文/邵彪 許晶晶 高利亭 陳剛

麻痹性貝類毒素是一類毒性很強(qiáng)且具有高發(fā)性的海洋生物毒素，目前，主要的檢測方法有小鼠生物法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法以及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。由于毒素含量通常較低，且生物體基質(zhì)干擾很大，選擇合適有效的凈化處理方法已成為分析檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文綜述了麻痹性貝類毒素分析檢測凈化處理方法及研究進(jìn)展，以期為相關(guān)從業(yè)者提供參考。

一、引言

麻痹性貝類毒素（Paralytic shellfish poisoning，PSP）是在赤潮發(fā)生過程時(shí)，海洋中的貝類生物攝食了亞歷山大藻、甲藻、藍(lán)藻等有毒藻類，經(jīng)過生物體內(nèi)蓄積、放大和轉(zhuǎn)化而形成的一類毒素，因誤食含有此類毒素的貝類后會(huì)產(chǎn)生麻痹性中毒現(xiàn)象而得名。PSP種類繁多，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)50多種，基本結(jié)構(gòu)為含有2個(gè)胍基的多疊六元環(huán)，結(jié)構(gòu)式見圖1。

圖1 PSP化學(xué)結(jié)構(gòu)式

不同PSP的差別主要是R1、R2、R3、R4取代基團(tuán)的差異，根據(jù)基團(tuán)的相似性可分為四類：（1）氨基甲酸酯類毒素，包括石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）、新石房蛤毒素（Neosaxitoxin，NEO）、膝溝藻毒素（Gonyautoxin，GTX，包括GTX1、GTX2、GTX3和GTX4）；（2）N-磺酰氨甲?；惗舅兀∟-sulfocarbamoyl toxins），包括C1、C2、C3、C4、GTX5（B1）和GTX6（B2）；（3）脫氨甲?；惗舅?，包括Decarbamoyl saxitoxin（dcSTX）、Decarbamoyl neosaxitoxin（dcneoSTX）和Decarbamoyl gonyautoxins1-4（dcGTX1-4）；（4）脫氧脫氨甲?；惗舅兀―eoxydecarbamoyl toxins）。研究表明，PSP毒性強(qiáng)烈，能夠抑制神經(jīng)的傳導(dǎo)，人體的中毒劑量為600MU～5000MU，致死量為3000MU～30000MU，目前還沒有有效的解毒方法，全球每年因麻痹性貝類毒素而引發(fā)的中毒事件約2000起，具有廣布性和高發(fā)性等特點(diǎn)。因此，國內(nèi)外均進(jìn)行了嚴(yán)格管控，并以石房蛤毒素為指標(biāo)制定了限量標(biāo)準(zhǔn)。世界衛(wèi)生組織（WHO）規(guī)定100g貝類可食部分的PSP限量為80μg STX eq/100g，我國現(xiàn)行的GB2733-2015《鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定PSP最大限量為4MU/g，兩者數(shù)值基本一致。

二、現(xiàn)有檢測技術(shù)特點(diǎn)

為了有效檢測麻痹性貝類毒素，國內(nèi)外學(xué)者研究開發(fā)了多種分析方法，其中，最主要的有小鼠生物法、酶聯(lián)免疫法、液相色譜法以及液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法，目前，這四種方法均已列入我國現(xiàn)行的檢測標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.213-2016中。

小鼠生物檢測法（Mouse bioassay，MBA）是全球范圍廣泛使用的經(jīng)典方法，通過觀測小鼠腹腔注射待測樣品提取液后的死亡時(shí)間，并根據(jù)麻痹性貝類毒素致小鼠死亡時(shí)間與鼠單位關(guān)系的對照表以及小鼠體重校正系數(shù)，獲取樣品中PSP的鼠單位，也可用石房蛤毒素作為標(biāo)準(zhǔn)換算成毒素的質(zhì)量數(shù)。該方法直接反應(yīng)麻痹性貝類毒素毒性總量，前處理簡單，僅需用酸性提取液均質(zhì)浸提，加熱煮沸，采用自然沉降、過濾或低速離心的方式獲取上清液即可。但該方法不具特異性，無法確定毒素的成分和結(jié)構(gòu)，同時(shí)受小鼠個(gè)體差異影響不確定因素較多，存在靈敏度低、重現(xiàn)性差、易出現(xiàn)假陽性等問題，此外，由于涉及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及實(shí)驗(yàn)室許可資質(zhì)的因素，限制了其在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的使用。

