曲奎堯，張珊，謝春艷，董彥茂，張傳倉(cāng)

肺炎支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）是兒童呼吸道感染的重要病原體之一。MP 感染常見(jiàn)于學(xué)齡前期及學(xué)齡期兒童，近年來(lái)嬰幼兒感染亦有不少報(bào)道［1-2］。MP 感染的臨床表現(xiàn)不典型，缺少特異性，僅依據(jù)臨床表現(xiàn)難與其他病原體引起的呼吸道感染相鑒別。加之自2000 年以來(lái)研究表明大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)耐藥MP 的證據(jù)越來(lái)越多［3］，因此，快速有效的實(shí)驗(yàn)室診斷尤為重要。本研究回顧性分析在海軍第九七一醫(yī)院兒科住院當(dāng)天利用免疫膠體金法（immune colloidal gold technique，GICT）與住院次日利用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence assay，IFA）同時(shí)行MP-IgM 抗體檢測(cè)的下呼吸道感染患兒的臨床資料，評(píng)價(jià)2 種檢測(cè)方法對(duì)MP 感染的臨床價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年1-12 月在海軍第九七一醫(yī)院住院的985 例下呼吸道感染患兒的臨床資料。985 例患兒中，男515 例，女470 例，男∶女=1.1∶1，年齡1 個(gè)月～14 歲；其中支氣管肺炎390 例，普通肺炎572 例，大葉性肺炎23 例。選取入院當(dāng)天在醫(yī)院門(mén)診利用GICT 并在入院次日利用IFA 行MP-IgM 檢測(cè)且發(fā)病病程均≥4 d 的134 例患兒的臨床資料。其中支氣管肺炎25 例，普通肺炎100 例，大葉性肺炎9 例。根據(jù)患兒年齡將其分為＜3 歲組、3～6 歲組、＞6 歲組。根據(jù)患兒發(fā)病病程將其分為4～7 d 組和＞7 d 組。

1.2 方法

1.2.1 GICT 采用北京貝爾生物工程有限公司生產(chǎn)的MP-IgM 檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。取入院當(dāng)天門(mén)診下呼吸道感染患兒末梢血20 μl 進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，15～20 min 判斷結(jié)果。對(duì)照線(xiàn)和檢測(cè)線(xiàn)均出現(xiàn)為陽(yáng)性；只顯示對(duì)照線(xiàn)為陰性；對(duì)照線(xiàn)不顯示及超過(guò)20 min 判斷結(jié)果無(wú)效。

1.2.2 IFA 采用西班牙Vircell 公司生產(chǎn)的9 項(xiàng)呼吸道感染病原體IgM 抗體檢測(cè)試劑盒。入院次日清晨患兒空腹抽取靜脈血3 ml 進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法及質(zhì)控要求嚴(yán)格按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用免疫熒光顯微鏡觀(guān)察結(jié)果，以效價(jià)＞1∶16 為陽(yáng)性。

1.3 臨床MP 感染診斷

根據(jù)患兒臨床癥狀（以咳嗽和/或發(fā)熱為最主要癥狀）、體征（肺部體征輕與發(fā)熱、劇咳不一致）、影像學(xué)檢查（X 線(xiàn)改變明顯而肺部體征輕）及大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素治療有效等臨床特點(diǎn)，由2 名具有主治醫(yī)師以上職稱(chēng)的兒科醫(yī)生共同得出臨床MP 感染的診斷結(jié)論。臨床符合率即診斷試驗(yàn)結(jié)果與受試者實(shí)際情況相符合的概率=［（陽(yáng)性符合例數(shù)+陰性符合例數(shù)）/總例數(shù)］×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)數(shù)資料以百分比（%）表示，配對(duì)資料的差異性采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

134 例下呼吸道感染患兒中，男63 例，女71 例，年齡6 個(gè)月～11 歲，男∶女=0.88∶1。年齡＜3 歲組33 例，3～6 歲組63 例，＞6 歲組38 例。入院前病程4～7 d 組76 例，＞7 d 組58 例。134 例下呼吸道感染患兒中符合臨床MP 感染診斷107 例。

