索海翠 劉計(jì)濤 王 麗 李成晨 單建偉 李小波

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所 / 廣東省農(nóng)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東廣州 510640

人體缺鋅已成為非常普遍的公共健康問(wèn)題。提高糧食作物可食用部位的鋅含量是緩解人體缺鋅的一條經(jīng)濟(jì)而有效的途徑[1]。馬鈴薯是全球僅次于水稻、玉米和小麥的第四大重要糧食作物, 世界上已經(jīng)有2/3的人口把馬鈴薯作為主糧消費(fèi), 全球每年消費(fèi)馬鈴薯約為3.0～3.3億噸。中國(guó)是世界馬鈴薯生產(chǎn)和消費(fèi)第一大國(guó)[2], 因此提高馬鈴薯塊莖中鋅含量, 對(duì)于緩解人體缺鋅的現(xiàn)狀具有積極意義。

鋅以Zn2+或有機(jī)復(fù)合物的形式從植物根部運(yùn)輸?shù)饺~肉細(xì)胞, 參與各種生理生化過(guò)程; 也可以存儲(chǔ)在液泡中,避免過(guò)量Zn2+的傷害; 或者通過(guò)韌皮部再分配[3]。這些過(guò)程都與植物鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族的調(diào)控密不可分[4]。因此, 從分子水平研究這些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族在鋅吸收和分配的動(dòng)態(tài)平衡中的作用, 有助于增加植物可食用部位的鋅含量。近年在擬南芥[5-12]、水稻[13-16]、苜蓿[4]和番茄[17]等植物中發(fā)現(xiàn)了多種鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族, 并利用酵母互補(bǔ)技術(shù)或轉(zhuǎn)基因手段在水稻[16]、大麥[18-19]、木薯[20]等作物中開展了其調(diào)控機(jī)制的研究。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族按其功能不同可分為吸收蛋白和排出蛋白兩大類: 吸收蛋白主要有鐵調(diào)控轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族(Zinc-iron transporter protein, ZIP)[21]和自然抗性相關(guān)巨噬蛋白家族(Natural resistance associated macrophage protein, NRAMP)[22], 鋅吸收蛋白主要位于細(xì)胞質(zhì)膜上, 功能是將Zn2+等二價(jià)陽(yáng)離子跨膜運(yùn)轉(zhuǎn)到細(xì)胞內(nèi), 參與植物細(xì)胞中多種生理生化反應(yīng); 鋅排出蛋白包括CDF蛋白家族(Cation diffusion facilitator protein family,CDF)[23]和重金屬ATP酶家族P1B-ATPase (Heavy metal ATPase, HMA)[24]等, 其主要位于細(xì)胞質(zhì)膜和液泡膜上,功能是將Zn2+排出細(xì)胞質(zhì)或運(yùn)載到液泡進(jìn)行區(qū)域化隔離,在植物耐受鋅脅迫中起到防御作用[25-26]。鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族基因成員可在植物不同組織, 包括根、莖、葉等部位表達(dá),表明其不僅與根吸收有關(guān), 同時(shí)與細(xì)胞內(nèi)鋅的再分配和平衡相關(guān)[6,27]。

ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族廣泛存在于動(dòng)物、植物、細(xì)菌和原生生物中[21]。ZRT1和ZRT2是首次在酵母細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的ZIP家族成員[28]。隨后Eide等[5]發(fā)現(xiàn)了IRT1轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因。ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列一般為309～406個(gè)序列,具有8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 其N末端和C末端均位于細(xì)胞膜的外側(cè), 在第III～I(xiàn)V結(jié)構(gòu)域之間一段氨基酸序列稱為可變區(qū), 可變區(qū)是富含His的區(qū)域, 在第IV～V之間是允許金屬離子通過(guò)的位點(diǎn), 在第II～I(xiàn)II結(jié)構(gòu)域之間是轉(zhuǎn)運(yùn)底物的最初結(jié)合位點(diǎn)。ZIP基因家族的功能分析表明, 該基因家族在從胞外向胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)并在胞內(nèi)進(jìn)行鋅運(yùn)輸過(guò)程中起重要作用。另外, 其轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象也包括其他二價(jià)陽(yáng)離子, 如:Fe2+、Mn2+及Cd2+, 但成員間往往具有不同的轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)象及專一性[7]。

