黃燕華 劉 澍 李言鳳

齲病因其具有發(fā)生率高、分布廣等特點,已成為人類常見慢性病之一[1]。目前,齲齒的治療方法主要是以人工合成材料來替代缺損的牙體組織,但是這并不能完全恢復牙齒的生物學性能,導致牙體抵抗力降低,進而對牙髓組織造成不同程度的損傷,最終導致治療的失敗[2]。

乳牙牙髓干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth,SHED)作為一種成體干細胞,具有較強的增殖和自我更新能力,在礦化誘導液的作用下可成牙本質(zhì)向分化并形成類牙本質(zhì)樣結(jié)構(gòu),故被認為是修復性牙本質(zhì)形成中理想的種子細胞[3]。因此,以SHED為研究對象,深入闡明成牙本質(zhì)向分化的機制,將有助于修復性牙本質(zhì)的形成。

外泌體(exosome,Exo)是間充質(zhì)干細胞主動分泌的大小均一、直徑在200nm以內(nèi)的一種細胞外囊泡[4]。近年來關(guān)于牙源性間充質(zhì)干細胞的外泌體相關(guān)研究越來越多[5],研究證明Exo可通過其攜帶的microRNA(miRNA)發(fā)揮促進細胞增殖分化、抑制細胞凋亡、促進血管生成等作用。miRNA 長度僅為20～25nt,具有高度保守性、表達時序性和組織特異性等特點,保守估計,人類約有2/3 的蛋白編碼基因受miRNA調(diào)控,miRNA幾乎參與所有生命活動的調(diào)節(jié)[6]。然而 miRNA 數(shù)量眾多,仍有諸多未知miRNAs 可能與成牙本質(zhì)向分化有關(guān)。

SHED外泌體(SHED-exosome, SHED-Exo)的特性及它所能發(fā)揮的作用研究尚少,它如何調(diào)控分化功能的機制也還沒有明確報道[7]。本研究利用基因芯片技術(shù),篩選分析在SHED分化過程中的外泌體的差異表達的miRNAs,初步探討其在SHED分化過程中可能發(fā)揮的作用,進而為修復性牙本質(zhì)形成工程提供新的方向和理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料:DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、雙抗(美國Gibco公司);無外泌體的血清(美國System Biosciences公司);成骨培養(yǎng)基、成脂培養(yǎng)基(美國ScienCell公司);茜素紅染色試劑盒、油紅O染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);ALP活性檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR熒光定量試劑(德國QIAGEN公司);蛋白定量試劑盒、蛋白質(zhì)印跡發(fā)光液(美國Thermo Scientific 公司);流式抗體CD146-PE、CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45(美國Biolegend ebioscience公司);CD63、CD9單克隆抗體(美國Santacruz公司)等。

2.標本收集:來源于2020年4～7月就診于南京醫(yī)科大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院兒童口腔科,因替牙期乳牙滯留或者二度松動需要拔除的乳牙。所有志愿者無關(guān)節(jié)炎病史及全身系統(tǒng)性疾病史,并且2個月內(nèi)未服用免疫抑制劑及抗菌藥物。所有標本獲取均取得患者知情同意并經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會批準{倫理學審批號:寧婦倫字[2020]KY-028號}。將新鮮拔除的乳牙在頸部使用渦輪機磨一引導溝,置入盛有DMEM培養(yǎng)基的無菌離心管中,用裝有冰塊的保溫桶迅即運輸至實驗室。

3.SHED的分離培養(yǎng)及鑒定:在超凈臺內(nèi),使用切斷鉗在引導溝處夾斷牙齒,用鑷子將牙髓取出,PBS多次沖洗,在DMEM培養(yǎng)基中剪成約 0.5～1.0mm3大小,并加入 1ml Ⅰ型膠原酶(3mg/ml) 和中性蛋白酶(4mg/ml),37℃消化 45min,收集細胞與組織碎塊移入培養(yǎng)瓶中,加入含 10% FBS的DMEM培養(yǎng)基。SHED表面標志物的流式鑒定:PBS洗細胞3次,重懸,計數(shù),以1×105/100μl分裝至離心管內(nèi),分別加入2μl CD146-PE、CD29-PE、CD90-PE、CD105-PE、CD34-PE、CD45-PE,室溫避光孵育1h,離心,過濾,重懸,移至流式細胞管內(nèi),上機檢測。SHED多向分化能力的鑒定:當細胞生長至80%時,分別更換為礦化誘導培養(yǎng)基和成脂誘導培養(yǎng)基,培養(yǎng)21天,每3天換液1次,分別進行茜素紅和油紅O染色,用倒置顯微鏡觀察并拍照。

4. SHED的堿性磷酸酶(ALP)活性檢測:礦化誘導7、14和21天后,分別用ALP試劑盒檢測。PBS洗兩次,在4℃條件下0.2% Triton X-100過夜裂解。然后,根據(jù)說明書將工作液添加到細胞裂解液中,孵育后,用自動酶標儀在520nm處測量每個樣品的吸光度值。