2.2 2 種方法MP 檢測(cè)陽(yáng)性率比較

134 例下呼吸道感染患兒中，GICT 的MP 檢測(cè)陽(yáng)性例數(shù)為62 例（46.3%），IFA 為99 例（73.9%），2 種方法MP 檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測(cè)134 例下呼吸道感染患兒MP 結(jié)果比較［例（%）］

2.3 2 種方法檢測(cè)不同年齡組、不同病程組MP 陽(yáng)性率比較

GICT 和IFA 在年齡＜3 歲組、3～6 歲組、＞6 歲組MP 檢測(cè)陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.983，P=0.050；χ2=0.403，P=0.818）。見(jiàn)表2。而在4～7 d 組和＞7 d 組的不同病程組中，GICT 對(duì)MP檢測(cè)陽(yáng)性率分別為34.2%、58.6%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.927，P=0.005）；IFA 對(duì)MP 感染檢測(cè)陽(yáng)性率分別為65.8%、84.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.957，P=0.015）。見(jiàn)表3。

表2 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測(cè)不同年齡組患兒MP 感染陽(yáng)性率比較［例（%）］

表3 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測(cè)對(duì)不同病程組患兒檢測(cè)MP 感染陽(yáng)性率比較［例（%）］

2.4 2 種方法檢測(cè)MP 感染臨床符合率比較

利用GICT 檢出MP 感染陽(yáng)性例數(shù)62 例，陰性例數(shù)72 例，其中陽(yáng)性診斷符合的54 例，陰性診斷符合的19 例，共73 例符合臨床診斷，符合率為54.5%；IFA 檢出MP 感染陽(yáng)性例數(shù)99 例，其中陽(yáng)性診斷符合的90 例，陰性診斷符合的18 例，共108 例符合臨床診斷，符合率為80.6%；2 種方法臨床符合率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=21.927，P＜0.01）。見(jiàn)表4。同時(shí)，在不同病程組之間對(duì)MP 感染臨床符合率比較分析，4～7 d 組76 例，2 種檢測(cè)方法對(duì)MP 感染檢出均陽(yáng)性17 例，其中符合臨床MP 感染15 例，不符合2 例，陽(yáng)性符合率88.2%；2 種檢測(cè)方法對(duì)MP 感染檢出均陰性15 例，其中臨床陽(yáng)性診斷7 例，符合臨床陰性診斷8 例，陰性符合率為53.3%。＞7 d 組58 例，2 種檢測(cè)方法均陽(yáng)性30 例，均符合臨床支原體感染陽(yáng)性診斷，陽(yáng)性符合率100%；2 種檢測(cè)方法均陰性5 例，4 例符合臨床支原體陰性診斷，陰性符合率為80.0%。見(jiàn)表5。

