韋 丹, 張 菡, 尹富強(qiáng), 劉 夏

鼻咽癌是一種起源于鼻咽黏膜的上皮性癌,常見于咽隱窩[1]。鼻咽癌不同于其他頭頸部癌,它具有特定的地理分布,高發(fā)于我國(guó)和東南亞地區(qū),具有較高的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)[2]。廣西的鼻咽癌發(fā)病率和病死率位居全國(guó)前列[3]。鼻咽癌早期治療以放療為主,但常規(guī)二維放療對(duì)于晚期患者并不理想,這類患者的5年總生存率低于60%[4]。另外,傳統(tǒng)的化療藥物可產(chǎn)生耐藥,同步放化療后晚期患者5年總生存率仍不理想,僅有70%左右[2]。因此,亟需尋找新的抗腫瘤化療藥物以提高晚期患者的生存率。氧雜蒽酮類化合物是一類含氧雜環(huán)單體化合物,已有研究表明其具有良好的抗腫瘤作用[5-6]。Garcinone E是從山竹(GarciniamangostanaL.)果皮提取的一種氧雜蒽酮類單體化合物,近期研究表明其在卵巢癌中具有阻斷細(xì)胞自噬等抗腫瘤作用[7]。Garcinone C與Garcinone E均為氧雜蒽酮類天然化合物,近期有研究報(bào)道Garcinone C可以通過抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲而起到抗腫瘤的作用[8]。本研究旨在探討Garcinone E對(duì)人源鼻咽癌細(xì)胞S18的轉(zhuǎn)移、周期及自噬的影響,進(jìn)一步闡明Garcinone E的抗腫瘤機(jī)制,以期為鼻咽癌的治療提供先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑 鼻咽癌細(xì)胞株S18受贈(zèng)于中山大學(xué)腫瘤防治中心錢朝南教授,本課題組實(shí)驗(yàn)室保存使用。Garcinone E(分子式為C28H32O6)由深圳市中國(guó)科學(xué)院仙湖植物園管理處馮世秀博士從山竹(GarciniamangostanaL.)果皮中分離、提取、純化,并贈(zèng)予本課題組進(jìn)行科研用途[9]。DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購(gòu)自加拿大WISENT公司。0.25%胰蛋白酶、青霉素、鏈霉素、結(jié)晶紫溶液購(gòu)自北京索萊寶公司。CCK-8試劑盒購(gòu)自北京蘭杰柯公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司;ECL化學(xué)發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司。無基質(zhì)膠Transwell小室、含基質(zhì)膠Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司。一抗:組織金屬蛋白酶抑制劑1(tissue inhibitor of metalloproteinase 1,TIMP1),組織金屬蛋白酶抑制劑2(tissue inhibitor of metalloproteinase 2,TIMP2),基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metallopeptidase 2,MMP-2),基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metallopeptidase 9,MMP-9),細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A,p21),周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2,CDK2),周期蛋白依賴性激酶6(cyclin-dependent kinase 6,CDK6),周期蛋白依賴性激酶7(cyclin-dependent kinase 7,CDK7),細(xì)胞周期蛋白B1(cyclin B1),微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 β(microtubule-associated protein 1 light chain 3 beta,LC3B),泛素結(jié)合蛋白p62(ubiquitin-binding proteinp62,SQSTM1/p62),芐氯素1(beclin-1),自噬相關(guān)蛋白3(autophagy-related 3,Atg3),均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(anti-rabbit IgG),辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗(anti-mouse IgG)均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司。內(nèi)參蛋白抗體:甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),微管蛋白β(microtubulin beta,β-tubulin)均購(gòu)自杭州弗德公司。

