馬寧，張?jiān)?/p>

隨著醫(yī)療技術(shù)及手術(shù)條件的不斷提升，宮頸癌根治術(shù)很大程度上延長(zhǎng)了宮頸癌患者生存時(shí)間，降低了疾病病死率。但臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)宮頸癌根治術(shù)聯(lián)合術(shù)后規(guī)范化輔助治療后，宮頸癌后期復(fù)發(fā)率依舊在10%～20%［1］。

宮頸癌的具體致病機(jī)制尚不清楚，但免疫功能紊亂與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)［2-3］。有研究發(fā)現(xiàn)［4］，宮頸癌患者的免疫細(xì)胞群失衡，并影響其預(yù)后。泛素蛋白1（ubiquilin 1，UBQLN1）是維持細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要物質(zhì)，能促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)降解，參與細(xì)胞自噬、凋亡等，在多種惡性腫瘤內(nèi)呈高表達(dá)，并可應(yīng)用于惡性腫瘤患者預(yù)后判斷中［5］。本研究通過分析宮頸癌患者免疫細(xì)胞群以及癌灶組織內(nèi)UBQLN1 表達(dá)情況與其臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系，旨在探求宮頸癌可能的致病及復(fù)發(fā)機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

將2018 年6 月至2020 年1 月晉城大醫(yī)院收治的98 例宮頸癌患者納為觀察組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：患者均符合手術(shù)指征，行宮頸癌根治術(shù)；術(shù)后病理檢查證實(shí)為宮頸癌；參照《宮頸癌診治指南》（2012 年）［6］中相關(guān)內(nèi)容行術(shù)后規(guī)范化治療；隨訪至2022 年1 月，且隨訪資料完整。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；既往接受過手術(shù)治療或放化療者；臨床資料缺失者。（3）病例資料：98 例宮頸癌患者年齡42～65 歲［（51.11 ± 10.15）歲］，絕經(jīng)者55 例，國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）分期：Ⅰ期50 例，ⅡA 期48 例，分化程度：中高分化者60 例，低分化者38 例，合并淋巴轉(zhuǎn)移者35 例，癌灶直徑＜4 cm 者47 例，≥4 cm 者51 例。同時(shí)將同期于同一醫(yī)院行健康體檢的60 例同年齡段女性納為對(duì)照組，對(duì)照組健康體檢均合格，無免疫性疾病或惡性腫瘤，年齡40～66 歲［（53.45 ±8.79）歲］，其中絕經(jīng)者30 例，且年齡及絕經(jīng)情況與觀察組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 外周血免疫細(xì)胞群檢測(cè) 對(duì)照組于入組后采集其外周靜脈血5 ml，觀察組在術(shù)前抽取其外周靜脈血5ml。檢測(cè)儀器為FACSCalibur 流式細(xì)胞儀（BD Bioscience，San Diego，CA），檢測(cè)試劑包括抗人CD4-FITC 抗體（eBioscience，Cat，NO.11-0048），抗人CD8-PE（eBioscience，Cat，NO.12-0097），抗人CD28-APC 抗體（eBioscience，Cat，NO.17-0289）。檢測(cè)方法：采集被研究者外周血于肝素抗凝試管，立即送檢，使用100 μl 全血與適當(dāng)體積的相應(yīng)抗體及同型對(duì)照抗體室溫避光孵育30 min 后，加入2 ml專用紅細(xì)胞裂解液室溫避光孵育10 min，再加入5 ml 磷酸緩沖液（PBS），以1 000 r/min 離心10 min，離心半徑為5.5 cm，棄上清液，洗滌3 次后采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)免疫細(xì)胞群分布情況。

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)UBQLN1 術(shù)中收集宮頸癌患者癌組織及癌旁組織，組織切片去蠟油。4 ℃下加入抗UBQLN1 抗體（1∶1 000，ab3341，Abcam）孵育過夜，PBS 洗滌3 次，然后加入HRP 偶聯(lián)二抗（1∶300，K8002，Dako）室溫孵育30 min，PBS 洗滌3 次，將染色切片與3'3-二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)10 min，0.1%蘇木素反染。

結(jié)果判定：邀請(qǐng)2 名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)生分別讀片，UBQLN1 表達(dá)量以染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占比分?jǐn)?shù)確定。強(qiáng)度記為0～3 分，沒有棕色顆粒、淺棕色顆粒、中等棕色顆粒以及深棕色顆粒分別得0、1、2、3 分；陽(yáng)性細(xì)胞占比記為0～3 分，陽(yáng)性細(xì)胞占比＜10%、10%～39%、40%～69%、≥70%分別得0、1、2、3 分，染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞率乘積作為總得分，總得分≤3 分者為低表達(dá)者，＞3 分者為高表達(dá)者。1.2.3 隨訪及復(fù)發(fā)診斷 隨訪至2022 年1 月，統(tǒng)計(jì)宮頸癌患者復(fù)發(fā)率：由病理診斷、腫瘤再次出現(xiàn)部位活檢及穿刺病理檢查證實(shí)；對(duì)于發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者，如肺轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等無法獲得病理診斷者，依靠癥狀、體征以及輔助檢查行臨床診斷。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理所得數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以±s表示，2 組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，2 組間比較采用χ2檢驗(yàn)。繪制受試者操作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評(píng)價(jià)外周血免疫細(xì)胞群及UBQLN1 表達(dá)量在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的效能。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組外周血免疫細(xì)胞群檢測(cè)結(jié)果比較