酶聯(lián)免疫法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）是基于抗原抗體之間特異性反應(yīng)，通過酶標(biāo)物與酶反應(yīng)底物發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶聯(lián)免疫法分析過程僅需使用酶標(biāo)儀，無需使用復(fù)雜的儀器分析，因此，其前處理同小鼠生物法類似，僅需對樣品中PSP進(jìn)行有效提取，無需對樣品進(jìn)行凈化處理。酶聯(lián)免疫法操作簡單，但存在現(xiàn)有商品化抗體種類僅覆蓋少數(shù)的幾種毒素、特異性低、易發(fā)生交叉反應(yīng)等問題。

以液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法為代表的儀器法可以在具備標(biāo)準(zhǔn)品的前提下針對具體毒素種類進(jìn)行定性、定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。然而，由于麻痹性貝類毒素種類多、結(jié)構(gòu)相近、性質(zhì)相似而液相色譜法是以保留時(shí)間定性，給實(shí)際分析造成很大困難，不少毒素成分很難實(shí)現(xiàn)有效分離。液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法是以質(zhì)譜定性，通過對化合物離子碎片進(jìn)行定性及定量檢測，對色譜分離效果要求不高，不僅在定性上更加精準(zhǔn)，而且串聯(lián)質(zhì)譜能夠很大程度降低干擾，帶來更高的靈敏度。因此，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法逐漸成為麻痹性貝類毒素分析檢測優(yōu)選的方案。

三、液質(zhì)聯(lián)用法前處理技術(shù)

貝類等海洋動(dòng)物生物體基質(zhì)復(fù)雜，含有大量的蛋白質(zhì)、脂肪等成分，這些成分不僅干擾目標(biāo)物測定，而且還會(huì)對色譜柱、離子源造成污染，影響色譜分離和質(zhì)譜信號，因此，合適有效的凈化處理方法成為分析檢測的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。麻痹性貝類毒素具有極性強(qiáng)、易溶于水、酸性穩(wěn)定以及熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)，主要采取的提取方式是利用甲酸、乙酸、鹽酸、乙腈-酸性水溶液等進(jìn)行提取，輔以超聲波、加熱、超濾、有機(jī)溶劑處理等手段增強(qiáng)提取效果并去除蛋白、脂類等干擾物。同時(shí)，在進(jìn)入液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀分析之前，通常還會(huì)采用固相萃取等凈化處理方法進(jìn)一步排除干擾。

根據(jù)現(xiàn)有報(bào)道，固相萃取所涉及的凈化柱的類型廣泛，包括HLB固相萃取、C18固相萃取、石墨化炭黑固相萃取、免疫親和固相萃取、MCX固相萃取等，此外分散固相萃取QuEChERS技術(shù)也已見使用。這些技術(shù)的使用為麻痹性貝類毒素有效檢測提供了參考和指導(dǎo)。

（一）HLB固相萃取柱凈化

HLB固相萃取柱是親水親脂平衡柱，填料含有特定比例的親水基N-乙烯基吡咯烷酮結(jié)構(gòu)和疏水基二乙烯基苯結(jié)構(gòu)，可以分別保留極性化合物和非極性化合物。PSP作為極性化合物，能夠被HLB固相萃取柱吸附并得到廣泛應(yīng)用。

有研究采用0.5%甲酸溶液加熱提取，經(jīng)乙酸乙酯、三氯甲烷和HLB固相萃取柱凈化，乙腈去蛋白后，建立了GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、dcSTX、neoSTX、STX等10種麻痹性貝類毒素（PSP）的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。在50μg/kg～600μg/kg添加水平下，10種麻痹性貝類毒素平均回收率為72.3%～91.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.9%～9.5%，STX、dcSTX、neoSTX定量限為100μg/kg，GTX1～GTX5、dcGTX2和dcGTX3的定量限為50.0μg/kg。另有研究以0.1mol/L乙酸提取，HLB固相萃取小柱凈化，10000MW超濾，建立了貝類產(chǎn)品中STX、neoSTX、GTX1＆4、dcSTX、dcneoSTX、dcGTX2＆3等8種麻痹性貝類毒素的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定方法，8種麻痹性貝類毒素的定量限為10μg/kg～50μg/kg，平均加標(biāo)回收率為75.5%～103.0%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～13.2%。有學(xué)者采用含0.1%乙腈-水溶液（80:20，v/v），HLB固相萃取小柱凈化，建立了同時(shí)定量分析雙殼類軟體動(dòng)物中的12種麻痹性貝類毒素（STX、NEO、dcSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、C1、C2、dcGTX2和dcGTX3）的超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）方法。

