邢布點(diǎn) 魏 婷 冷俊杰 張 恒 康品方 張寧汝

心房顫動(dòng)(atrial fibrillation,AF)是臨床上不規(guī)則的心房節(jié)律的一種。在各種因素干擾下,心房的正常電生理受損,除了誘發(fā)局灶性異位活動(dòng),還會(huì)造成折返的形成,引起心房興奮性異常增高,導(dǎo)致心房出現(xiàn)不同步收縮,心室不規(guī)則興奮,除造成心臟的損傷外,還會(huì)加重心臟的負(fù)荷[1,2]。就AF而言,心房纖維化與之緊密相連。如在AF患者中,心房纖維化程度是增加的[3]。AF發(fā)病通常始于陣發(fā)性發(fā)作,隨著發(fā)作次數(shù)的增加或時(shí)間持續(xù)的增加,就會(huì)演變?yōu)槌志眯虯F,即“AF誘發(fā)AF”現(xiàn)象[1]。心房纖維化介導(dǎo)心房重構(gòu),繼而促進(jìn)AF發(fā)生和進(jìn)展,而在心房重構(gòu)過程中,AF促使心房纖維化,造成惡性循環(huán)的形成,使心律失常持續(xù)存在,表明心房纖維化與AF相關(guān)[3～6]。

PI3K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,能夠結(jié)合胞內(nèi)Akt,促進(jìn)Akt的磷酸化激活進(jìn)而啟動(dòng)一系列信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)[7]。Akt被PI3K激活后,能激活其下游多種靶點(diǎn)蛋白,繼而參與機(jī)體內(nèi)各種重要的生理及病理過程。PI3K/Akt信號(hào)通路是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖等多種生物學(xué)過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,特別是在心臟疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。近年來研究發(fā)現(xiàn),PI3K/Akt信號(hào)通路在小鼠AF模型中表達(dá)是下調(diào)的,并用激活劑活化其通路,能夠減少心房纖維化的程度,進(jìn)而減少了AF的發(fā)作[8～10]。而目前該信號(hào)通路與AF患者疾病進(jìn)展、AF射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)有何關(guān)系尚未明確。因此,本研究擬通過觀察AF患者血漿以及外周血單核細(xì)胞中中磷酸化PI3K、Akt表達(dá)水平,并分析PI3K、Akt與左心房?jī)?nèi)徑(left artrial diameter,LAD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)之間的相關(guān)性,從而進(jìn)一步探討PI3K/Akt信號(hào)通路在AF患者中相關(guān)作用。

資料與方法

1.材料試劑:磷酸化PI3K抗體(貨號(hào):17366,美國(guó)CST公司)、磷酸化Akt抗體(貨號(hào):4060,美國(guó)CST公司)和β-actin抗體(貨號(hào):8457,美國(guó)CST公司);ELISA檢測(cè)試劑盒:HumanPI3K(貨號(hào):YX-160914H,上海羽朵生物科技有限公司)、Akt(貨號(hào):YX-011120H,上海羽朵生物科技有限公司)

2.研究對(duì)象:選取2019年1月～2020年11月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院住院確診且首次接受射頻消融術(shù)的AF患者,嚴(yán)格按照入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)納入145例為實(shí)驗(yàn)組。入選標(biāo)準(zhǔn):本研究中選取的AF類型為持續(xù)性AF,其定義為持續(xù)超過7天的AF發(fā)作,其包括7天后因藥物或電復(fù)律而終止發(fā)作的AF或AF的持續(xù)時(shí)間為12個(gè)月以上。對(duì)照組選用同時(shí)期至筆者醫(yī)院體檢者120例。所有研究對(duì)象入組時(shí)均排除嚴(yán)重心血管疾病如合并有急性心肌梗死、風(fēng)濕性心臟病、先天性心臟病、心臟瓣膜病,肝腎功能不全,腫瘤,精神疾病患者等。入選患者均簽署知情同意書,研究方案獲得筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號(hào): 2019KY023)。