5.超速離心法收集SHED-Exo及鑒定:待細胞生長至80%時,PBS洗兩次,更換為含10%無外泌體的FBS培養(yǎng)基,培養(yǎng)48h,收集培養(yǎng)液,進行如下離心步驟(300×g4℃離心10min,2000×g4℃離心10min,10000×g4℃離心30min)。透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)形態(tài)學檢測:PBS稀釋后,滴在可輝光放電的150目formvar銅網(wǎng)上,4℃孵育2min,洗滌銅網(wǎng),用2%乙酸雙氧鈾溶液負染,并干燥,在80kV電壓下觀察。納米顆粒跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)粒徑:PBS稀釋后,將樣本注入樣品池,用蓋子封住樣品池;按照標準操作流程操作儀器檢測。Western blot法鑒定表面標志物:設(shè)置SHED蛋白作為對照, 分別提取SHED以及SHED-Exo的蛋白,測定蛋白濃度,垂直電泳,轉(zhuǎn)膜,封閉;孵育一抗CD9(23～27kDa)和CD63(26kDa),4℃過夜,加入相應的二抗,常溫孵育1h,ECL法檢測暗室曝光。

6.分化前后的SHED-Exo的miRNAs表達譜檢測:按照生物公司的送樣要求,將處理過的分化前后的細胞上清液保存在干冰中,送至上?？党缮锛夹g(shù)有限公司,由該公司完成外泌體的 miRNAs 基因芯片檢測。

7.實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR):用Trizol試劑提取細胞樣本總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA后使用SYBR Premix Ex Taq試劑盒進行qPCR擴增。GAPDH作為內(nèi)參檢測選定成牙分化相關(guān)的基因,U6作為內(nèi)參檢測選定的miRNAs的表達,用2-ΔΔCT法測定相對表達量。成牙分化相關(guān)基因的引物序列為:OPN上游引物:5′-AGCCAGGACTCCATTGACTCGAAC-3′和下游引物:5′-GTTTCAGCACTCTGGTCATCCAGC-3′;DSPP上游引物:5′-CAACCATAGAGAAAGCAAACGCG-3′和下游引物:5′-TTTCTGTTGCCACTGCTGGGAC-3′; DMP1上游引物:5′-CAGGAGCACAGGAAAAGGAG-3′和下游引物:5′-CTGGTGGTATCTTGGGCACT-3′; OSX上游引物:5′-GCCAGAAGCTGTGAAACCTC-3′和下游引物:5′-GCTGCAAGCTCTCCATAACC-3′;GAPDH上游引物:5′-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3′和下游引物:5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。miRNA的引物由銳博生物公司設(shè)計,通過Bulge-loopTMmiRNA qRT-PCR引物組(每組1個RT引物和1對qPCR引物)對miRNAs進行定量,對每個miRNA進行特異性檢測。

8.生物信息學分析:通過miRDBV5和TargetScan7.1進一步預測驗證的差異表達miRNAs的靶基因,然后對重疊靶點進行GO分析和KEGG通路的功能分析。

結(jié) 果

1.SHED的培養(yǎng)鑒定:SHED細胞大多數(shù)為梭形或多角形,礦化誘導培養(yǎng)7、14和21天后,ALP活性和成牙分化相關(guān)基因(OPN、DSPP、DMP1、OSX)明顯增強;顯微鏡下觀察,在礦化誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)21天的SHED可見明顯的紅色礦物結(jié)節(jié),在成脂誘導液培養(yǎng)21天的SHED可見細胞間形成紅色發(fā)亮小脂滴。(圖1中A～D)流式細胞儀檢測分析,分離培養(yǎng)的SHED表達 CD146,CD29,CD90,CD105,陽性率分別為 25.55%、99.11%、99.24%和0.71%,該結(jié)果與文獻報道的間充質(zhì)干細胞特征相一致(圖1E)。

圖1 原代分離的SHED的形態(tài)學和鑒定

2.SHED-Exo的鑒定:TEM結(jié)果顯示,分化前后的SHED-Exo直徑為100～150nm,呈現(xiàn)典型的茶托形雙層膜結(jié)構(gòu);NTA結(jié)果顯示分化前后的外泌體粒徑均一,且峰值分別為134.3nm和136.7nm;SHED-Exo的CD63、CD9表面蛋白表達量,與對照組SHED細胞蛋白比較,表現(xiàn)為明顯的上調(diào);以上特征均符合外泌體特征(圖2)。