表4 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測(cè)MP 感染臨床符合率比較（例）

表5 免疫膠體金法與間接免疫熒光法檢測(cè)均陽(yáng)性、均陰性在不同病程組間對(duì)MP 感染臨床診斷情況比較（例）

3 討論

MP 屬柔膜體綱，支原體屬，是一類(lèi)無(wú)細(xì)胞壁、呈多形性、能夠自我復(fù)制、不依靠活體細(xì)胞而生存的最小微生物［4］。由于缺乏細(xì)胞壁，因此對(duì)作用于細(xì)胞壁的抗菌藥物具有耐藥性［3］。MP 呼吸道感染的致病機(jī)制主要通過(guò)粘附及細(xì)胞毒效應(yīng)對(duì)呼吸道上皮直接損傷和免疫機(jī)制引起呼吸道及肺外損傷［5-6］。MP 是兒童呼吸道感染的重要病原體，經(jīng)飛沫和直接接觸傳播，潛伏期l～3 周，潛伏期內(nèi)至癥狀緩解數(shù)周均有傳染性。MP 呼吸道感染臨床表現(xiàn)呈多樣性，可以從無(wú)癥狀到鼻咽炎、鼻竇炎、中耳炎、咽扁桃體炎、氣管支氣管炎和肺炎等［7］。MP 肺炎發(fā)生率約是普通肺炎的20 倍，而10%～40% 的MP 呼吸道感染會(huì)發(fā)展成肺炎［7-8］。目前MP 是我國(guó)社區(qū)獲得性肺炎的主要病原體，約占小兒肺炎的10%～20%。MP 肺炎主要臨床表現(xiàn)為發(fā)熱和咳嗽，發(fā)熱程度不一，可表現(xiàn)為高熱、中等度熱或低熱，甚至無(wú)熱?？人灾饕獮榇碳ば愿煽?，個(gè)別患兒會(huì)出現(xiàn)類(lèi)百日咳樣咳嗽。MP 肺炎可導(dǎo)致肺外并發(fā)癥，幾乎可以累及全身各個(gè)系統(tǒng)，如皮膚黏膜系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)等，發(fā)生率約25.0%。目前大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素仍為兒童MP 感染的首先用藥，但自2001 年日本學(xué)者首次發(fā)現(xiàn)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素耐藥的MP（macrolide-resistant MP，MRMP）報(bào)道后［9］，中國(guó)、歐洲及美國(guó)相繼分離出MRMP 菌株。由于大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素在兒童中的單一、過(guò)度及不規(guī)范用藥，目前世界各國(guó)MRMP 急劇增加，尤其在東亞國(guó)家耐藥率更高［10］。日本有研究顯示2015 年MP 的耐藥率為43.6%［11］。2008-2012 年連續(xù)5 年監(jiān)測(cè)北京MP 的耐藥率分別為68.9%、90.0%、98.4%、95.4%、97.0%［12］。鑒于上述特點(diǎn)，急需研究能夠及時(shí)準(zhǔn)確地判斷MP 感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。兒童MP 感染的實(shí)驗(yàn)室診斷方法包括MP 病原體培養(yǎng)、MP 核酸檢測(cè)、MP 抗原直接檢測(cè)、MP 血清抗體檢測(cè)。其中，MP 培養(yǎng)陽(yáng)性是判斷MP 感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但由于對(duì)培養(yǎng)環(huán)境要求苛刻且培養(yǎng)周期長(zhǎng)，對(duì)臨床早期診斷意義不大。MP核酸檢測(cè)包括DNA 和RNA 檢測(cè)，具有靈敏度高、檢測(cè)速度較快的特點(diǎn)，但特異性相對(duì)不足，不能區(qū)分其是由機(jī)體自身攜帶還是現(xiàn)行感染，且對(duì)標(biāo)本保存及采集人員標(biāo)準(zhǔn)要求較高［13-14］。MP 抗原直接檢測(cè)特異性較高，但靈敏度低。由于MP 感染患者的咽拭子病原體含量一般為1×105～1×106CFU/L，而該方法最小檢測(cè)含量一般為1×106CFU/L，故易引起假陰性［15］。MP 血清抗體檢測(cè)由于方法簡(jiǎn)單，臨床應(yīng)用較廣，常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）、顆粒凝集法（PA）、GICT、化學(xué)發(fā)光法（CLIA）、IFA。MP 感染機(jī)體后，體內(nèi)可產(chǎn)生特異性的IgM 抗體，IgM 抗體一般在感染后4～5 d 出現(xiàn)，3～4 周后達(dá)高峰，持續(xù)1～3 個(gè)月甚至半年以上，可作為近期感染的診斷指標(biāo)［7,16］。GICT 檢測(cè)簡(jiǎn)便，可用末梢全血，所需血量少，出具結(jié)果迅速，適合門(mén)診或急診患兒疑似MP 感染的快速篩查［7］。IFA 需靜脈血，出具結(jié)果相對(duì)較慢，該方法多應(yīng)用于住院兒童。在臨床診治過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，住院兒童中2 種方法檢測(cè)結(jié)果既存在一致性又有差異，為了探討2 種方法的臨床，本研究回顧性分析2019 年在海軍第九七一醫(yī)院住院的下呼吸道感染患兒的臨床資料。鑒于MP 產(chǎn)生抗體的時(shí)間，本研究在篩選病例時(shí)剔除了發(fā)病病程＜4 d 的病例。在符合條件的134 例下呼吸道感染患兒中，2 種檢測(cè)方法均陽(yáng)性47 例，均陰性20 例。其中GICT 檢出MP 感染陽(yáng)性例數(shù)62 例，檢測(cè)陽(yáng)性率為46.3%，73 例符合臨床診斷，符合率54.5%；IFA 檢出MP 感染陽(yáng)性例數(shù)99 例，檢測(cè)陽(yáng)性率為73.9%，108 例符合臨床診斷，符合率80.6%；經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析2 種方法對(duì)MP 檢測(cè)陽(yáng)性率及臨床符合率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。雖然2 種方法在不同年齡組對(duì)MP 檢測(cè)陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2 種檢測(cè)方法均隨著患兒年齡段的增加而檢出陽(yáng)性率升高，尤其在＞6 歲組檢出陽(yáng)性率最高，這與臨床中MP 感染主要發(fā)生在學(xué)齡期兒童一致。通過(guò)在不同病程組比較分析發(fā)現(xiàn)，2 種方法均在病程4～7 d 的患兒MP 感染檢測(cè)陽(yáng)性率較低，2 種檢測(cè)方法均陽(yáng)性與MP 臨床診斷陽(yáng)性符合率為88.2%，但陰性符合率僅為53.3%；而在病程超過(guò)7 d 的患兒MP 感染檢出率更高，且2 種檢測(cè)方法均陽(yáng)性與臨床MP 感染判斷完全符合，陽(yáng)性符合率100%，同時(shí)陰性符合率為80.0%。因此，對(duì)病程超過(guò)7 d 的患兒，2 種檢測(cè)方法聯(lián)合使用可為臨床判斷提供重要決策，而對(duì)病程4～7 d 的患兒僅單獨(dú)采用血清特異性IgM 抗體方法判斷有無(wú)MP 感染仍需謹(jǐn)慎，需要結(jié)合臨床綜合判斷或聯(lián)合其他實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。鑒于國(guó)內(nèi)MP檢測(cè)的試劑盒廠(chǎng)家眾多，每種方法的敏感性和特異性不同，中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)臨床檢驗(yàn)學(xué)組建議有條件的實(shí)驗(yàn)室至少開(kāi)展2 種以上的檢測(cè)方法來(lái)相互彌補(bǔ)之不足［13］。李少麗等［17］認(rèn)為，臨床上不能通過(guò)單份血清抗體檢測(cè)陽(yáng)性來(lái)確診MP 感染，建議采用血清法和PCR 聯(lián)合檢測(cè)。另外，本研究中對(duì)于GICT 檢測(cè)陽(yáng)性率低的結(jié)果考慮存在以下原因：不同公司生產(chǎn)的試劑盒的質(zhì)量會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定影響；該研究中運(yùn)用GITC 采血的時(shí)間相對(duì)IFA 要提前約1 d，抗體產(chǎn)生的量相對(duì)少。

