知情同意。研究納入2612例無(wú)血緣關(guān)系世居北緯47°～53°高寒地區(qū)漢族人樣本。病例組樣本847例,為發(fā)病年齡≤55歲的大動(dòng)脈粥樣硬化(large artery atherosclerosis,LAA)缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)病例;對(duì)照組樣本1765例。病例選擇:病例樣本取自齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院。病例診斷根據(jù)神經(jīng)癥狀出現(xiàn)并經(jīng)過(guò)CT和(或)MR影像證實(shí)。按照TOAST分型標(biāo)準(zhǔn),排除心源性腦卒中、小動(dòng)脈閉塞性腦卒中、出血性腦卒中、短暫性腦缺血發(fā)作和其他不明原因的缺血性腦卒中。對(duì)照選擇:通過(guò)基于自愿的免費(fèi)常規(guī)查體,選擇年齡、性別、民族、居住地相匹配,數(shù)量(病例∶對(duì)照=1∶2)為1765例健康對(duì)照個(gè)體。納入標(biāo)準(zhǔn):①年齡≥40歲;②至少3代居住在該地區(qū),無(wú)異民族婚配;③排除高血壓、心臟病、腦卒中和其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如老年癡呆等)個(gè)人和家族病史。

2.研究方法:(1)人口學(xué)資料:通過(guò)問(wèn)卷調(diào)查,獲取被調(diào)查對(duì)象的年齡、性別、職業(yè)、民族、本人及家族病史(高血壓、糖尿病、冠心病、心、腦血管病、老年癡呆等神經(jīng)系統(tǒng)疾病),吸煙、飲酒及飲食習(xí)慣等相關(guān)資料。(2)人體學(xué)資料:通過(guò)常規(guī)全面查體獲得人體學(xué)資料。測(cè)量身高、體重,計(jì)算體重指數(shù)(body mass index, BMI),BMI≥28kg/m2為肥胖。使用臺(tái)式汞柱式血壓計(jì)測(cè)量血壓和心率。按國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)在未服藥情況下,收縮壓(systolic blood pressure, SBP)≥140mmHg和(或)舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)≥90mmHg為高血壓。使用指夾式脈搏血氧儀測(cè)量血氧飽和度(西藏華大科技有限公司),本研究中的血氧飽和度為3次測(cè)定的平均值。(3)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn):使用全自動(dòng)生化分析儀(貝克曼AU5800)測(cè)定甘油三酯、總膽固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、血糖、血尿酸、肌酐。(4)同型半胱氨酸水平測(cè)定:取急性期LAA IS患者空腹外周血5ml,EDTA抗凝。3000r/min離心10min,取上清血漿-80℃保存,待測(cè)定血漿Hcy水平。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)法測(cè)定Hcy水平。

3.基因分型:(1)制備基因組DNA:使用柱式中量DNA提取試劑盒(北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司),從外周血白細(xì)胞分離基因組DNA。將沉淀DNA溶于GE緩沖液(10mmol/L Tris-Hcl,1mmol/L EDTA-Na2,pH值為8.0),-20℃保存。使用微量分光光度儀(Thermo Nano drop 2000)測(cè)定DNA濃度和純度,其純度達(dá)A260/A280≥1.80。(2)基因分型:采用Sequenom Mass Array質(zhì)譜技術(shù),使用Spectrochip-G384芯片單引物延伸法,利用UCSC在線工具設(shè)計(jì)引物,分別從病例、對(duì)照組隨機(jī)選取20例樣本進(jìn)行DNA測(cè)序,兩種方法符合率達(dá)100%。

結(jié) 果

1.研究人群的基本特征:病例組(n=847,男性/女性=466/381,平均年齡為52.48±6.76歲)和對(duì)照組(n=1765,男性/女性=666/1099,平均年齡為50.82±8.87歲)的生理和生化檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表1。病例組的收縮壓139.93±18.37mmHg和舒張壓87.72±11.92mmHg明顯高于對(duì)照組收縮壓118.32±13.16mmHg和舒張壓77.46±8.95mmHg,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),同時(shí)脈壓差也呈現(xiàn)出這種趨勢(shì),說(shuō)明高血壓是腦卒中的主要危險(xiǎn)因素。

表1 研究人群的基本特征

2.MTHFR C677T基因型和等位基因頻率分布:兩組人群MTHFR C677T基因型分布未偏離Hardy-Weinberg平衡,P>0.05。病例組TT純合基因型頻率(2.13%)明顯高于對(duì)照組(0.85%)。未調(diào)節(jié)影響因素時(shí),OR為2.578(95%CI:1.291～5.150,P=0.007)。為了排除年齡、性別的可能影響,筆者針對(duì)年齡、性別進(jìn)行調(diào)整,調(diào)整后的OR為2.430(95%CI:1.177～5.014,P=0.016)差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明基因型TT與LAA IS易感相關(guān)(表2)。分析3種不同遺傳模式效應(yīng)結(jié)果詳見(jiàn)表3。隱性遺傳模式效應(yīng)最強(qiáng),OR為2.533(95%CI:1.270～5.051,P=0.008),調(diào)整年齡、性別后,OR為2.398(95%CI:1.164～4.942,P=0.018),說(shuō)明TT基因型的隱性遺傳模式是LAA IS的危險(xiǎn)因素(圖1)。