圖2 SHED-Exo的形態(tài)學和表型的鑒定

3.分化前后的SHED-Exo的miRNAs表達譜鑒定:在分化前后的SHED-Exo中共鑒定出215個miRNAs,其中有37個miRNAs表達顯著差異(13個下調(diào)<0.2倍和24個上調(diào)>5倍,表1、表2)。采用芯片的miRNAs 的標準值進行聚類分析,關(guān)系近的miRNAs會聚到一起(圖3A)。為了進一步確定芯片結(jié)果的準確性,隨機選擇了13個有顯著差異表達的miRNAs,通過qRT-PCR進行驗證。結(jié)果顯示,miR-4449、miR-199b-5p、miR-30c-1-3p、miR-4497、miR-31-5p、miR-1973和mir -3178均顯著上調(diào)(P<0.05),miR-4482-3p、miR-3121-5p、miR-335-5p和miR-370-3p顯著下調(diào)(P<0.05);miR-3195和miR-711比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,圖3B)。這些結(jié)果表明,上述13個驗證的miRNAs在芯片和qRT-PCR的結(jié)果基本一致。由于差異表達的miRNAs數(shù)量較多,選擇上述13個經(jīng)驗證的顯著表達的miRNAs進行靶基因預測,共得到438個重疊靶基因(圖3C)。

圖3 miRNA芯片的檢測結(jié)果及驗證

表1 分化前后的SHED-Exo的下調(diào)miRNAs(下調(diào)<0.2倍)

表2 分化前后的SHED-Exo的上調(diào)miRNAs(上調(diào)>5倍)

4.生物信息學分析:為了進一步獲得與上述miRNA相關(guān)的靶基因的生物學信息,筆者進行GO和KEGG分析。通過KEEG通路分析上述miRNAs最可能調(diào)控的前10條信號通路為FoxO信號通路、Ras信號通路、Hippo信號通路、基底細胞癌和MAPK信號通路等。GO分析后得到的靶基因主要富集在多細胞生物發(fā)育、單細胞生物等生物學過程中;細胞成分主要受細胞部分、面上泡和囊泡等影響;主要分子功能指標包括鈣離子結(jié)合、淀粉樣蛋白結(jié)合、蛋白轉(zhuǎn)運體活性以及MAP激酶酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸磷酸酶活性等 (圖4)。

圖4 差異表達miRNA的靶基因的功能分析

討 論

隨著細胞生物學和口腔醫(yī)學的發(fā)展,牙源性干細胞越來越受到人們的關(guān)注,主要是由于從新鮮拔牙中分離的細胞具有低免疫原性,可以在臨床上高度利用[8]。近年來,大多數(shù)研究主要集中在恒牙牙髓干細胞體外培養(yǎng)后一些生物學行為的變化,而對更容易獲得的SHED在礦化后生物學特性的研究報道較少[9]。由于外泌體具有作為遞質(zhì)將信號分子傳遞給受體細胞,能改變其生物學功能的作用,從而引起國內(nèi)外研究者的重視。外泌體具有精準且高效的作用機制,并且其易于保存,在外泌體攜帶的眾多生物分子中,miRNAs可以調(diào)控基因表達[10]。因而exosome-miRNA的靶向治療技術(shù)具有極高的轉(zhuǎn)化應用前景。

盡管已有研究揭示了牙源性干細胞分化過程中存在一些具有調(diào)控功能的miRNAs,但仍有許多miRNAs及其調(diào)控的靶基因未被發(fā)現(xiàn)[11,12]。本研究中,通過miRNA芯片檢測,在未分化和分化的SHED-Exo中共鑒定了215個差異表達的miRNAs。在這些miRNA中,有13個被qPCR驗證并進行生物信息學分析。分化前后的SHED-Exo下調(diào)最顯著的miRNA是miR-335-5p,目前對miR-335-5p的研究顯示出它和成骨分化具有相關(guān)性。例如,Zhao等[13]在體外證實,miR-335-5p的過表達可能是骨髓干細胞(BMSCs)生物學中的一個關(guān)鍵調(diào)控因素,主要是通過下調(diào)WNT信號通路抑制劑Dickkopf相關(guān)蛋白1 (DKK1)來促進成骨分化。

有研究表明,牙本質(zhì)的形成過程與成骨過程相似,即成骨細胞分化和成牙本質(zhì)向分化是通過相似的過程完成的[14]。因此,可以推測miR-335-5p可能也會參與成牙本質(zhì)向分化過程,研究結(jié)果中的其他miRNAs,包括miR-370-3p和miR-199b-5p,也被發(fā)現(xiàn)參與成骨分化的過程[15, 16]。此外,生物信息學分析發(fā)現(xiàn)靶基因在FoxO信號通路、MAPK信號通路等信號通路中顯著富集,這兩個信號通路已經(jīng)被報道調(diào)控牙源性分化[17, 18]。因此,從靶點預測和功能分析結(jié)果來看,分化前后的SHED-Exo中的miRNAs可能會通過這些信號通路調(diào)控成牙本質(zhì)向分化,但還需要進一步探索。

綜上所述,本研究結(jié)果擴展了目前對SHED成牙本質(zhì)向分化過程的認識,這可能為修復性牙本質(zhì)形成提供新的見解和理論基礎(chǔ)。