在馬鈴薯中, 前期通過(guò)ZIP家族基因生物信息學(xué)分析,鑒定出12個(gè)馬鈴薯ZIP基因, 大多數(shù)含有8個(gè)跨膜區(qū)域。在III和IV結(jié)構(gòu)域之間, 有一個(gè)可變區(qū),StZIP12在可變區(qū)中His的數(shù)量最多, 且低鋅品種的馬鈴薯塊莖中StZIP12表達(dá)量受到誘導(dǎo), 推測(cè)StZIP12在馬鈴薯塊莖鋅富集中的作用可能存在潛在作用[29]。本研究在前期研究基礎(chǔ)上, 克隆了馬鈴薯StZIP12基因, 并通過(guò)異源酵母互補(bǔ)試驗(yàn)和遺傳轉(zhuǎn)化手段證實(shí)了StZIP12在體外和體內(nèi)能夠增強(qiáng)馬鈴薯鋅吸收, 在馬鈴薯鋅富集過(guò)程中具有重要作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鈴薯(Solanum tuberosumL.)品種‘粵引85-38’、‘鄂薯3號(hào)’, 哥倫比亞型擬南芥[Arabidopsis thaliana(ecotype Columbia)], super1300植物雙元表達(dá)載體, pJG4-5(pB42AD)酵母表達(dá)載體, pCAMBIA2300N植物表達(dá)載體均由本實(shí)驗(yàn)室保存。酵母野生型菌株: (WT)DEY1457, 鋅吸收障礙突變體酵母菌株(zrt1zrt2) ZHY3 (MATα ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3 zrt1::LEU2 zrt2:: HIS3)由David Eide, Ph.D. Professor and Chair, Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison贈(zèng)與。

1.2 基因克隆及載體構(gòu)建

根據(jù)文獻(xiàn)[29]和馬鈴薯基因組網(wǎng)站(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/index.shtml)結(jié)合, 在參考序列5′UTR和3′UTR兩端設(shè)計(jì)2條基因特異引物StZIP12-F1:5′-GAAAGAATTTCATTCCCTCGACCCC-3′和StZIP12-R1:5′-ATAATTGCTTGCTTGGCTGATTTT-3′, 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將StZIP12的開放閱讀框(open reading frame, ORF)構(gòu)建到super1300～GFP雙元表達(dá)載體上, 最終形成super:GFP～StZIP12載體。StZIP12的編碼區(qū)(ORF)構(gòu)建到pCAMBIA2300～35S載體上, 形成35S:StZIP12。將StZIP12的ORF構(gòu)建到酵母表達(dá)載體pJG4-5 (pB42AD)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

定量PCR儀為CFX96 (美國(guó)Bio-Rad公司), 預(yù)混液使用SYBR Premix ExTaqII (Tli RNaseH Plus) (TaKaRa)。反應(yīng)為25 μL, 其中1 μL cDNA作為模板。程序?yàn)閮刹椒?95℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 60 ℃ 30 s, 共39個(gè)循環(huán)。EF1-α作為內(nèi)參基因。數(shù)據(jù)分析采用2-ΔΔCt方法。

1.4 亞細(xì)胞定位

取短日照培養(yǎng)4～5周的擬南芥蓮座葉片, 去掉葉脈取中間部位, 將葉片切成1 mm左右的細(xì)葉條, 然后置于預(yù)先備好的酶解液中, 使切好的葉條可以與酶液充分接觸;用黑色塑料袋包裹燒杯, 置于水平搖床上, 以60轉(zhuǎn) min-1的轉(zhuǎn)速消化3～4 h, 此時(shí), 酶液由褐色變?yōu)榫G色, 鏡檢酶解效果, 擬南芥葉肉原生質(zhì)體直徑約為30～50 μm; 用300目的網(wǎng)篩過(guò)濾包含有原生質(zhì)體的酶液于圓底離心管中,36×g離心1～2 min; 去掉上清, 加預(yù)冷的W5溶液, 緩緩懸起原生質(zhì)體, 36×g離心再沉淀1～2 min; 輕輕吸取上清, 加入適量預(yù)冷的W5溶液, 使原生質(zhì)體濃度達(dá)到1×105～2×105mL-1, 冰上放置30 min; 60×g離心1 min, 以1×105～2×105mL-1濃度重懸于MMg溶液; 取20 μL質(zhì)粒DNA于1.5 mL的離心管中, 加200 μL的原生質(zhì)體(4×104個(gè)原生質(zhì)體), 輕輕混勻; 加入220 μL的PEG/Ca2+溶液, 輕輕混勻, 23℃放置15～30 min; 加入800 μL的W5溶液, 充分輕輕混勻; 2×g離心1 min, 去掉PEG; 輕輕重懸原生質(zhì)體于1 mL的W5溶液中; 放于23℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng), 12～16 h之后CCD觀察。