觀察組外周血CD8+T 細(xì)胞占比高于對(duì)照組，CD4+/CD8+比值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），2 組研究對(duì)象CD4+以及CD28+T 細(xì)胞占比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 觀察組與對(duì)照組外周血免疫細(xì)胞群檢測(cè)結(jié)果比較（± s）

表1 觀察組與對(duì)照組外周血免疫細(xì)胞群檢測(cè)結(jié)果比較（± s）

組別例數(shù)CD4+/CD8+觀察組對(duì)照組t 值P 值98 60 CD4+T 細(xì)胞（%）35.79 ± 6.69 37.48 ± 7.03 1.512 0.133 CD8+T 細(xì)胞（%）43.15 ± 7.48 31.03 ± 8.83 9.222＜0.001 0.83 ± 0.21 1.21 ± 0.15 10.059＜0.001 CD28+細(xì)胞（%）58.45 ± 10.47 57.66 ± 11.33 0.446 0.656

2.2 觀察組患者宮頸癌組織與癌旁組織內(nèi)UBQLN1 陽(yáng)性率比較

宮頸癌組織內(nèi)UBQLN1 陽(yáng)性率高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 觀察組患者宮頸癌組織與癌旁組織內(nèi)UBQLN1陽(yáng)性檢出率比較［例（%）］

2.3 觀察組患者宮頸癌臨床分期與外周血免疫細(xì)胞群及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

宮頸癌臨床分期為ⅡA 期的患者外周血CD4+T細(xì)胞占比以及CD4+/CD8+比值低于Ⅰ期，CD8+T 細(xì)胞占比低于Ⅰ期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其CD28+T 細(xì)胞占比以及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 觀察組患者宮頸癌臨床分期與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

2.4 觀察組患者宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移者CD4+T 細(xì)胞占比以及CD4+/CD8+比值低于無淋巴轉(zhuǎn)移者，CD8+T 細(xì)胞占比高于無淋巴轉(zhuǎn)移者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其CD28+T 細(xì)胞占比以及UBQLN1 陽(yáng)性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

表4 觀察組患者宮頸癌淋巴轉(zhuǎn)移與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

2.5 觀察組患者宮頸癌組織分化程度與外周血免疫細(xì)胞群及UBQLN1 表達(dá)量陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

宮頸癌低分化者外周血免疫細(xì)胞群占比與中高分化者比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），低分化者癌灶組織內(nèi)UBQLN1 陽(yáng)性檢出率高于中高分化者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 觀察組患者宮頸癌組織分化程度與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

2.6 觀察組患者宮頸癌病灶直徑與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

宮頸癌病灶直徑≥4 cm 者外周血CD4+T 細(xì)胞占比及CD4+/CD8+比值均低于＜4 cm 者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其CD8+、CD28+T 細(xì)胞占比以及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表6。

表6 觀察組患者宮頸癌病灶直徑與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

2.7 觀察組患者宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

隨訪至2022 年1 月，共29 例宮頸癌患者確診為復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)者外周血CD4+T 細(xì)胞占比以及CD4+/CD8+比值均低于未復(fù)發(fā)者，CD8+以及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率均高于未復(fù)發(fā)者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其CD28+T 細(xì)胞占比比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表7。

表7 觀察組患者宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)與外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率之間的關(guān)系

2.8 觀察組患者外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的價(jià)值

外周血免疫性細(xì)胞群CD4+/CD8+比值在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的效能最高，其AUC=0.951，95%CI（0.905～0.997），CD4+、CD8+、CD28+T 細(xì)胞單獨(dú)應(yīng)用時(shí)在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)，CD4+效能最高，其AUC=0.829，95%CI（0.746～0.912），癌變組織內(nèi)UBQLN1 陽(yáng)性表達(dá)在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的 AUC=0.880，95%CI（0.784～0.935）。見 表8、圖1。

表8 觀察組患者外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的價(jià)值

圖1 觀察組患者外周血免疫細(xì)胞群表達(dá)量及UBQLN11陽(yáng)性檢出率在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的價(jià)值

3 討論

宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒感染密切相關(guān)，但除此之外，機(jī)體免疫狀態(tài)與宮頸癌的發(fā)生及發(fā)展也密切相關(guān)。機(jī)體的抗腫瘤免疫以細(xì)胞免疫為主，而T 細(xì)胞亞群是調(diào)控細(xì)胞免疫的中心，同時(shí)也是最重要的效應(yīng)細(xì)胞。正常情況下，T 細(xì)胞各亞群均處于平衡狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生病理改變時(shí)，免疫系統(tǒng)被激活，T 淋巴細(xì)胞亞群數(shù)量發(fā)生改變，免疫平衡狀態(tài)被打破［7-8］。

