王方園,王洋嘯龍,魏曉英

(齊齊哈爾市第一醫(yī)院普外二科,黑龍江 齊齊哈爾 161000)

胃癌是最常見的癌癥之一。以胃腺癌(gastric adenocarcinoma GAC)為最常見的組織學類型,造成了巨大的醫(yī)療負擔,是世界范圍內最常見的癌癥死亡原因之一。目前針對胃癌的其他分子靶向治療方式日益豐富,但是有效率和適用范圍亟待提高。臨床急切需要尋找新的診斷和治療靶點,針對靶點治療該病[1]。越來越多的專業(yè)將研究的經歷和注意力放在了腫瘤發(fā)病的分子機制上。硫氧還蛋白還原酶,簡稱為TrxR。它被解釋為是一種NADPH依賴,同時包含F(xiàn)AD結構域一種酶,這種酶是二聚體硒酶,是吡啶核苷酸-二硫化物氧化還原酶之一。細胞氧化還原調節(jié)網絡的核心角色之一是TrxR/Trx系統(tǒng)參與的,文獻報道[2],研究證實了TrxR/Trx系統(tǒng)參與了癌癥的發(fā)生發(fā)展,并在癌癥中起到了重要的作用。目前TrxR1與GAC的研究較少,尚無關于TrxR1和GAC患者預后的報道。本研究分析TrxR1在GAC中的表達情況,探討TrxR1表達與GAC患者診療的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017-02～2021-08齊齊哈爾市第一醫(yī)院門診收治入院的胃腺癌患者100 例,收集的組織是胃癌組織和距腫瘤切緣約1.5cm癌旁組織標本作為研究對象,分成兩個組,實驗組胃癌組織50例和對照組癌旁組織50例。實驗組男28例,女22例;年齡45～75歲,平均(60.54±4.12)歲。對照組男26例,女24例;年齡43～76歲,平均(59.02±3.86)歲。兩組的一般資料經過數(shù)據(jù)統(tǒng)計,無統(tǒng)計學意義(P>0.05),可以用來臨床研究。參與研究的患者和家屬了解項目內容具有知情同意權,經齊齊哈爾市第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準項目研究內容。

納入標準:(1)收集到的患者病歷基本資料、現(xiàn)病史、既往史、病理診斷、輔助檢查資料齊全完整,無漏項;(2)患者確診胃癌疾病必須符合 《胃癌規(guī)范化診療指南》中對胃癌的診斷標準;(3)患者意識清楚,符合手術適應證;(4)患者無其他系統(tǒng)疾病;(5)患者能夠配合治療,按時隨訪。

排除標準:(1)胃癌合并其他疾病的患者;(2)既往手術史行放療、化療及藥物治療;(3)不能完成隨訪資料提供者;(4)胃癌合并全身感染等疾病。

1.2 研究方法

(1)免疫組化實驗:胃腺癌組織和癌旁組織中TrxR1的表達情況,采用免疫組化SP法完成,操作方法:將收集的胃癌組織和癌旁組織分別從1開始全部編號,甲醛固定,石蠟包埋切片,按照免疫組化SP試劑盒說明書操作,滴加生物素工作液12h后,洗片再滴加鏈霉素抗生物素-過氧化物酶溶液孵育12h,顯色用DAB染色,再用蘇木素復染,酒精依次濃度脫水,二甲苯封片,完成后在顯微鏡下觀察組織的染色情況記錄數(shù)據(jù)。(2)Western blot實驗:用RIPA緩沖液,提取組織總蛋白,在10%SDS-PAGE電泳后轉移到PVDF嚴格按照試劑盒(鼠抗人TrxR1多克隆抗體檢測試劑盒,美國Sigma公司)根據(jù)試劑盒內的操作說明,以酶標儀讀數(shù)來判定實驗的結果數(shù)據(jù)。試劑盒冷藏保存,取出試劑盒后在室溫下放置15～30min左右再開始操作。每次加樣時間在5min內完成,目的是為了避免誤差,加樣器加樣校對準確性。在室溫下用5%無脂牛奶阻斷2h后,在4℃下用抗PLAGL2的一級抗體處理膜,在室溫下與二級抗體孵育1h,并用ECL檢測試劑盒檢測,完成實驗操作,觀察成像結果。染色后的組織切片通過顯微鏡采集,使用軟件對圖片進行光密度值檢測,IOD=陽性面積×平均光密度。(3)RT-PCR實驗:用TRIzol試劑裂解細胞,按試劑盒說明書步驟完成實驗操作,從胃癌組織和癌旁組織中分別提取RNA,再逆轉錄試劑盒合成cDNA。用SYBR Green (Vazyme,Nanjing, China)進行qPCR擴增。擴增條件是90℃,15min,在95℃,20秒,60℃,90秒,循環(huán)45次。TrxR1的qPCR引物:TrxR1上游引物5’-AGCTCA GTC CAC CAA TAG TGA-3’,下游引物5’-GGTATT TTT CCA GTC TTT TCA T-3'。計算目的基因的相對轉錄水平采用相對定量法(2-△△CT法)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 免疫組化的表達情況