1.5 酵母功能互補(bǔ)

將酵母突變體菌株ZHY3 (zrt1zrt2) (MATα ade6 can1 his3 leu2 trp1 ura3 zrt1::LEU2 zrt2::HIS3)接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上28℃活化2 d; 挑取生長(zhǎng)良好的單菌落用三角瓶加入25.0 mL YPD液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng), 搖菌8～12 h (28℃,200轉(zhuǎn) min-1)至OD600=1.0; 660×g(25℃)離心5 min去上清, 用25.0 mL無(wú)菌水震蕩懸浮清洗酵母菌, 再次離心5 min去上清; 加入25.0 mL無(wú)菌水震蕩懸浮, 吸取1.0 mL菌液到無(wú)菌的1.5 mL離心管中; 2656×g離心5 min, 棄上清;用100 μL one-step buffer懸浮; 加入6 μL預(yù)先沸水浴20 min的鮭魚精; 1 μg載體DNA (空載、融合或報(bào)告子)渦旋混合均勻; 45℃水浴30 min, 每隔10 min渦旋一次; 取約200 μL懸浮液涂布在SD-Trp選擇培養(yǎng)基上, 28℃暗培養(yǎng)2～3 d; 待長(zhǎng)出白色單菌落后, 挑取菌落進(jìn)行PCR驗(yàn)證,獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌株; 將鑒定好的轉(zhuǎn)化菌株加入10 mL液體SD-Trp培養(yǎng)基28℃, 200轉(zhuǎn)min-1培養(yǎng)至OD600=1.0; 將各菌株的菌液按照細(xì)胞濃度分別做10-1、10-2、10-3、10-4濃度梯度稀釋; 取各菌液2.5 μL, 按照順序?qū)⒕悍謩e滴在含Zn2+、Zn2++2 mmol L-1EGTA、Zn2++5 mmol L-1EGTA、Zn2++7.5 mmol L-1EGTA的SD-Trp酵母異源功能互補(bǔ)驗(yàn)證的培養(yǎng)基上, 28℃培養(yǎng)2～3 d; 觀察并記錄個(gè)菌株的生長(zhǎng)情況, 照相記錄。

1.6 馬鈴薯遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株缺鋅處理

采用的農(nóng)桿菌菌株為GV3101, 受體材料為馬鈴薯鄂薯3號(hào), 具體方法參考文獻(xiàn)[30]。

轉(zhuǎn)基因組培苗處理: 采用莖段培養(yǎng)的方式將轉(zhuǎn)基因和對(duì)照植株分別轉(zhuǎn)入無(wú)鋅和正常鋅培養(yǎng)的MS培養(yǎng)基中,放入人工氣候箱(溫度25 ℃/ 18 ℃,光照16 h/8 h), 培養(yǎng)20 d后, 每個(gè)處理各取5株進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和鋅含量測(cè)定。

轉(zhuǎn)基因植株沙培處理: 取生根21 d的馬鈴薯轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照植株, 放入去離子水中蓋上保鮮膜平衡2 d, 然后移栽到裝有石英砂的花盆中, 放入人工氣候箱中進(jìn)行培養(yǎng)。每隔3 d分別施入Hoagland營(yíng)養(yǎng)液和無(wú)鋅Hoagland營(yíng)養(yǎng)液, 直到收獲。每個(gè)處理各取5株進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)和鋅含量測(cè)定。

1.7 鋅含量測(cè)定

收獲后, 塊莖在65℃下干燥1周。25.0 mg樣品分別用5.0 mL HNO3和1.0 mL HClO4在150℃下消化5 h。采用ZA3300型火焰原子吸收分光光度計(jì)(日本日立公司;波長(zhǎng)為213.856)進(jìn)行鋅含量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 StZIP12基因的克隆及跨膜結(jié)構(gòu)域分析

利用前人研究的StZIP12基因序列, 設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。結(jié)果表明,StZIP12基因全長(zhǎng)1820 bp(圖1-A), 包含245 bp的5′UTR, 351 bp的3′UTR, 編碼區(qū)長(zhǎng)度為1224 bp, 編碼含有407個(gè)氨基酸的蛋白(圖1-B)。進(jìn)一步利用 CCTOP (http://cctop.enzim.ttk.mta.hu/?Ref=labworm)軟件對(duì)StZIP12蛋白在細(xì)胞中的跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析, 預(yù)測(cè)到8個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 在第3和第4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域之間有1個(gè)長(zhǎng)環(huán)區(qū)(圖1-C)。

