辜國軍，秦易，胡萌宇

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球第四大惡性腫瘤，同時，也是全球第三大癌癥死亡原因［1］。HCC 發(fā)病隱匿，早期較難被發(fā)覺，多數(shù)患者就診時已為中晚期，因此，死亡率一直居高不下［2］。近年來，針對HCC 的治療手段越來越多，如射頻消融術(shù)、經(jīng)肝動脈化療栓塞及靶向藥物治療等，均取得了較好的治療效果，但仍有部分HCC 患者術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或死亡，預(yù)后較差［3］，因此，早期了解預(yù)后情況并及時給予有效的治療具有重要意義。CT 或MRI 等影像學(xué)檢查可明顯觀察到HCC 病灶大小和邊緣強(qiáng)化情況，在評估腫瘤病灶控制方面有較高的價值，但對于評估預(yù)后的價值較低。因此，急需探尋價值較高的指標(biāo)用于HCC 預(yù)后評估。

自噬在HCC 發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，其可調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的凋亡、耐藥等［4］?？缒さ鞍?1B（TMEM41B）是一種細(xì)胞自噬調(diào)節(jié)蛋白，在自噬小體的形成過程中起著關(guān)鍵作用［5-8］，其與泡膜蛋白1 在結(jié)構(gòu)和功能上具有相似之處［9］。泡膜蛋白1 可通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和增殖影響HCC 預(yù)后［10］?；谏鲜鲅芯浚欣碛烧J(rèn)為TMEM41B 與HCC 有關(guān)，是評估HCC 預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。目前，少有研究分析TMEM41B 與HCC 預(yù)后的關(guān)系，本研究主要分析TMEM41B 在HCC 組織中的表達(dá)及其對患者預(yù)后的影響，以期為HCC 的預(yù)后評估提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2016 年3 月至2018 年3 月在眉山市第二人民醫(yī)院就診的164 例HCC 患者作為研究對象，男性106 例，女性58 例；年齡48～70 歲［（62.18 ±4.66）歲］；乙肝表面抗原（HBsAg）陽性135 例；Child-Pugh A 級123 例，B 級41 例；腫瘤直徑＞5 cm 79 例；腫瘤單發(fā)62 例，多發(fā)102 例；甲胎蛋白（AFP）＞400 μg/L 96 例；血管侵犯79 例；腫瘤分期Ⅰ期15 例，Ⅱ期70 例，Ⅲ期79 例。參照《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范》［11］診斷HCC。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）病理活檢確診為HCC；（2）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）隨訪失聯(lián)；（2）合并其他惡性腫瘤；（3）肝、腎功能嚴(yán)重異常；（4）有自身免疫性疾病史或血液系統(tǒng)疾病史等；（5）獲取HCC 組織前接受放、化療、生物治療或靶向治療等。本研究所有受試者均知情同意，簽署了知情同意書。本研究符合《赫爾辛基宣言》，經(jīng)眉山市第二人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)［倫理批號：2022 年審（05）號］。

1.2 TMEM41B 表達(dá)量檢測

用蛋白質(zhì)免疫印跡法［12］檢測TMEM41B 表達(dá)量。取凍存的穿刺或手術(shù)獲取的HCC 組織和癌旁組織，解凍后剪碎，用TL2020 型組織研磨儀［鼎昊源（天津）生物科技有限公司］研磨，獲取組織勻漿。用RIPA 裂解液裂解組織細(xì)胞，4 ℃下4 000 r/min離心15 min，離心半徑為8 cm，提取離心后上清液。BCA 法對蛋白進(jìn)行定量。80 V 凝膠電泳15 min，然后加壓至120 V，直至溴酚藍(lán)跑出膠面；300 mA 60 min 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜；5% 脫脂牛奶搖床孵育1 h；滴加兔抗人TMEM41B 多克隆抗體（臺灣亞諾法生技股份有限公司，批號：PAB20785），4 ℃下孵育過夜；滴加山羊抗兔二抗（臺灣亞諾法生技股份有限公司，批號：PAB10828），搖床孵育1 h；ECL 發(fā)光液顯影。用Image J 1.8.0 軟件分析凝膠圖像。