本研究發(fā)現(xiàn)，雖然在不同年齡段2 種方法對(duì)MP 檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)差異，但在小年齡組，2 種方法的檢測(cè)陽(yáng)性率均最低，考慮原因是由于小年齡組免疫功能不完善，機(jī)體產(chǎn)生抗體能力較弱。根據(jù)上述特點(diǎn)，2019 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科分會(huì)臨床檢驗(yàn)學(xué)組專(zhuān)家共識(shí)提出，根據(jù)患者現(xiàn)在和既往的癥狀、門(mén)診和住院、篩查和確診等不同的感染情況選擇不同的檢測(cè)方法，為臨床MP 感染的診斷提供合理、經(jīng)濟(jì)、高效的參考建議。此外，中國(guó)兒童MP 感染實(shí)驗(yàn)室診斷規(guī)范和臨床實(shí)踐專(zhuān)家共識(shí)（2019 年）提出可根據(jù)患兒年齡、免疫功能狀態(tài)、病程及就診醫(yī)院等級(jí)對(duì)MP感染提出分層推薦的實(shí)驗(yàn)室診斷方法。

本研究發(fā)現(xiàn)，IFA 較GICT 對(duì)MP 感染的檢測(cè)陽(yáng)性率及臨床符合率均更高，且二者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2 種方法在不同年齡組對(duì)MP 感染檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)差異，但隨著患兒年齡增加，陽(yáng)性率均升高。在不同病程組2 種方法對(duì)MP 檢測(cè)陽(yáng)性率均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且對(duì)發(fā)病病程超過(guò)7 d 的患兒檢測(cè)陽(yáng)性率更高，二者聯(lián)合檢測(cè)均陽(yáng)性與臨床MP 感染陽(yáng)性判斷完全符合。對(duì)于病程4～7 d 的患兒仍需結(jié)合臨床或聯(lián)合其他實(shí)驗(yàn)室診斷方法進(jìn)行判斷。