圖1 StZIP12基因的克隆及跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig. 1 Cloning and transmembrane domain analysis of StZIP12 geneA: StZIP12基因的分離; 1、2、3泳道均為馬鈴薯StZIP12基因, M為DL2000 DNA marker。B: StZIP12序列分析, 灰色字母代表氨基酸序列。C: StZIP12跨膜結(jié)構(gòu)域分析, 黃色區(qū)域代表跨膜結(jié)構(gòu)部分, 灰色區(qū)域代表細(xì)胞膜。A: the isolation of StZIP12 gene. Lane 1, 2, and 3 are all potato StZIP12 genes. M2000 is DL 2000 DNA marker. B: the sequence analysis of StZIP12, gray letters in the background represent amino acid sequences. C: StZIP12 transmembrane domain analysis. The yellow area represents the transmembrane structure and the gray area represents the cell membrane.

2.2 StZIP12蛋白亞細(xì)胞定位

為確定 StZIP12蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位, 構(gòu)建了StZIP12基因的瞬時(shí)表達(dá)載體進(jìn)行亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明,GFP空載的信號(hào)存在于整個(gè)細(xì)胞, 而GFP-StZIP12融合蛋白主要存在于細(xì)胞膜上(圖2)。因此,StZIP12基因編碼的是一個(gè)細(xì)胞膜定位的蛋白。

圖2 StZIP12蛋白亞細(xì)胞定位在細(xì)胞膜上Fig. 2 StZIP12 protein is subcellular localized on the cell membrane標(biāo)尺為50 μm。Bar: 50 μm.

2.3 StZIP12基因表達(dá)特性分析

分析StZIP12基因在新葉、老葉、根、莖、匍匐莖、小薯以及成熟薯中的表達(dá)量發(fā)現(xiàn),StZIP12在馬鈴薯各組織中均有表達(dá), 且在新葉中表達(dá)量顯著高于其他組織, 其次為老葉和根, 在薯塊中表達(dá)量最低(圖3-A)。

分析不同濃度鋅溶液噴施處理下StZIP12的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn), 隨著噴施鋅濃度的增大,StZIP12的表達(dá)量逐漸受到抑制(圖3-B)。

圖3 StZIP12的表達(dá)分析Fig. 3 Relative expression pattern of StZIP12 genes誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤, 多重比較采用Duncan分析法, 不同小寫字母代表顯著水平(P ＜ 0.05)。Error bar represents standard error. Duncan’s analysis method is used for multiple comparisons. Different lowercase represents significant difference at P ＜ 0.05.

2.4 StZIP12異源酵母功能互補(bǔ)分析

為明確StZIP12蛋白對(duì)于鋅吸收的功能, 構(gòu)建StZIP12酵母表達(dá)載體StZIP12-pJG4-5, 轉(zhuǎn)化到鋅吸收障礙突變體(zrt1zrt2)ZHY3中, 空載體作為對(duì)照。在培養(yǎng)基上進(jìn)行不同鋅濃度處理。結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)入空載體的鋅吸收缺陷型酵母突變體zrt1 /zrt2隨著菌液稀釋倍數(shù)的增大和鋅吸收障礙螯合劑EGTA濃度的增加, 生長(zhǎng)受到抑制; 與對(duì)照相比, 轉(zhuǎn)StZIP12的酵母突變體表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)狀態(tài)(圖4)。表明馬鈴薯StZIP12在鋅吸收缺陷型酵母突變體zrt1 /zrt2中能夠恢復(fù)其對(duì)Zn的吸收, 證明StZIP12在Zn吸收過(guò)程中起著重要的作用。

(圖4)

圖4 StZIP12對(duì)酵母鋅吸收障礙突變體功能互補(bǔ)Fig. 4 Functional complementation of StZIP12 to yeast zinc uptake deficient mutantVC: 空載體對(duì)照; 10-1～10-4代表菌液稀釋濃度。VC: the empty vector controls; 10-1-10-4 represent the dilution concentration of bacterial solution, respectively.

2.5 過(guò)量表達(dá)StZIP12增加馬鈴薯鋅含量

為進(jìn)一步驗(yàn)證StZIP12的功能, 構(gòu)建過(guò)量表達(dá)載體并利用農(nóng)桿菌進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化, 共獲得7株陽(yáng)性植株(圖5)。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系定量PCR檢測(cè)Fig. 5 Detection of transgenic lines by qRT-PCRES3: 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ? OE-26、OE-27、OE-28、OE-31、OE-32、OE-47、OE-67為過(guò)表達(dá)株系。ES3: non transgenic control; OE-26, OE-27, OE-28, OE-31, OE-32,OE-47, and OE-67 are overexpressed StZIP12 lines.

