任騰竹, 李桂花, 梁肖玉, 郭琳玲, 劉新通

帕金森病(Parkinson′s disease,PD)是臨床常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病,其中抑郁為PD最常見(jiàn)的非運(yùn)動(dòng)癥狀之一。腸道菌群及其代謝產(chǎn)物與PD和抑郁癥的發(fā)生、發(fā)展具有關(guān)聯(lián)性。對(duì)散發(fā)PD患者的尸檢發(fā)現(xiàn),α-突觸核蛋白(α-synuclein,α-syn)最早出現(xiàn)在腸道神經(jīng)系統(tǒng)和迷走神經(jīng)運(yùn)動(dòng)背核,提示PD發(fā)病可能起源于胃腸道[1]。迷走神經(jīng)是腦-腸軸神經(jīng)解剖的基礎(chǔ),可將腸道的各種信號(hào)傳遞至大腦,影響5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)的釋放,實(shí)現(xiàn)對(duì)腦部高級(jí)活動(dòng)、精神行為、認(rèn)知功能的調(diào)控,提示腸道菌群可能通過(guò)神經(jīng)內(nèi)分泌等途徑參與抑郁癥的發(fā)病過(guò)程[2]。目前,國(guó)內(nèi)PD伴抑郁(Parkinson′s disease and depression,DPD)患者腸道菌群特征的研究報(bào)道尚鮮見(jiàn)。鑒此,本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)受試者腸道菌群進(jìn)行分析,旨在探究DPD患者的特征性腸道菌群及差異代謝通路,以進(jìn)一步明確DPD的發(fā)病機(jī)制,為DPD的無(wú)創(chuàng)性診斷和治療提供新的證據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象 選擇2021年6月至2022年10月廣東省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科收治的原發(fā)性PD患者95例,均符合2015年國(guó)際運(yùn)動(dòng)障礙協(xié)會(huì)(Movement Disorder Society,MDS)制訂的原發(fā)性PD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。根據(jù)第4版《精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》中關(guān)于抑郁障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]分為DPD組(48例)和帕金森不伴抑郁組(NDPD組,47例)。DPD組漢密頓抑郁量表(Hamilton Depression Scale,HAMD)評(píng)分≥7分。選入PD患者的健康配偶43名作為對(duì)照組,符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)學(xué)會(huì)建議的健康人標(biāo)準(zhǔn)[5]。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)因血管性、藥物、中毒、外傷等原因所致的PD患者;(2)原發(fā)性震顫、進(jìn)行性核上性麻痹、多系統(tǒng)萎縮、皮質(zhì)基底節(jié)變性等帕金森疊加綜合征患者;(3)有腦卒中、癡呆、其他精神疾病及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性患者。研究對(duì)象均來(lái)自廣東省及周邊地區(qū),飲食結(jié)構(gòu)相似,均衡飲食(無(wú)素食主義者),無(wú)種族差異。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2021-KZ-049-03),所有研究對(duì)象簽署知情同意書(shū)。

1.2量表評(píng)分 所有受試者完成日常生活活動(dòng)能力(Activity of Daily Living,ADL)量表評(píng)分及簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查(Mini-mental State Examination,MMSE),需具有日常生活自理能力且無(wú)認(rèn)知功能障礙(MMSE評(píng)分要求:教育年限<6年者,≥19分;教育年限為7～12年者,≥22分;教育年限超過(guò)12年者,≥24分)[6]。PD患者完成MDS統(tǒng)一帕金森病評(píng)分量表的第3部分(MDS Unified-Parkinson Disease Rating Scale-Ⅲ,MDS-UPDRS-Ⅲ)評(píng)分,Hoehn-Yahr分級(jí)量表(Hoehn and Yahr scale,H-Y)評(píng)分和PD患者生活質(zhì)量問(wèn)卷(the 39-Item Parkinson′s Disease Questionnaire,PDQ-39)評(píng)分。