1.2主要儀器 熒光倒置顯微鏡(日本,Olympus公司,型號(hào):BX53),恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó),Thermo Fisher Scientific公司,型號(hào):3111),低溫高速離心機(jī)(德國(guó),Eppendorf公司,型號(hào):5424R),全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(美國(guó),Thermo Scientific公司,型號(hào):Multiskan GO),BD電泳儀(美國(guó),Bio Rad公司,型號(hào):PowerPac Basic),化學(xué)發(fā)光成像儀(中國(guó)賽智創(chuàng)業(yè)公司,型號(hào):MiniChemi 610 Plus)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng) S18細(xì)胞使用含有10%FBS和1%的青霉素和鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的飽和濕度恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞長(zhǎng)到75%～85%匯合度時(shí)進(jìn)行傳代。

1.4細(xì)胞活力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的S18細(xì)胞,以250 cells/孔種于96孔板中。設(shè)置Garcinone E濃度梯度:0、0.78、1.56、2.187、3.125、4.375、6.25、8.75、12.5、17.5 μmol/L,孵育96 h后撤去舊培養(yǎng)基,每個(gè)孔中分別加入100 μl新鮮的DMEM培養(yǎng)基和10 μl的CCK-8試劑,在37 ℃條件下避光孵育1 h后上機(jī)檢測(cè)450 nm處的OD值。相對(duì)細(xì)胞活力(%)=藥物處理組OD值/對(duì)照組(0 μmol/L Garcinone E)OD值×100%。

1.5S18細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 使用不含基質(zhì)凝膠的Transwell小室進(jìn)行細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn),觀察細(xì)胞的遷移能力。在下室中加入750 μl DMEM完全培養(yǎng)基。將S18細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,消化、離心后棄上清液,用未加FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸,取500 μl細(xì)胞懸液接種到上室中,使用7.5 μmol/L的Garcinone E干預(yù)細(xì)胞。24 h后,棄去上室及下室舊液,用杜氏磷酸鹽緩沖鹽溶液(Dulbecco′s phosphate buffered saline,D-PBS)清洗2次,取750 μl的4%多聚甲醛于下室進(jìn)行固定,20 min后棄舊液,用D-PBS清洗2次,取750 μl的0.1%結(jié)晶紫染液進(jìn)行染色,20 min后棄舊液,用D-PBS洗2遍,用棉簽輕柔擦去上室中未遷移的細(xì)胞。在顯微鏡下觀察拍照,用Image J軟件統(tǒng)計(jì)遷移的細(xì)胞數(shù)。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞遷移率=Garcinone E干預(yù)組細(xì)胞遷移數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞遷移數(shù)×100%。

1.6S18細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 使用含基質(zhì)凝膠的Transwell小室模擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì),進(jìn)行細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)方法與上述方法1.5類似,但在處理細(xì)胞前,需在含基質(zhì)凝膠的上室及下室中分別加入500 μl和750 μl無FBS的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行水化,在37 ℃恒溫條件下處理2 h,后將細(xì)胞接種于Transwell小室中。24 h后,先用無FBS的DMEM培養(yǎng)基濕潤(rùn)棉簽,輕柔擦去上室中未穿過的細(xì)胞,再進(jìn)行染色、固定。進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞侵襲率=Garcinone E處理組細(xì)胞侵襲數(shù)/對(duì)照組細(xì)胞侵襲數(shù)×100%。

1.7Western blot檢測(cè)S18細(xì)胞轉(zhuǎn)移、周期和自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平 設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,以不同濃度Garcinone E(0、5、7.5、10 μmol/L)干預(yù)S18細(xì)胞24 h后,用含有蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑和EDTA的RIPA裂解液裂解細(xì)胞,用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。通過12%的SDS-PAGE凝膠電泳1.5 h分離蛋白,90 V恒壓電壓轉(zhuǎn)膜3 h,5%脫脂奶粉封閉1 h,1×TBST洗膜后孵育一抗,4 ℃過夜。第2天室溫孵育二抗1 h,用ECL化學(xué)發(fā)光液孵育1 min后使用凝膠成像系統(tǒng)顯影,設(shè)置合適的曝光時(shí)間以獲取目的蛋白的條帶圖像。相對(duì)表達(dá)量(%)=藥物干預(yù)組內(nèi)參歸一化的灰度值/對(duì)照組內(nèi)參歸一化的灰度值×100%。