對(duì)轉(zhuǎn)基因株系及對(duì)照植株的組培苗進(jìn)行缺鋅處理發(fā)現(xiàn), 在正常鋅培養(yǎng)條件下, 轉(zhuǎn)基因株系OE-26和OE-31與對(duì)照ES3在總根長(zhǎng)、地上部株高上差異不顯著。在缺鋅培養(yǎng)條件下, 轉(zhuǎn)基因株系OE-26和OE-31與對(duì)照ES3在地上部株高和總根長(zhǎng)上差異顯著, 且在地上部和根部鮮重上OE-26顯著高于ES3。對(duì)地上部和根部鋅含量進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn), 在正常鋅培養(yǎng)條件下, 轉(zhuǎn)基因株系OE-26和OE-31與對(duì)照ES3鋅含量差異不顯著。缺鋅處理顯著降低了轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照植株的地上部和根部鋅含量。但在缺鋅培養(yǎng)條件下, OE-26地上部和根部鋅含量顯著高于對(duì)照植株, OE-31地上部和根部鋅含量也略高于對(duì)照植株, 但差異未達(dá)顯著水平(圖6-A)。

根體積能反映根粗。對(duì)總根體積進(jìn)行分級(jí)發(fā)現(xiàn), 在缺鋅處理下, 對(duì)照植株V＞0.400的體積比由63%降低到20%,0.000＜V≤0.100的體積比由4%上升到16%; 而OE-26和OE-31兩個(gè)株系的根體積比變化不大, V＞0.400的體積比分別為77%和58%, 0.000＜V≤0.10的體積比分別為2%和4%。說(shuō)明在缺鋅處理下, 2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)所受影響較小(圖6-B, C)。

(圖6)

圖6 缺鋅處理下馬鈴薯轉(zhuǎn)基因組培苗的表型及鋅含量Fig. 6 Phenotype and zinc content of potato transgenic tissue culture seedlings under zinc deficiency treatmentsA: 植株表型及鋅含量分析, 誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤, 多重比較采用Duncan分析法, 不同小寫字母代表顯著水平(P ＜ 0.05)。B: 植株表型圖片; C: 根體積分級(jí)。CK: 正常鋅; -Zn: 缺鋅處理。A: plant phenotype analysis. Error bar represents standard error. Duncan’s analysis method is used for multiple comparisons. Different lowercase represents significant difference at P ＜ 0.05. B: plant phenotype; C: the classification of root volume. CK: the normal zinc treatment;-Zn: zinc deficiency treatment.

為進(jìn)一步探究StZIP12在馬鈴薯塊莖鋅吸收過(guò)程中的功能, 本研究采用了石英砂培養(yǎng)下的鋅處理試驗(yàn)。結(jié)果表明, 在正常鋅濃度條件下, 過(guò)表達(dá)株系植株高度低于對(duì)照植株, 其中OE-31與對(duì)照差異顯著; 但在塊莖鋅含量上,轉(zhuǎn)基因株系與對(duì)照植株差異不顯著。在缺鋅培養(yǎng)下, 2個(gè)過(guò)表達(dá)株系的塊莖鋅含量高于對(duì)照, 分別比對(duì)照提高22.00%和32.95%, 且差異達(dá)到顯著水平(圖7)。

圖7 正常和缺鋅處理下下轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株表型、株高和鋅含量Fig. 7 Phenotype, plant height, and zinc content of transgenic lines under zinc deficiency treatmentCK: 正常鋅; -Zn: 缺鋅處理。誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)誤, 多重比較采用Duncan分析法, 不同小寫字母代表顯著水平(P ＜ 0.05)。CK: normal zinc treatment; -Zn: zinc deficiency treatment. Error bar represents standard error. Duncan’s analysis method is used for multiple comparisons. Different lowercase represents significant difference at P ＜ 0.05.