50例患者的胃腺癌組織標本中,發(fā)現(xiàn)TrxR1的陽性率為82.0%(41/50),癌旁組織標本中,發(fā)現(xiàn)TrxR1的陽性率為18.0%(9/50)。胃腺癌組織的TrxR1陽性率顯著高于癌旁組織的TrxR1陽性率,有統(tǒng)計學意義(χ2=6.04,P<0.01)。

2.2 Western blot的表達情況

實驗組的胃癌組織中檢測TrxR1蛋白表達含量為(5.45±1.21),對照組癌旁組織中檢測TrxR1蛋白表達含量為(2.45±1.01),實驗組數(shù)值顯著高于對照組數(shù)值,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

表1 Western blot實驗結果比較TrxR1在實驗組和對照組的表達情況

2.3 RT-PCR的RNA 表達情況

實驗組的胃癌組織中檢測TrxR1 RNA表達為(3.57±1.04), 對照組癌旁組織中檢測TrxR1 RNA表達為(0.85±0.31),實驗組顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),見表2。

表2 RT-PCR實驗結果比較TrxR1在實驗組和對照組的RNA 表達情況

3 討論

胃癌是全世界發(fā)布率極高的惡性腫瘤,全球排在第3位,病死率排在第5位,嚴重影響到我國的整體生存質量[3]。胃癌的發(fā)病原因歸結為其癌細胞的增殖能力十分強,且凋亡能力弱引發(fā)的,值得臨床關注[4]。因此尋找抑制胃癌細胞的過度增殖,加速胃癌細胞的凋亡將成為人們研究的關注點,這對以上問題找出生物學靶點,在胃癌治療的進展和預后有著積極的指導意義。

人體主要的抗氧化系統(tǒng)之一包括硫氧還蛋白,它由 NADPH 、Trx1和TrxR共同構成。硫氧還蛋白他主要是能夠調節(jié)機體的氧化還原反應,還可以調節(jié)機體的免疫應答反應,另外可以調節(jié)機體的轉錄因子反應,調節(jié)的機體反應對人體有著重要的意義。TrxR 是二聚體黃素酶,參與人體細胞的增殖作用凋亡作用,并且起到重要的參與作用,關系密切。故此很多學者將TrxR1用于腫瘤的研究,同樣發(fā)現(xiàn)TrxR1在腫瘤中也高表達,具有參與作用[5]。文獻報道發(fā)現(xiàn),TrxR1在肺癌、乳腺癌、肝癌、結腸癌、直腸癌等很多腫瘤中檢測證實都出現(xiàn)高表達的現(xiàn)象,同時證實了它在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的整個過程中及腫瘤預后都有重要的作用[6,7]。研究[8]發(fā)現(xiàn),在同一患者中檢測TrxR1發(fā)現(xiàn),其正常乳腺組織和其乳腺癌組織中,乳腺癌組織的TrxR1顯著升高,出現(xiàn)高表達現(xiàn)象,統(tǒng)計學具有意義。文獻報道TrxR1在肝細胞癌中高表達,下調TrxR1的水平可抑制Huh7和SK-Hep-1肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲,與肺癌患者預后不良相關。

本研究結果顯示,免疫組化檢測50例患者的胃腺癌組織標本中,TrxR1的陽性率為 82.0% ,癌旁組織陽性率為18.0%。胃腺癌組織的 TrxR1 陽性率顯著高于癌旁組織的TrxR1陽性率,有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。Western blot檢測實驗組TrxR1蛋白表達含量為(5.45±1.21),對照組TrxR1蛋白表達含量為(2.45±1.01),兩組數(shù)據(jù)比較,有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。RT-PCR結果,胃癌組織中TrxR1蛋RNA表達和癌旁組織TrxR1RNA表達比較,實驗組顯著高于對照組(P<0.01)。與吳俊超研究結果一致[9],該檢測80例胃癌患者組織標本中,有52例( 65%) TrxR1在胃癌組織中高表達,28例( 35%) TrxR1 在癌旁組織中高表達(P<0.05)。以上研究都說明了TrxR1在胃癌早期診斷方法和干預手段中起到重要的作用,如果針對TrxR1進一步研究診療能夠提高患者的5年生存率,可以節(jié)省經濟效益。

綜上所述,本研究證實了在胃癌中檢測TrxR1高表達,提示該因子與胃癌的診斷和不良預后呈正相關性,TrxR1可能是胃癌診療的靶基因,為胃癌的的治療提供實驗依據(jù)及新的思路。以胃癌生物學標記為胃癌發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)和深層資料,同時可為胃癌的早期診斷提供診斷依據(jù)和治療靶點,能夠提高胃癌患者的早期檢出率和有效治療率,對醫(yī)療具有重大的意義。未來我們將研究的焦點集中在 TrxR1 在胃癌發(fā)生過程中的分子機制中,期待發(fā)現(xiàn) TrxR1在胃癌化療藥物方面的研究意義,提高胃癌患者的生存率,提高生存質量,延長生存時間。