1.3 隨訪

于受試者出院后1 個月隨訪，之后每3～6 個月隨訪1 次，共隨訪3 年，末次隨訪時間為2021 年4 月，隨訪終點(diǎn)為至隨訪結(jié)束或死亡。隨訪6～36 個月，111 例HCC 患者存活（生存組），53 例死亡（死亡組）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。多組間比較采用F檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計數(shù)資料以頻數(shù)和%表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。用受試者工作特征（ROC）曲線評價TMEM41B 診斷HCC 預(yù)后的效能。用Cox 回歸分析HCC 預(yù)后的風(fēng)險因素。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TMEM41B 在HCC 組織和癌旁組織中的表達(dá)

HCC 組織中TMEM41B 表達(dá)量0.36 ± 0.06 高于癌旁組織0.21 ± 0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=25.087，P＜0.001）。見圖1。

圖1 TMEM41B 在HCC 組織和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 TMEM41B 與HCC 患者的一般資料和臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同年齡、性別、HBsAg、Child-Pugh 分級、腫瘤數(shù)目和AFP 的HCC 患者的TMEM41B 相對表達(dá)量比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。腫瘤直徑＞5 cm 的HCC 患者TMEM41B 相對表達(dá)量高于腫瘤直徑≤5 cm 的HCC 患者，血管侵犯的HCC 患者TMEM41B 相對表達(dá)量高于未侵犯血管的HCC 患者，腫瘤分期Ⅲa 期的HCC 患者TMEM41B 相對表達(dá)量高于Ⅰ期的HCC 患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 TMEM41B 與HCC 患者的一般資料和臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 TMEM41B 與HCC 預(yù)后的關(guān)系

生存組的TMEM41B 相對表達(dá)量（0.34 ± 0.05）低于死亡組（0.40 ± 0.07），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.534，P＜0.001）。TMEM41B 診 斷HCC 預(yù) 后 的ROC 曲線下面積、最佳截斷點(diǎn)、靈敏度和特異度分別為0.716（95%CI：0.631～0.801）、0.34、75.47%和60.36%。見圖2。

圖2 TMEM41B 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線

2.4 HCC 預(yù)后的Cox 回歸分析

將HCC 預(yù)后作為因變量，將年齡、性別、HBsAg、Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、腫瘤數(shù)目、AFP、腫瘤分期和TMEM41B（以TMEM41B 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線最佳截斷點(diǎn)為界值將其轉(zhuǎn)換為二分類變量）作為自變量，分別納入Cox 回歸分析，結(jié)果顯示Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP、腫瘤分期和TMEM41B 與HCC 預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。將HCC 預(yù)后作為因變量，將Child-Pugh 分級、腫瘤直徑、AFP、腫瘤分期和TMEM41B 作為自變量，一并納入Cox回歸分析，結(jié)果顯示Child-Pugh B 級、腫瘤直徑＞5 cm、腫瘤分期和TMEM41B＞0.34 是HCC 預(yù)后的獨(dú)立危險因素（P＜0.05）。見表3、4。