3 討論

植物吸收鋅主要分為3個(gè)階段, 即鋅的吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)和儲(chǔ)存。這些過(guò)程與植物鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白密不可分, 按鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族功能的不同可分為吸收蛋白和排出蛋白, ZIP家族屬于吸收蛋白家族, 該家族的基因表達(dá)變化會(huì)影響鋅的吸收和分配。迄今為止, 從植物中發(fā)現(xiàn)鑒定的ZIP家族成員大約有100多個(gè), 并對(duì)其功能進(jìn)行了研究[31]。

據(jù)報(bào)道, 擬南芥中存在15個(gè)ZIP家族成員, At-ZIP1～AtZIP12和AtIRT1～AtIRT13[7]。IRT1和ZRT1是最早被分離出來(lái)的ZIP家族成員。IRT1是擬南芥在缺鐵條件下在根部表達(dá)的一種蛋白, 主要參與了擬南芥在根系對(duì)鐵離子吸收的生理生化過(guò)程[5]。ZRT1和ZRT2分別是酵母中Zn2+吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)的高、低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白, 參與了Zn2+的跨膜運(yùn)輸[28]。最近在擬南芥中新發(fā)現(xiàn)一個(gè)鋅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白AtZNE1, 亞細(xì)胞定位于高爾基體上, 對(duì)于葉片中鋅離子濃度的平衡起到重要作用[6]。水稻是研究ZIP基因較多的作物之一, 共預(yù)測(cè)出17個(gè)ZIP家族成員。異源酵母互補(bǔ)雜交試驗(yàn)已經(jīng)驗(yàn)證了OsIRT1、OsIRT2、OsZIP1～OsZIP5、OsZIP7～OsZIP9等家族成員均具有轉(zhuǎn)運(yùn)鋅和鐵的功能[15,21,32], 且研究表明OsZIP5和OsZIP9在鋅和鈣的吸收上表現(xiàn)出協(xié)同作用[33]。此外, 還鑒定和研究了ZIP家族成員在其他物種中的功能, 如大麥[18]、玉米[34]。目前在馬鈴薯中, 共鑒定到了12個(gè)ZIP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StZIP1～StZIP12, 且發(fā)現(xiàn)StZIP12在可變區(qū)中His的數(shù)量最多, 暗示它具有很強(qiáng)的金屬離子結(jié)合能力。缺鋅條件下, 在高、低鋅品種(系)馬鈴薯塊莖中發(fā)現(xiàn)了4個(gè)差異表達(dá)基因StZIP6、StZIP9、StZIP11和StZIP12, 這4個(gè)基因在高鋅品種中表達(dá)量增加, 而在低鋅品種中表達(dá)量減少, 其中,StZIP12的表達(dá)水平最高, 分別是StZIP6和StZIP9的5倍和12倍以上, 推測(cè)StZIP12在馬鈴薯塊莖鋅富集中的作用可能更為顯著[29]。

本研究克隆了StZIP12基因, 表達(dá)模式分析顯示其在馬鈴薯所有組織中均有表達(dá), 尤其在新葉中表達(dá)量最高,且受低鋅誘導(dǎo)。異源酵母互補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)了StZIP12基因能夠互補(bǔ)鋅吸收障礙突變體ZHY3(zrt1/zrt2)的功能, 說(shuō)明了StZIP12基因在體外具有鋅吸收的功能。與前人在擬南芥[5]、水稻[15,21,32]、柑橘[35]的研究結(jié)果一致。此外利用轉(zhuǎn)基因手段, 過(guò)表達(dá)StZIP12基因于馬鈴薯品種鄂薯3號(hào),提高了轉(zhuǎn)基因組培苗的鋅含量和轉(zhuǎn)基因植株塊莖的鋅含量, 表明StZIP12在鋅的吸收和富集過(guò)程中起著重要的功能。這與前人研究基本一致。如過(guò)量表達(dá)AtZIP1提高木薯根部鋅含量9倍以上[20]。過(guò)量表達(dá)AtZIP1提高了大麥種子鋅含量2倍以上[19]。在水稻中,OsZIP1的異位表達(dá)提高了煙草和小米中的鋅含量[36],OsZIP4、OsZIP5、OsZIP8和OsZIP9的超表達(dá)都顯著提高了根部鋅的富集, 降低了植株地上部分的鋅含量[14,16,37]。OsZIP4的過(guò)量表達(dá)于甘薯塊根鋅含量提高[39]。OsZIP7對(duì)鋅在根系木質(zhì)部卸載和節(jié)部的維管束間轉(zhuǎn)移中起著不可或缺的作用, 優(yōu)先向正在發(fā)育的組織和水稻籽粒輸送鋅[40]。過(guò)量表達(dá)OsZIP7于擬南芥, 轉(zhuǎn)基因植株地上部鋅含量提高了25%[41]。