1.3糞便標(biāo)本采集、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序 采集研究對(duì)象新鮮、中后段、內(nèi)部糞便,避免廁所污水及馬桶上微生物的污染,收集于含有保存液的、專用的無(wú)菌微生物DNA采集保存管中。樣本采集量≥2 g,采集完成24 h內(nèi)放入-80 ℃冰箱凍存?zhèn)錂z。本研究采用細(xì)菌16SrDNA V3-V4區(qū)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化的PCR產(chǎn)物通過(guò)PCR的方法添加測(cè)序需要的接頭和barcode,產(chǎn)物采用凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化。純化的PCR產(chǎn)物采用qPCR進(jìn)行定量后按照等摩爾比進(jìn)行混合,完成文庫(kù)構(gòu)建,應(yīng)用Illumina MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序由微基生物科技(上海)有限公司完成。

1.4生物信息學(xué)分析 使用Mothur軟件在97%相似水平下對(duì)所有序列進(jìn)行可操作分類單元(operational taxonomic units,OTUs)歸類。α及β多樣性分析是基于OTUs的計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)。α多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的多樣性,是反映豐富度和均勻度的綜合指標(biāo)。β多樣性是指沿環(huán)境梯度不同生境群落之間物種組成的差異性。α和β多樣性分析使用Mothur、QIIME和R軟件等進(jìn)行分析。以Bray-Curtis距離矩陣和UniFrac分析來(lái)展示不同樣本之間的β多樣性差異。其中weighted考慮物種的豐度,unweighted沒(méi)有對(duì)物種豐度進(jìn)行加權(quán)處理。組間多樣性差異的顯著性由ANOSIM檢驗(yàn)來(lái)確定,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。在獲知組間主要差異物種的基礎(chǔ)上,利用Lefse(LDA effect size)軟件進(jìn)行線性判別分析(linear discriminant analysis,LDA),對(duì)數(shù)據(jù)降維和評(píng)估顯著差異物種的影響力(LDA分值>2)。通過(guò)拷貝數(shù)對(duì)OTUs表進(jìn)行歸一化,并使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì),對(duì)菌群代謝功能進(jìn)行PICRUSt2代謝功能分析。通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法得到對(duì)照組、DPD組和NDPD組間KEGG第三層級(jí)的、顯著差異的代謝途徑。在此基礎(chǔ)上對(duì)三組相對(duì)豐度均值求和后,對(duì)相對(duì)豐度最高的前20個(gè)代謝通路進(jìn)行排序。

2 結(jié)果

2.1三組一般臨床資料比較 三組體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、MMSE評(píng)分、HAMD評(píng)分比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 三組一般臨床資料比較

2.2三組腸道菌群多樣性比較 與對(duì)照組相比,DPD組和NDPD組的菌群α多樣性顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖1??；贐ray-Curtis距離矩陣的β多樣性分析結(jié)果顯示,DPD組和NDPD組在屬水平上的腸道菌群構(gòu)成差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(ANOSIM test:R=0.111,P=0.022)。見(jiàn)圖1?。基于UniFrac分析的Weighted-UniFrac β多樣性分析結(jié)果顯示,DPD組和NDPD組的腸道菌群構(gòu)成存在顯著差異(ANOSIM test:R=0.084,P=0.036)。見(jiàn)圖1?。結(jié)果提示三組間腸道菌群的菌種豐度及構(gòu)成存在差異。

2.3三組腸道菌群構(gòu)成比及菌屬差異比較 DPD組放線菌門(Actinobacteria)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)豐度較對(duì)照組和NDPD組增加,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.006;P=0.018),但與NDPD組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.466;P=0.987)。見(jiàn)圖1?。進(jìn)一步的LDA結(jié)果顯示,放線菌門、互養(yǎng)菌門為DPD組門水平的差異性菌群。紅蝽菌目(Coriobacteriales)、互養(yǎng)菌目(Synergistales)為DPD組目水平的差異性菌群;理研菌科(Rikenellaceae)、紅蝽菌科(Coriobacteriaceae)、互養(yǎng)菌科(Synergistaceae)為DPD組科水平的差異性菌群。DPD組差異菌屬包括:另枝菌屬(Alistipes)、Anaerotruncus屬、Dielma屬、霍爾德曼氏菌屬(Holdemania)、芽胞桿菌屬(Cloacibacillus)、柯林斯氏菌屬(Collinsella)。見(jiàn)圖1?,表2。NDPD組差異菌屬包括:瘤胃菌屬(Ruminococcus);Adlercreutzia屬;Christensenella屬、Barnesiella屬、Coprococcus屬、Butyricimonas屬、Anaerofilum屬、Odoribacter屬、Fusicatenibacter屬、乳桿菌屬(Lactobacillus)。見(jiàn)圖1?。