3.方法:(1)樣本準(zhǔn)備:留取實(shí)驗(yàn)組術(shù)前及對(duì)照組外周靜脈血10ml,置于肝素鈉抗凝試管中,2h內(nèi)以3000r/min離心15min,取離心后的上層血漿保存至-80℃冰箱。(2)PBMCs的分離:在取完上層血漿的標(biāo)本中加入PBS至總體積14ml,混勻后加入14ml的淋巴分離液,2000r/min離心20min,取PBMC層的細(xì)胞,用PBS重懸細(xì)胞,1500r/min離心15min,棄上清,加入配置好的凍存液,轉(zhuǎn)移至凍存管中保存至-80℃冰箱。(3)ELISA法檢測(cè)所有受試者血漿中PI3K、Akt水平:所有標(biāo)本中PI3K、Akt濃度嚴(yán)格按照ELISA說明書進(jìn)行檢測(cè),在酶標(biāo)儀上讀取450nm處吸光值,根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血漿中PI3K、Akt水平。(4)Western blot法檢測(cè)PI3K/Akt信號(hào)通路在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的磷酸化PI3K、Akt蛋白的表達(dá):收集的外周靜脈血加入裂解液,提取PBMCs中總蛋白,依據(jù)BCA蛋白定量法說明書,測(cè)定各組蛋白濃度,配置10%SDS-PAGE電泳,PVDF膜轉(zhuǎn)膜;脫脂牛奶常溫封閉;一抗室溫孵育4h(或4℃過夜);TBST洗滌3次,10分/次;二抗孵育2h;TBST洗滌3次,10分/次;洗膜后ECL發(fā)光液曝光,凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。(5)臨床隨訪:隨訪檢查主要包括體表心電圖或動(dòng)態(tài)心電圖以及心臟彩超指標(biāo),相關(guān)心電圖記錄AF有無復(fù)發(fā)。AF復(fù)發(fā)定義:心電圖檢查出現(xiàn)至少30s的AF/心房撲動(dòng)/心房快速心律失常復(fù)發(fā)。

結(jié) 果

1.受試者臨床資料比較:除基本資料,受試者在肝腎功能等生化指標(biāo)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),受試者LAD、LVEF、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter,LVDd)以及左心室短軸縮短率(shortening rate of left ventricular short axis,LVFS)比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表1)。

表1 兩組臨床基線資料比較

2.各組受試者血漿中PI3K、Akt的表達(dá)含量的比較: ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,實(shí)驗(yàn)組血漿中PI3K、Akt表達(dá)水平低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。

表2 兩組PBMC中PI3K、Akt水平比較

3.兩組PBMCs中磷酸化PI3K以及Akt蛋白表達(dá)水平:實(shí)驗(yàn)組磷酸化PI3K(0.51±0.07mU/L)、AktBMI.體重指數(shù);RBC.紅細(xì)胞計(jì)數(shù);WBC.白細(xì)胞計(jì)數(shù);ALT.谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;AST.天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶;HDL.高密度脂蛋白;LDL.低密度脂蛋白;Scr.血肌酐;LAD.左心房前后徑;LVDd.左心室舒張末期內(nèi)徑;LVEF.左心室射血分?jǐn)?shù);LVFS.左心室短軸縮短率(0.72±0.09ng/ml)蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組磷酸化PI3K(0.97±0.18mU/L)、Akt(1.13±0.09ng/ml)呈下調(diào)趨勢(shì),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,圖1)。

圖1 兩組PBMCs中磷酸化PI3K、Akt蛋白表達(dá)水平

4.實(shí)驗(yàn)組患者血漿中PI3K、Akt與LAD、LVEF的相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示,AF患者血漿PI3K與LAD之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.549,P<0.001),Akt與LAD之間呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.641,P<0.001); PI3K與LVEF之間呈顯著正相關(guān)(r=0.565,P<0.001),Akt與LVEF之間呈顯著正相關(guān)(r=0.463,P<0.001)。