圖1 不同種族人群MTHFR基因C677T變異隱性遺傳模式與LAA IS易感相關(guān)效應(yīng)比較

表2 MTHFR C677T基因型與等位基因頻率在病例組與對(duì)照組間的頻率分布[n(%)]

表3 3種遺傳模式(加性、顯性和隱性)的效應(yīng)分析

3.MTHFR C677T基因型與血漿同型半胱氨酸水平:病例組平均血漿Hcy水平14.04±7.77μmol/L明顯高于對(duì)照組11.04±4.51μmol/L。組間同一基因型比較,也是病例組高于對(duì)照組,提示除了MTHFR C677T多態(tài)性外,可能還有其他因素影響患者血漿Hcy水平(圖2)。進(jìn)一步觀察了病例組基因型和血漿Hcy水平相關(guān)性。結(jié)果表明,病例組中TT純合基因型攜帶者血漿Hcy水平明顯高于CT和CC基因型攜帶者,依次為TT (22.26±11.11μmol/L)>CT(19.98±8.69μmol/L)>CC(11.78±2.19μmol/L)。

圖2 MTHFR基因型與血漿Hcy水平比較

討 論

缺血性腦卒中是多基因、遲發(fā)性復(fù)雜疾病的典型范例。高度遺傳異質(zhì)性是缺血性腦卒中遺傳病因?qū)W研究的主要瓶頸。為了便于篩查、鑒定其易感基因,本研究以同型半胱氨酸作為特定中介表型,以急性、早發(fā)大血管動(dòng)脈硬化型缺血性腦卒中作為研究對(duì)象進(jìn)行分層分析,其優(yōu)點(diǎn)是:①使研究人群遺傳背景趨于均一,減少遺傳噪音影響;②早發(fā)型較遲發(fā)型病例可富集更多外顯性強(qiáng)的基因變異,即使是同一基因變異在早發(fā)病例中的效應(yīng)強(qiáng)于遲發(fā)型病例,可提高統(tǒng)計(jì)學(xué)強(qiáng)度。

MTHFR是相對(duì)分子質(zhì)量為70～77kDa的二聚體蛋白質(zhì),其編碼基因定位于人類染色體短臂1p36.6區(qū)域,具有多態(tài)性,迄今已鑒定出10多種單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)[12]。MTHFR C677T功能性變異是最常見(jiàn)且被廣泛研究的多態(tài)性位點(diǎn)。MTHFR基因第677位胞嘧啶被胸腺嘧啶取代,致使酶蛋白第222位丙氨酸(Ala)變?yōu)槔i氨酸(Val),降低酶的熱穩(wěn)性和酶活性。在37℃,677 TT純合基因型較野生CC純合基因型,酶活性可降低50%～60%;在46℃,酶活性可降低65%,從而引起血漿Hcy水平升高,發(fā)生高同型半胱氨酸血癥[13,14]。本研究病例組中,Hcy水平與不同基因型的相關(guān)性呈現(xiàn)TT>TC>CC趨勢(shì)。同時(shí),基因型OR也呈現(xiàn)TT>TC>CC的趨勢(shì),兩者關(guān)系變化趨勢(shì)的一致性,說(shuō)明Hcy水平升高是缺血性腦卒中獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素與MTHFR C677T變異密切相關(guān)。

MTHFR基因C677T變異頻率存在明顯地域變化和種族差異[15]。研究數(shù)據(jù)表明,在歐洲西班牙人和意大利人MTHFR 677T等位基因頻率較高,而美國(guó)黑種人和非洲黑種人MTHFR 677T等位基因頻率較低。同是白種人,在歐洲西班牙人和意大利人677 TT純合基因型頻率較高(21%),而德國(guó)人TT純合基因型頻率最低。此外,非歐洲的白種人,如加拿大、美國(guó)、巴西和澳大利亞的白種人,MTHFR 677TT純合基因型頻率變化在10%～14%。非洲黑種人TT純合度幾乎為零;而生活在美國(guó)和巴西的黑種人TT純合度極低,僅為1%～2%。有關(guān)亞洲人群研究資料較少,日本人MTHFR基因677TT純合頻率約為11%,印度人是0～1.2%[16,17]。在我國(guó),不同研究報(bào)告漢族人MTHFR基因677T等位基因或TT純合基因型頻率差異較大[18]。

本研究MTHFR C677T基因型與缺血性腦卒中易感相關(guān)性結(jié)果顯示,在隱性遺傳模式,TT純合基因型的OR是2.398(95%CI:1.164～4.942,P=0.018)明顯高于Mao等[18]報(bào)告的遲發(fā)性患者OR值(OR=1.920,95%CI:1.190～3.100,n=130,平均年齡為68.42±13.26歲,LAA IS患者),說(shuō)明MTHFR基因變異可能在早發(fā)患者中起更重要作用。

多項(xiàng)研究表明,血清Hcy水平升高預(yù)示著平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致活化凝血因子,抑制纖溶酶原激活劑表達(dá),促進(jìn)內(nèi)皮增生,從而進(jìn)一步抑制凝血酶表達(dá)和組織型纖溶酶原激活劑和硫代肝素的合成。最終通過(guò)炎性細(xì)胞因子分泌,血小板凝集,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化和凝血。動(dòng)脈粥樣硬化和凝血都是缺血性腦卒中的重要危險(xiǎn)因素[19]。因此,本研究結(jié)果有助于揭示血清Hcy水平升高作為缺血性腦卒中獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素的遺傳病因?qū)W分子基礎(chǔ)。