?三組α多樣性指數(shù)比較;?在OTU水平上,三組基于Bray-Curtis距離矩陣的β多樣性分析結(jié)果;?在OTU水平上,三組基于Weighted-UniFrac的β多樣性分析結(jié)果;?三組在門水平上的菌群相對(duì)豐度;?三組特征性腸道菌群LDA值分布的直方圖

表2 DPD組差異性菌屬在三組間的相對(duì)豐度比較結(jié)果

2.4DPD組差異性菌屬相對(duì)豐度與抑郁評(píng)分的相關(guān)性分析結(jié)果 Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果顯示,另枝菌屬、Anaerotruncus屬、Dielma屬、霍爾德曼氏菌屬、芽胞桿菌屬、柯林斯氏菌屬的相對(duì)豐度與HAMD評(píng)分呈正相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3 DPD組差異性菌屬相對(duì)豐度與HAMD評(píng)分的Spearman秩相關(guān)性分析結(jié)果

2.5DPD患者差異性腸道菌群的功能分析結(jié)果 通過(guò)PICRUSt2分析DPD患者差異性腸道菌群的代謝功能,通過(guò)Kruskal-Wallis檢驗(yàn)方法獲得第三層級(jí)排名前20的顯著差異通路。結(jié)果顯示,DPD組差異性腸道菌群的顯著代謝通路包括:光合生物中的碳固定(DPD組 vs NDPD組,P=0.005;DPD組 vs 對(duì)照組,P=0.033;NDPD組 vs 對(duì)照組,P=0.534)和抗壞血酸抵抗(DPD組 vs NDPD組,P=0.019;DPD組 vs 對(duì)照組,P=0.431;NDPD組 vs 對(duì)照組,P=0.098)。NDPD組顯著代謝通路包括:細(xì)菌雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、丙酮酸鹽代謝、細(xì)菌的聚量效應(yīng)、泛酸和輔酶A生物合成、纈氨酸生物合成、亮氨酸和異亮氨酸生物合成、萬(wàn)古霉素抵抗、細(xì)菌趨藥性、胰高血糖素信號(hào)通路、凋亡通路、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化代謝通路和AMPK代謝通路。對(duì)照組顯著代謝通路包括:果糖和甘露糖代謝、脂多糖生物合成、葉酸生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸內(nèi)酯相互轉(zhuǎn)化、維生素B6代謝通路、生物堿代謝通路。見(jiàn)圖2。

圖2 顯著差異通路結(jié)果圖(top 20,*P<0.05)