2 結(jié)果

2.1Garcinone E抑制S18細(xì)胞的增殖活性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞活力檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Garcinone E抑制S18細(xì)胞的增殖活性,S18細(xì)胞的細(xì)胞活力隨著藥物濃度的增加而降低,半抑制濃度(fifty percent inhibitory concentration,IC50)=(3.34±0.03)μmol/L。見圖1。

圖1 不同濃度Garcinone E下S18細(xì)胞的增殖活性圖

2.2Garcinone E抑制S18細(xì)胞的遷移能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Garcinone E干預(yù)組細(xì)胞遷移率顯著下降(t=29.662,P<0.001),提示經(jīng)Garcinone E干預(yù)后,S18細(xì)胞的遷移能力被抑制。見圖2。

圖2 兩組S18細(xì)胞遷移能力比較圖(結(jié)晶紫染色,×200)

2.3Garcinone E抑制S18細(xì)胞的侵襲能力的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,Garcinone E干預(yù)組S18細(xì)胞侵襲率顯著下降(t=13.716,P<0.001)。提示經(jīng)Garcinone E干預(yù)后,S18細(xì)胞的侵襲能力被抑制。見圖3。

圖3 兩組S18細(xì)胞侵襲能力比較圖(結(jié)晶紫染色,×200)

2.4Garcinone E對(duì)S18細(xì)胞轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Garcinone E干預(yù)后S18細(xì)胞TIMP1和TIMP2蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平下調(diào)(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性。見圖4。

經(jīng)單因素方差分析,與對(duì)照組比較,aP<0.05;與5 μmol/L組比較,bP<0.05;與7.5 μmol/L組比較,cP<0.05

2.5Garcinone E對(duì)S18細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Garcinone E干預(yù)后S18細(xì)胞p21蛋白表達(dá)水平上調(diào)(P<0.05),CDK2、CDK6、CDK7和cyclin B1蛋白水平下調(diào)(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性。見圖5。

經(jīng)單因素方差分析,與對(duì)照組比較,aP<0.05;與5 μmol/L組比較,bP<0.05;與7.5 μmol/L組比較,cP<0.05

2.6Garcinone E對(duì)S18細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Garcinone E干預(yù)后S18細(xì)胞LC3B-Ⅱ、SQSTM1/p62、beclin-1和Atg3蛋白表達(dá)水平均上調(diào)(P<0.05),且呈一定的劑量依賴性。見圖6。

經(jīng)單因素方差分析,與對(duì)照組比較,aP<0.05;與5 μmol/L組比較,bP<0.05;與7.5 μmol/L組比較,cP<0.05

3 討論

3.1在鼻咽癌的治療中,腫瘤的轉(zhuǎn)移和耐藥使得臨床治療極具挑戰(zhàn)性[10],因此亟需尋找新的抗腫瘤化療藥物。氧雜蒽酮是一大類化合物,具有多種生物活性,包括抗腫瘤[11]、抗炎癥[12]和抗真菌[13]等。近期的研究報(bào)道表明,其可通過抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[6]、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]、抑制腫瘤細(xì)胞周期[15]以及阻斷腫瘤細(xì)胞自噬[7]等過程起到抗腫瘤作用。本研究結(jié)果顯示,Garcinone E可以抑制鼻咽癌S18細(xì)胞的增殖活性、轉(zhuǎn)移、細(xì)胞周期并阻滯細(xì)胞自噬。