有研究報(bào)道［9］，乳腺癌患者CD4+、CD3+水平降低，CD8+及血小板水平升高，且以上免疫因子與乳腺癌腫瘤直徑、病理分級(jí)、分化程度、淋巴轉(zhuǎn)移等病理因素關(guān)系密切。蔣立人等［10］研究發(fā)現(xiàn)，外周血CD3+、CD4+、CD8+T 細(xì)胞數(shù)量較低的高級(jí)別尿路上皮癌患者預(yù)后更差。

T 淋巴細(xì)胞是一類在胸腺分化并發(fā)育成熟的淋巴細(xì)胞，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究選擇CD4+、CD8+以及CD28+T 細(xì)胞作為研究免疫細(xì)胞群，CD4+T 淋巴細(xì)胞可輔助與誘導(dǎo)前體細(xì)胞，識(shí)別瘤細(xì)胞分泌的可溶性抗原，并可激活B 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞，活化抗體生成、巨噬細(xì)胞及細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞，放大其免疫效應(yīng)，是抗腫瘤免疫中重要的免疫因子［11-13］。CD8+T 淋巴細(xì)胞是重要的效應(yīng)細(xì)胞，可分為抑制性T 細(xì)胞與細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，其中抑制性T 細(xì)胞具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可抑制免疫活化，抑制B 細(xì)胞產(chǎn)生抗體，而細(xì)胞毒性T 細(xì)胞則可直接對(duì)抗腫瘤細(xì)胞、病毒等，發(fā)揮免疫功效［14-15］。CD28+是最重要的協(xié)同刺激分子，主要表達(dá)于T 淋巴細(xì)胞上，能提高T 淋巴細(xì)胞的反應(yīng)性，誘導(dǎo)抗凋亡基因的表達(dá)［16-17］。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者外周血CD8+T 細(xì)胞占比高于對(duì)照組，CD4+/CD8+比值低于對(duì)照組，CD28+及CD4+水平與對(duì)照組無異。提示與健康者相比較，宮頸癌患者機(jī)體免疫功能紊亂，CD4+/CD8+平衡被打破。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤分期為ⅡA 期者、合并淋巴轉(zhuǎn)移者、腫瘤直徑≥4 cm 者均存在CD4+/CD8+比值下降的特征，提示免疫細(xì)胞群CD4+/CD8+失衡與宮頸癌的發(fā)生及進(jìn)展關(guān)系密切。

除了免疫功能外，泛素蛋白也與多種惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展關(guān)系密切。UBQLN1 是泛素蛋白家族中的一員，Zhang 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，UBQLN1 可通過mTOR/自噬/P53 信號(hào)通路介導(dǎo)肺癌A459 細(xì)胞增殖與凋亡，參與肺癌的發(fā)生。Feng X 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌UBQLN1 表達(dá)水平上調(diào)，而抑制UBQLN1 則可抑制乳腺癌侵襲及子宮內(nèi)膜異位癥。Bao 等［20］研究發(fā)現(xiàn)，胃癌組織內(nèi)UBQLN1 表達(dá)水平高于癌旁組織，且UBQLN1 高表達(dá)與患者不良預(yù)后關(guān)系密切。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組織內(nèi)UBQLN1 陽(yáng)性檢出率為81.63%，明顯高于癌旁組織陽(yáng)性檢出率的54.08%，且低組織分化癌患者UBQLN1 檢出率明顯高于中高分化者，提示UBQLN1 表達(dá)量與宮頸癌組織分化程度有關(guān)。

宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)是患者最為關(guān)心的，準(zhǔn)確預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，在臨床工作中有著指導(dǎo)意義。為研究免疫細(xì)胞亞群及UBQLN1 在預(yù)測(cè)宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)中的價(jià)值，本研究隨訪至2022 年1月，共統(tǒng)計(jì)出29 例復(fù)發(fā)。比較發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)者外周血CD4+T 細(xì)胞占比以及CD4+/CD8+比值均低于未復(fù)發(fā)者，CD8+T 細(xì)胞占比以及UBQLN1 陽(yáng)性檢出率均高于未復(fù)發(fā)者，提示外周血免疫細(xì)胞失衡，以及UBQLN1 過度表達(dá)均可能影響宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)。

繪制ROC 曲線提示，CD4+/CD8+比值低于0.79，以及宮頸癌組織內(nèi)UBQLN1 高表達(dá)在患者術(shù)后癌癥復(fù)發(fā)中均具有良好的應(yīng)用效能，可作為宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)參考指標(biāo)。但受限于研究設(shè)計(jì)，本研究并未對(duì)免疫細(xì)胞群失衡與UBQLN1 表達(dá)量之間的關(guān)系進(jìn)行深入研究，未探討兩者在宮頸癌復(fù)發(fā)中的作用機(jī)制，存在一定的缺陷，可作為下一步研究的方向。

綜上所述，宮頸癌患者外周血免疫細(xì)胞群水平及UBQLN1 表達(dá)水平在預(yù)測(cè)患者術(shù)后復(fù)發(fā)中具有一定價(jià)值，可作為宮頸癌術(shù)后復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的潛在指標(biāo)。