5.臨床隨訪:對(duì)術(shù)后患者進(jìn)行為期 10～12個(gè)月的隨訪,平均隨訪時(shí)間為11.21±0.42個(gè)月,共隨訪112例,失訪33例。根據(jù)是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組,比較兩組患者血漿PI3K、Akt濃度以及LAD大小。復(fù)發(fā)組血漿PI3K、Akt水平低于未復(fù)發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均< 0.001);復(fù)發(fā)組LAD高于未復(fù)發(fā)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001,表3)。對(duì)實(shí)驗(yàn)組術(shù)后患者,以是否發(fā)生復(fù)發(fā)為因變量,以表3中存在差異的變量(PI3K、Akt、LAD)為協(xié)變量,應(yīng)用二元Logistic回歸分析,顯示PI3K(OR= 1.478, 95%CI:1.098～2.021,P=0.002)、Akt(OR=1.072,95%CI:1.027～1.136,P=0.004)、LAD(OR=1.179, 95%CI:1.070～1.346,P=0.010)是AF術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表4)。

表3 導(dǎo)管射頻消融術(shù)后兩組相關(guān)指標(biāo)的比較

表4 AF術(shù)后復(fù)發(fā)多因素二元 Logistic 回歸分析

討 論

近年來AF發(fā)生率逐年上升,其機(jī)制尚未有定論,可能與沖動(dòng)傳導(dǎo)異常、心臟重構(gòu)等相關(guān)[11～14]。其中,心房重構(gòu)在AF的發(fā)病機(jī)制中的作用越來越受到研究者的認(rèn)可,其被認(rèn)為是AF發(fā)生、持續(xù)存在的重要病理基礎(chǔ)[15]。LAD常被用作評(píng)估心房重構(gòu)的重要參數(shù)[16]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),LAD是AF患者心血管事件的危險(xiǎn)因素,且隨著AF患者LAD的升高,AF的嚴(yán)重程度相應(yīng)增加,經(jīng)射頻消融術(shù)后再次復(fù)發(fā)率也越高,LAD增大可視為AF發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,這些研究表明,LAD與AF的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)[17,18]。

本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組LAD顯著高于對(duì)照組(P<0.01),進(jìn)一步佐證了心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)參與了AF發(fā)生、發(fā)展,且血漿PI3K、Akt水平分別與心房重構(gòu)指標(biāo)LAD呈一定的負(fù)相關(guān),提示其信號(hào)通路可能通過介導(dǎo)心肌纖維化的方式促使心房重構(gòu),進(jìn)而誘發(fā)了AF發(fā)生、進(jìn)展。心房纖維化是心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)的主要過程,在AF的發(fā)生和持續(xù)中起著關(guān)鍵作用[19]。Li等[20]研究發(fā)現(xiàn)了心房纖維化與AF可能存在關(guān)聯(lián)性后,這種關(guān)聯(lián)性不久便被進(jìn)一步得到了驗(yàn)證,在充血性心力衰竭犬模型中,心房纖維化的進(jìn)行性發(fā)展與房性心律失常誘發(fā)易感性的增加密切相關(guān)[21]。這表明心房纖維化過程是治療AF一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。而動(dòng)物模型進(jìn)一步表明了AF和心房纖維化之間的關(guān)聯(lián)性,如2型糖尿病小鼠模型中,心房纖維化的增加,發(fā)生AF的敏感度顯著增加[22]。AF患者體內(nèi)能檢測(cè)到心房纖維化標(biāo)志物(如TGF-β1、CTGF、Gal-3)的升高[23～25]。

PI3K是磷脂酰肌醇家族中一個(gè)重要成員,作為一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,根據(jù)其結(jié)合底物的偏好和序列同源性,可將其分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型,臨床以Ⅰ型PI3Ks研究最為廣泛。Ⅰ型 PI3Ks又被分為ⅠA類和ⅠB類,ⅠA類PI3K是調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的主要PI3K,其是由具有調(diào)節(jié)功能的亞基p85和具有催化功能的亞基p110異源二聚體的組成, 能夠特異性催化磷脂酰肌醇的三位羥基而被磷酸化, 產(chǎn)生多磷酸肌醇PIP2和PIP3, 能激活其下游的蛋白激酶B(protein kinase B,PKB),進(jìn)而募集和激活下游的靶分子啟動(dòng)一系列信號(hào)聯(lián)級(jí)反應(yīng)[26～28]。