（二）C18固相萃取柱凈化

C18固相萃取柱是以十八烷基硅膠為填料，通過強(qiáng)疏水作用保留非極性化合物，在食品安全、環(huán)境等檢測領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。C18固相萃取柱對PSP無保留，而是通過吸附提取液中雜質(zhì)，實(shí)現(xiàn)對樣品的凈化目的。

有研究采用0.1N鹽酸提取，并利用C18固相萃取柱進(jìn)行凈化，建立了貝類和被膜動(dòng)物中STX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，平均回收率為82.7%～110.7%，日內(nèi)精密度為0.3%～10.9%，日間精密度為0.8%～10.0%，定量限為25μg/kg～100μg/kg。有學(xué)者采用0.2mol/L的乙酸水溶液對貝類組織中PSP進(jìn)行提取，C18固相萃取柱凈化，以Atlantis HILIC Silica色譜柱為分析色譜柱，以2mmol/L甲酸銨（含0.1%甲酸）和乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，質(zhì)譜采用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），4種麻痹性貝類毒素在濃度10ng/mL～100ng/mL內(nèi)線性關(guān)系良好，STX、dcSTX、GTX1＆4、GTX2＆3的方法檢出限（LOD）為1.1μg/kg、1.8μg/kg、2.5μg/kg、2.3μg/kg，平均加標(biāo)回收率在85.6%～95.4%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于5%。

（三）石墨化炭黑固相萃取柱凈化

石墨化炭黑固相萃取柱對平面分子或者含有平面芳香環(huán)的分子具有極強(qiáng)的吸附作用，且呈正電性，具備反相和離子交換雙重保留機(jī)制，既能保留非極性化合物，也能保留強(qiáng)極性化合物。

為了減少基質(zhì)效應(yīng)，有研究用乙酸水溶液提取貝類中的PSTs，經(jīng)乙酸乙酯除雜，然后用石墨化碳黑固相萃取柱凈化，13種PSTs的線性方程相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.998，定量限為2μg/kg～20μg/kg，貽貝基質(zhì)、牡蠣基質(zhì)、扇貝基質(zhì)的平均回收率為92.2%～122%、106%～129%、107%～144%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于11%。有學(xué)者用0.5%乙酸水提取，石墨化碳黑固相萃取柱凈化，采用高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法分析了7種雙殼貝類508份樣品中的STX、neoSTX、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcSTX、dcGTX2、dcGTX3，經(jīng)驗(yàn)證，GTX1、GTX2、dcGTX2檢出限分別為64.0μg/kg、48.0μg/kg、68.0μg/kg，其余PSP檢出限均為20.0μg/kg，方法回收率為71.6%～116.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.7%～16.3%。有研究以乙酸水溶液提取，石墨化碳黑固相萃取凈化，液相色譜—四極桿/線性離子阱復(fù)合質(zhì)譜分析，建立了雙殼貝類中13種麻痹性貝類毒素（STX、NEO、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3、C1、C2）的定性確證和定量分析方法，基質(zhì)加標(biāo)平均回收率為（79.6±10.4）%～（98.8±6.54）%。還有學(xué)者利用1%乙酸水溶液提取，選擇離子對固相萃取柱石墨化碳黑固相萃取柱凈化，以十三氟庚酸作為揮發(fā)性離子對試劑，開發(fā)了雙殼類樣品中GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、GTX6、dcGTX2、dcGTX3、C1、C210種麻痹性貝類毒素和河豚毒素的同時(shí)檢測技術(shù)，其中10種PSP的檢測限和定量限分別為0.09μg/kg～13.0μg/kg和0.26μg/kg～39.4μg/kg，平均回收率為75.7%～96.2%，三個(gè)水平的加標(biāo)所測相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于16%。

（四）免疫親和柱凈化

免疫親和柱凈化技術(shù)原理是通過抗原和抗體之間的特異性結(jié)合實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的吸附，具有凈化效果好、無基質(zhì)效應(yīng)的特點(diǎn)，特別適用于微量成分的處理。針對不同種類樣品無需基質(zhì)匹配，更適宜于超痕量目標(biāo)化合物的檢測。