表3 HCC 預(yù)后風(fēng)險因素的Cox 多因素分析結(jié)果

表3 HCC 預(yù)后風(fēng)險因素的Cox 單因素分析結(jié)果

3 討論

自噬是一種真核細(xì)胞特有的代謝方式，其可清除胞質(zhì)內(nèi)受損的細(xì)胞器及活性氧物質(zhì)等，用于維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)和DNA 的穩(wěn)定［13］。正常條件下，細(xì)胞的自噬活動處于較低水平，當(dāng)受到細(xì)胞因子、缺氧、缺營養(yǎng)物質(zhì)等刺激時，自噬增強(qiáng)［14］。HCC 細(xì)胞自噬與其凋亡、治療敏感度密切相關(guān)［15-16］。TMEM41B 表達(dá)降低可抑制自噬體的生物合成，從而干擾細(xì)胞自噬［5-8］。目前，TMEM41B 已被報道與骨肉瘤［17］和肺癌［18］的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，但關(guān)于其與HCC 的關(guān)系鮮有研究報道。本研究主要分析TMEM41B 在HCC 組織中的表達(dá)及對患者預(yù)后的影響，以期為HCC 的預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示HCC 組織中TMEM41B 相對表達(dá)量高于癌旁組織，該結(jié)果提示TMEM41B 與HCC發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)，是HCC 預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。本研究分析不同HCC 病理參數(shù)的TMEM41B 相對表達(dá)量，結(jié)果顯示腫瘤直徑＞5 cm 的HCC 患者TMEM41B 相對表達(dá)量高于腫瘤直徑≤5 cm 的HCC患者。該結(jié)果提示TMEM14B 可能通過調(diào)控腫瘤大小影響HCC 預(yù)后。推測其原因是HCC 細(xì)胞繁殖迅速，需要大量物質(zhì)供能。HCC 細(xì)胞中TMEM41B 的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)細(xì)胞自噬，進(jìn)而為其增殖提供能量，故TMEM41B 表達(dá)量越高，腫瘤病灶可能越大。血管侵犯的HCC 患者TMEM41B 相對表達(dá)量高于未侵犯血管的HCC 患者，該結(jié)果提示TMEM14B 可能通過促進(jìn)血管侵犯影響HCC 預(yù)后。推測其原因是TMEM41B 表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)HCC 細(xì)胞自噬，從而為其血管侵犯供能，故存在血管侵犯的患者，其癌組織中TMEM41B 表達(dá)上調(diào)。腫瘤分期Ⅲa 期的HCC患者TMEM41B 相對表達(dá)量高于Ⅰ期的HCC 患者，推測其原因是腫瘤病灶和血管侵犯與腫瘤分期密切相關(guān)，TMEM41B 表達(dá)上調(diào)可增加腫瘤病灶大小并促進(jìn)血管侵犯，故腫瘤分期Ⅲa 期的TMEM41B 相對表達(dá)量更高。

本研究中164 例HCC 患者3 年生存率為67.68%，與王鶴等［19］結(jié)果（66.7%）接近。本研究比較了生存組和死亡組的TMEM41B 相對表達(dá)量，結(jié)果顯示生存組的TMEM41B 相對表達(dá)量低于死亡組，該結(jié)果證實(shí)TMEM41B 與HCC 預(yù)后有關(guān)，或可成為評價HCC 預(yù)后的生物標(biāo)志物。本研究進(jìn)一步構(gòu)建了TMEM41B 診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線，結(jié)果顯示其診斷HCC 預(yù)后的ROC 曲線下面積、靈敏度和特異度分別為0.716、75.47%和60.36%，該結(jié)果提示TMEM41B 對HCC 預(yù)后評價有一定價值，尚可輔助用于臨床醫(yī)師評估HCC 預(yù)后。

本研究用Cox 回歸分析了HCC 預(yù)后的風(fēng)險因素，結(jié)果顯示TMEM41B＞0.34 是HCC 預(yù)后的獨(dú)立危險因素，推測其原因可能有以下2 點(diǎn)：（1）TMEM41B 通過調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞自噬使其免于凋亡；（2）TMEM41B 通過調(diào)節(jié)HCC 細(xì)胞自噬使其避免化療藥物、靶向藥物誘發(fā)的損傷，從而影響HCC 預(yù)后。HCC 組織中TMEM41B 表達(dá)量可反映HCC 細(xì)胞的自噬程度，進(jìn)而反映HCC 預(yù)后，其病理生理機(jī)制仍有待開展基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。此外，本研究結(jié)果還顯示Child-Pugh B 級、腫瘤直徑＞5 cm 和腫瘤分期高是HCC 預(yù)后的獨(dú)立危險因素，與既往報道［20-21］結(jié)果一致。

綜上所述，HCC 組織中TMEM41B 表達(dá)與腫瘤直徑、血管侵犯和腫瘤分期有關(guān)。HCC 組織中TMEM41B 表達(dá)量高提示HCC 預(yù)后不良。本研究尚存在一定不足，一是樣本量偏小，樣本選擇上可能存在一定選擇偏倚，還需開展大樣本、多中心研究進(jìn)一步分析TMEM41B 與HCC 預(yù)后的關(guān)系；二是未開展基礎(chǔ)研究分析TMEM41B 參與HCC 發(fā)病和進(jìn)展的病理生理機(jī)制，下一步將針對上述不足進(jìn)行補(bǔ)充，以充實(shí)本研究結(jié)論。