Akt又被稱為蛋白激酶B,其被上游信號(hào)分子的PI3K的激活可以促使其發(fā)生磷酸化而被激活,進(jìn)而參與了各種生理及病理過程。PI3K(p110α)信號(hào)通路參與多種疾病,特別是心血管疾病[29]。Pretorius 等[8]在小鼠模型中發(fā)現(xiàn),敲除PI3K基因組PI3K的活性下調(diào)可引起小鼠心房纖維化,下調(diào)心房鉀通道表達(dá),增加了基因敲除組AF易感性。Xu等[30]在大鼠模型中觀察到,通過抑制PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,使得大鼠心房纖維化程度增加,進(jìn)而誘發(fā)了AF的發(fā)生。而Singhal等[9]通過實(shí)驗(yàn)表明,秋水仙堿能夠通過上調(diào)PI3K、Akt的表達(dá),進(jìn)而起到了改善心房纖維化程度,促進(jìn)復(fù)極時(shí)鉀離子外流,減少了AF發(fā)作的次數(shù)的作用。Xue等[10]在2型糖尿病小鼠模型中觀察到硫化氫能夠激活PI3K/Akt信號(hào)通路,減少小鼠心房纖維化進(jìn)而降低了AF易感性。這些實(shí)驗(yàn)表明PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過介導(dǎo)心房纖維化,進(jìn)而誘發(fā)AF的發(fā)病和進(jìn)展。

本研究發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組患者血漿PI3K、Akt水平低于對(duì)照組,提示PI3K、Akt與AF發(fā)病有關(guān)。同時(shí),本研究檢測(cè)AF患者PBMCs中PI3K/Akt信號(hào)通路的磷酸化PI3K、Akt 表達(dá)水平較對(duì)照組患者也是呈下調(diào)的趨勢(shì),提示AF的發(fā)病可能與PI3K/Akt信號(hào)通路表達(dá)下調(diào)有關(guān)。

隨著研究的深入,盡管導(dǎo)管射頻消融明顯改善了AF患者的預(yù)后,但AF復(fù)發(fā)仍很常見,其復(fù)發(fā)的機(jī)制越來越引起人們的關(guān)注,但其具體機(jī)制尚不明確。有研究表明LAD是射頻消融術(shù)后AF復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[31]。本研究Pearson相關(guān)分析提示,PI3K、Akt水平分別與心房重構(gòu)指標(biāo)LAD呈負(fù)相關(guān)。為此根據(jù)PI3K/Akt水平評(píng)估射頻消融術(shù)后AF復(fù)發(fā)尚未有定論?；诖?本研究對(duì)于接受射頻消融術(shù)后的AF患者進(jìn)行為期11.21±0.42個(gè)月的隨訪,隨訪發(fā)現(xiàn),射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)組患者LAD水平較未復(fù)發(fā)組明顯升高。同時(shí),射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)組患者血漿PI3K、Akt水平較未復(fù)發(fā)組是明顯降低的。同時(shí),本研究行二元Logistic回歸分析顯示,不僅LAD是AF術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,且PI3K、Akt同樣是AF術(shù)后復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)下調(diào)可能與射頻消融術(shù)后患者的復(fù)發(fā)有關(guān)。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路在AF患者的蛋白表達(dá)水平明顯降低的,且血漿PI3K、Akt水平分別與心房重構(gòu)指標(biāo)LAD呈一定的負(fù)相關(guān),提示其信號(hào)通路可能通過介導(dǎo)心肌纖維化的方式促使心房重構(gòu),進(jìn)而誘發(fā)了AF發(fā)生、進(jìn)展。同時(shí),對(duì)于射頻消融術(shù)后的臨床隨訪發(fā)現(xiàn),射頻消融術(shù)后患者的復(fù)發(fā)可能與PI3K/Akt信號(hào)通路的表達(dá)下調(diào)有關(guān),這為射頻消融術(shù)后復(fù)發(fā)機(jī)制研究提供了一個(gè)新的思路和見解。