3 討論

3.1PD患者的DPD發(fā)病率高達(dá)50%,多發(fā)生于PD的早期階段,對(duì)患者生活、認(rèn)知和社會(huì)功能造成嚴(yán)重影響[7]。研究發(fā)現(xiàn)腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物可啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答,增強(qiáng)α-syn的炎癥作用,并誘導(dǎo)α-syn的聚集和錯(cuò)誤折疊,導(dǎo)致多巴胺(dopamine,DA)神經(jīng)元凋亡[8]。DPD的發(fā)生可能與PD本身發(fā)病機(jī)制相關(guān),DPD患者黑質(zhì)致密部中DA神經(jīng)元的丟失約是NDPD患者的7倍[9]。鼠李糖乳桿菌可升高應(yīng)激小鼠海馬區(qū)等情緒相關(guān)腦區(qū)的GABA受體亞單位的表達(dá)水平,進(jìn)而減輕應(yīng)激相關(guān)的抑郁樣行為,表明腸道菌群對(duì)神經(jīng)遞質(zhì)的調(diào)控可能與抑郁癥相關(guān)[10]。單胺神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變導(dǎo)致DPD發(fā)病是目前較為公認(rèn)的觀點(diǎn),但與原發(fā)性抑郁相比,DPD更多表現(xiàn)為焦慮不安、易怒、悲傷、對(duì)未來(lái)感到悲觀、自殺念頭,而負(fù)罪感、自責(zé)、失敗感及自殺率較低。腸道菌群參與PD及抑郁癥的發(fā)病機(jī)制已有研究證實(shí),然而目前針對(duì)DPD的病因?qū)W研究尚無(wú)明確定論,且臨床實(shí)踐發(fā)現(xiàn)經(jīng)藥物治療后仍有部分患者的抑郁癥狀未得到有效緩解,并存在不同程度的副作用。

3.2隨著生物信息學(xué)技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展,通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)探究DPD患者特征性腸道菌群,為尋找DPD腸道生物標(biāo)志物、闡明發(fā)病機(jī)制及早期診斷和精準(zhǔn)治療提供了理論依據(jù)。本研究探討了DPD患者特征性腸道菌群,α多樣性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)PD患者腸道菌群的物種多樣性較健康者增加,這與既往研究一致[11]。此外,本研究證實(shí)了DPD和NDPD組之間,尤其是在屬水平上,β多樣性指數(shù)存在顯著差異。結(jié)果表明DPD患者的腸道菌群成分結(jié)構(gòu)與NDPD患者和健康人群存在差異。

3.3本研究結(jié)果顯示,在門水平上,與對(duì)照組相比,DPD組放線菌門豐度顯著增加,而擬桿菌門豐度顯著減少,這與此前有關(guān)PD[12]及抑郁癥[13-14]患者特征性腸道菌群的研究結(jié)論相同。本研究結(jié)果顯示,DPD患者紅蝽菌科的柯林斯氏菌屬豐度均顯著增多。紅蝽菌科容易定植于黏膜表面[15],在應(yīng)激反應(yīng)小鼠模型盲腸中顯著增加,與活性氧的產(chǎn)生呈正相關(guān),其致病性可能與腸道屏障和代謝功能障礙有關(guān)。丹毒絲菌科(Erysipelotrichaceae)的霍爾德曼氏菌屬在抑郁癥伴高血壓患者腸道菌群中豐度增加,并與患者的焦慮、壓力水平呈正相關(guān)[16]。丹毒絲菌科產(chǎn)丁酸菌屬與許多代謝疾病相關(guān)[17-18],這可能與其釋放的脂多糖介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)有關(guān),提示該菌可能在維持免疫平衡中發(fā)揮一定作用。本研究發(fā)現(xiàn)DPD組丹毒絲菌科中霍爾德曼氏菌屬、Dielma屬增加,與上述研究結(jié)論一致。但也有報(bào)道稱PD患者中丹毒絲菌科相對(duì)豐度減少[19]。提示Dielma屬和霍爾德曼氏菌屬可能為DPD患者的特征性腸道菌群標(biāo)志物。此外,本研究分析得出互養(yǎng)菌門、芽胞桿菌屬在DPD患者腸道菌群顯著增加。癲癇焦慮伴抑郁患者腸道菌群芽胞桿菌屬豐度增高,且隨著癲癇發(fā)作嚴(yán)重程度加重不斷升高[20]?；ヰB(yǎng)菌目在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者腸道中豐度增加,提示該菌與免疫炎癥相關(guān)[21]。