3.2基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metallopeptidases,MMPs)是一組組織重塑酶,主要功能是組織重塑和調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì),在腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[16]。組織金屬蛋白酶抑制劑家族(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)的主要功能是對(duì)MMPs產(chǎn)生抑制作用,通過直接結(jié)合到催化性鋅元素輔因子,使MMPs不可逆地失活。TIMP1是MMP-9最有效的抑制劑,TIMP2在大部分組織中有表達(dá),可抑制MMP-2和MMP-9,形成非活性的MMPs-TIMPs復(fù)合體[17]。MMP-2和MMP-9作為侵襲相關(guān)的標(biāo)志蛋白,Garcinone C通過下調(diào)結(jié)直腸癌中的MMP-2和MMP-9蛋白水平起到抑制其侵襲的作用[8]。有研究顯示,積雪草酸和柚皮素聯(lián)合治療可以通過上調(diào)TIMP2和下調(diào)MMP-2蛋白表達(dá)抑制黑色素瘤和肺癌小鼠模型中腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。骨化三醇(維生素D的活性形式)處理乳腺癌細(xì)胞后,TIMP1和TIMP2蛋白表達(dá)上調(diào),MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)下調(diào),顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲[19]。本研究結(jié)果顯示,Garcinone E可以上調(diào)S18細(xì)胞TIMP1和TIMP2蛋白表達(dá)水平,下調(diào)MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平,提示Garcinone E可以通過下調(diào)MMP-2和MMP-9表達(dá)而抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

3.3細(xì)胞周期進(jìn)程異常是腫瘤發(fā)生的基本機(jī)制之一,使得細(xì)胞周期機(jī)制的調(diào)節(jié)劑成為抗腫瘤治療靶點(diǎn)[20]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)是真核細(xì)胞周期的主要調(diào)節(jié)劑,腫瘤抑制因子p21是CDKs的抑制劑,在細(xì)胞周期控制中發(fā)揮重要作用[21]。有研究顯示,白花丹素(Plumbagin)通過上調(diào)p53和p21的表達(dá),下調(diào)CDKs阻斷子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細(xì)胞周期并抑制了細(xì)胞的增殖[22]。他汀類藥物通過上調(diào)p21和下調(diào)CDKs及細(xì)胞周期蛋白cyclins的表達(dá)阻滯口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞周期[23]。本研究結(jié)果顯示,Garcinone E可以上調(diào)p21蛋白表達(dá),下調(diào)CDK2、CDK6、CDK7和cyclin B1蛋白表達(dá),抑制S18細(xì)胞增殖活性,提示Garcinone E具有阻滯鼻咽癌細(xì)胞周期的作用。

3.4細(xì)胞自噬是一種細(xì)胞內(nèi)的自我降解機(jī)制,是對(duì)環(huán)境壓力或饑餓條件作出的反應(yīng),可以降解自身的大分子物質(zhì)和受損的細(xì)胞器以維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。越來越多的研究表明,自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。在腫瘤發(fā)展的晚期,自噬可能通過在營(yíng)養(yǎng)受限或其他應(yīng)激時(shí)提供能量底物來維持和刺激腫瘤的生長(zhǎng),自噬已成為對(duì)放療、化療和靶向藥物產(chǎn)生抗性的重要介質(zhì)[24]。許多研究表明,阻斷細(xì)胞自噬可能成為治療腫瘤的有效策略[25-26]。LC3是自噬發(fā)生過程的標(biāo)志蛋白,通常表現(xiàn)為從細(xì)胞質(zhì)LC3-Ⅰ到脂質(zhì)化的LC3-Ⅱ的分子形式轉(zhuǎn)化,被募集到吞噬體并停留在自噬體的內(nèi)膜上,直到在自噬溶酶體中降解[27]。SQSTM1/p62會(huì)在自噬過程中降解,當(dāng)自噬過程被阻斷時(shí),LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62會(huì)累積。CA-5f是一種晚期自噬抑制劑,可以升高LC3B-Ⅱ和SQSTM1/p62的蛋白水平,阻滯非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的自噬通量[28]。本研究結(jié)果顯示,Garcinone E可以上調(diào)LC3B-Ⅱ和SQSTM1/p62水平,提示Garcinone E可以阻斷S18細(xì)胞自噬過程。

綜上所述,Garcinone E通過抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá),抑制鼻咽癌S18細(xì)胞的遷移和侵襲,同時(shí)可以阻滯細(xì)胞周期和細(xì)胞自噬的過程,從而發(fā)揮抗腫瘤作用,可作為鼻咽癌化療藥物研發(fā)的候選先導(dǎo)化合物。