有學(xué)者制備了抗PSP單克隆抗體免疫親和柱，用于純化PSP貝毒GTX2,3，實(shí)現(xiàn)將麻痹性貝毒的GTX2,3與GTX1,4分離。有的研究中利用純化的STX單克隆抗體與瓊脂糖凝膠（sepharose 4B）制備了STX免疫親和柱，采用11種麻痹性貝類毒素標(biāo)液進(jìn)行過柱實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明STX免疫親和柱對STX、GTX5、dcSTX、GTX3有較好的吸附效果，回收率均在61.2%～99.0%，能夠滿足樣品檢測前處理的要求。同時(shí)，利用磷酸鹽緩沖液（PBS）提取雙殼類中的STX并運(yùn)用STX免疫親和柱凈化，建立了基于免疫親和作用機(jī)理的SPE凈化的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測雙殼類水產(chǎn)品中STX的方法。STX在2.468μg/kg～246.8μg/kg內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r大于0.999?；厥章蕿?9.3%～102.9%，方法選擇性好，消除了基質(zhì)效應(yīng)，無需基質(zhì)匹配，可滿足雙殼類水產(chǎn)品中痕量STX的檢測要求。

（五）MCX固相萃取柱凈化

MCX固相萃取柱所用凈化填料為混合型強(qiáng)陽離子交換吸附劑，具有反相和陽離子交換雙重保留性能，對堿性化合物有良好的保留能力。

有學(xué)者建立了一種液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法，可以同時(shí)測定貝類產(chǎn)品中GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、dcGTX2、dcGTX3、dcNEO8種麻痹性貝類毒素。樣品經(jīng)乙腈除蛋白后用1%三氯乙酸提取，提取液經(jīng)正己烷脫脂，MCX固相萃取凈化后，采用液相色譜進(jìn)行分離，以選擇反應(yīng)監(jiān)測（SRM）正離子模式進(jìn)行質(zhì)譜分析，8種麻痹性貝類毒素的定量限為100μg/kg～450μg/kg。以標(biāo)準(zhǔn)加入法計(jì)算回收率，在100μg/kg～300μg/kg平均回收率為76.3%～95.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.3%～13.2%。

（六）QuEChERS凈化處理

QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe）是近年興起并快速得到應(yīng)用推廣的一種前處理方法，其本質(zhì)是分散固相萃取，原理與固相萃取相似，借助吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，達(dá)到除雜凈化的目的，具有處理速度快、操作簡單、價(jià)格便宜、回收率高、穩(wěn)定性好、安全風(fēng)險(xiǎn)低等優(yōu)勢，在農(nóng)產(chǎn)品等檢測領(lǐng)域被廣泛使用。

有學(xué)者采用含0.1%甲酸的乙腈/水（90:10，v/v）提取，并用HLB和石墨化炭黑作為QuEChERS吸附劑進(jìn)行凈化，建立了海產(chǎn)品中的10種麻痹性貝類毒素HILIC-MS/MS檢測方法，在8.1μg/kg～225.5μg/kg內(nèi)對毒素進(jìn)行三種水平的加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，平均回收率為71.3%～104.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差低于15.8%，檢測限低于170μg/kg。Mattarozzi等提出了一種快速、簡單的QuEChERS樣品處理方法，樣品用0.1%甲酸提取，利用ABS Elut NEXUS（包含硫酸鎂、PSA、C18等吸附劑）凈化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)現(xiàn)了對STX、NEO、GTX1、GTX2、GTX3、GTX4、GTX5、C1、C2、dcSTX、dcNEO、dcGTX2、dcGTX3的檢測，兩個(gè)水平的加標(biāo)回收率在79%～113%，相對偏差小于7%。

麻痹性貝類毒素檢測的幾種方法中，小鼠生物法、酶聯(lián)免疫法對于樣品前處理要求不高，所以采用凈化處理手段較為簡單，但如前文所述，這兩種方法因自身特點(diǎn)在實(shí)際使用中受到較大限制。而以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用為代表儀器法則需要提取后采用凈化處理手段，盡可能排除基質(zhì)干擾，同時(shí)保護(hù)色譜柱及質(zhì)譜系統(tǒng)。本文對現(xiàn)有主要固相凈化處理方式進(jìn)行了簡要概述，隨著新材料的開發(fā)以及新技術(shù)的應(yīng)用，石墨烯、分子印跡聚合物等凈化處理填料和技術(shù)可望用于麻痹性貝類毒素檢測前處理。