3.4本研究結(jié)果表明,另枝菌屬在DPD患者中顯著升高,與先前PD[11]及抑郁癥[13]相關(guān)研究一致。血清素是色氨酸轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物,另枝菌屬的增加會(huì)降低血清素的利用率,而血清素減少與抑郁癥發(fā)生相關(guān)[22]。然而,另枝菌屬豐度增加也可能有抗抑郁作用。腸道菌群的代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸(short chain fat acids,SCFAs)可以保持腸道上皮的完整性,調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)和免疫調(diào)節(jié)功能,降低DNA氧化損傷,降低人體炎癥水平和增強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)機(jī)能[23]。另枝菌屬是SCFAs的主要生產(chǎn)者,另枝菌屬豐度降低會(huì)導(dǎo)致SCFAs減少,加劇神經(jīng)免疫炎癥反應(yīng)[24]。另枝菌屬可表達(dá)谷氨酸脫羧酶,可將谷氨酸代謝為GABA。另枝菌屬豐度增加則GABA神經(jīng)元活性增強(qiáng),從而提升GABA神經(jīng)遞質(zhì)水平達(dá)到抗抑郁效果[25]。

3.5PICRUSt2能夠幫助研究者理解微生物功能的改變。本研究發(fā)現(xiàn),DPD組特征性腸道菌群與光合生物中的碳固定和抗壞血酸抵抗這兩條代謝通路相關(guān)。一項(xiàng)蛋白組學(xué)研究結(jié)果指出,蛋白?；@著富集在以碳代謝為特征的代謝通路中[26]。蛋白質(zhì)乙?；驯蛔C實(shí)廣泛參與枯草芽胞桿菌屬的多種生化過(guò)程,包括趨化作用、營(yíng)養(yǎng)代謝、應(yīng)激反應(yīng)和毒素合成,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝[27]。抗壞血酸作為一種還原性維生素在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中參與抗氧化、酶輔助及神經(jīng)調(diào)制等過(guò)程,臨床試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究均表明抗壞血酸具有抗抑郁作用[28]。抗壞血酸代謝途徑顯著富集于精神分裂癥患者的腸道菌群,且精神分裂癥患者腸道菌群中柯林斯氏菌屬相對(duì)豐度顯著高于健康對(duì)照組[29]。以上結(jié)果提示,DPD患者芽胞桿菌及柯林斯氏菌屬可能通過(guò)蛋白質(zhì)乙?；⒖箟难岬挚勾x途徑參與多種生物合成、代謝過(guò)程,而其與DPD的發(fā)生、發(fā)展是否具有相關(guān)性仍有待進(jìn)一步研究。

3.6近期有研究證實(shí)菌群α多樣性與體脂率呈負(fù)相關(guān),即體脂率越高,菌群α多樣性越低;瘤胃球菌與體脂率的相關(guān)性最強(qiáng)[30]。本研究中DPD組BMI較另外兩組顯著增高,而DPD組α多樣性顯著增高,但瘤胃球菌并非DPD組差異性菌屬。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究發(fā)現(xiàn)紫單胞菌科為PD伴認(rèn)知功能障礙特征性菌屬[31],而對(duì)照組紫單胞菌科豐度較其他兩組并無(wú)顯著增高。因此認(rèn)為,BMI及認(rèn)知功能評(píng)分雖存在組間差異,但對(duì)本文特征性菌群結(jié)果的影響不大。

3.7本研究納入了PD組的健康配偶作為對(duì)照組,他們擁有相似的生活環(huán)境和飲食習(xí)慣,具有較好的匹配性。但是,本研究也存在一定的局限性:(1)研究樣本均來(lái)自廣東省,限制了研究結(jié)果的廣泛適用性;(2)糞便采樣及分析僅限于單病程階段。在下一步的研究中,研究團(tuán)隊(duì)將招募更多患者,進(jìn)行亞組分析(地區(qū)、飲食結(jié)構(gòu)、病程等),并對(duì)本文得出的差異菌群展開(kāi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn),探究顯著差異代謝通路在DPD患者腸道中的相關(guān)菌群及其作用機(jī)制,為DPD的診斷和治療提供新的線索和理論依據(jù)。

綜上所述,腸道菌群結(jié)構(gòu)、特征性差異菌屬及其代謝通路的變化可能與DPD的發(fā)生、發(fā)展有關(guān),值得進(jìn)一步探索。