張倩倩,李冰圳,王智,馮曉宇,姬佳誠,陳貴林

(1內(nèi)蒙古大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;2內(nèi)蒙古自治區(qū)中蒙藥材規(guī)范化生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020;3牧草與特色作物生物學(xué)教育部重點實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020)

鎖陽(Cynomoriumsongaricum),為鎖陽科、鎖陽屬、多年生的全寄生草本植物,又名鐵棒槌、地毛球、烏蘭高腰(蒙語),是中藥和蒙藥中的常用藥物,具有補腎陽、益精血之功效,常用于治療陽痿精虛、大便燥結(jié)等[1]。近年研究結(jié)果表明,鎖陽具有多種藥理活性,如抗腫瘤、抗氧化、抗病毒等[2-5]。鎖陽廣泛分布于我國內(nèi)蒙古、新疆、甘肅、青海、寧夏等地區(qū)[6]。我國分布的鎖陽多寄生于蒺藜科(Zygophyllaceae)白刺屬植物的根部。

黃酮類化合物是普遍存在于植物中的一類次生代謝物,也是藥用植物鎖陽中的重要活性成分,具有抗氧化、抗炎等多種生理功能[7-8]。黃酮類化合物的合成是苯丙烷代謝途徑的1個分支,經(jīng)多種酶催化合成,如苯丙氨酸解氨酶(Phenylalamineammonia-lynsey,PAL)、肉桂酸羥化酶(Cinnamate4-hydroxylase,C4H)和查爾酮合酶(Chalconesynthase,CHS)等。兒茶素是由黃酮代謝途徑合成,具有重要的藥理活性,可以作為鎖陽的指標(biāo)性成分[9-10]。

鎖陽在自然條件下的繁殖率不高,在種子脫落后會經(jīng)歷持續(xù)的沙埋過程,并在適宜的生長條件下完成鎖陽種子萌發(fā)、吸器發(fā)育及器官形成等幾個生長發(fā)育階段,通常需要4—6年才能完成從寄生到出土的過程[11-12]。不同生育期鎖陽中鞣質(zhì)、淀粉和蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分的含量呈現(xiàn)出不同的變化趨勢[13-14]。無霜期、全年日照時數(shù)和年平均蒸發(fā)量等環(huán)境因子對鎖陽有效成分的積累也具有明顯影響[15]。此外,有研究表明結(jié)實期是蒽醌類和三萜的最佳收獲期,類黃酮化合物則在出土前期含量最高[16]。鎖陽的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)表明,肉質(zhì)莖和花序之間有280種差異代謝物,花序中黃酮醇和黃烷酮等化合物更豐富[17]。

目前,關(guān)于鎖陽的研究主要集中在藥理活性等方面,尚未完成基因組測序,對于其兒茶素生物合成途徑的研究更是未見報道。鎖陽肉質(zhì)莖是其主要的入藥部位,鎖陽花序則被丟棄,造成了資源的極大浪費。因此,本研究利用轉(zhuǎn)錄組技術(shù),對不同發(fā)育階段的鎖陽不同部位中黃酮類生物合成途徑相關(guān)基因進行分析,以揭示兒茶素生物合成的分子機制。本研究為瀕危藥用植物鎖陽生物功能基因的挖掘及利用提供了理論基礎(chǔ),對于鎖陽資源的綜合利用及其采收期的確定具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 植物材料

在內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市杭錦旗獨貴塔拉鎮(zhèn)(E 108°74′,N 39°84′)采集鎖陽。選擇鎖陽2個發(fā)育階段的不同部位作為試驗材料,即未成花鎖陽的莖上端(Cy-1)和莖下端(Cy-2),以及成花鎖陽的花序(Cy-3)、莖上端(Cy-4)和莖下端(Cy-5),見圖1。每組樣本3個生物學(xué)重復(fù)。將鎖陽去除須根后用蒸餾水洗凈,用干凈的毛巾吸干其表面水分后,放置于-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。上述樣品中,一部分用于轉(zhuǎn)錄組測序,另一部分用于兒茶素含量的測定。

圖1 鎖陽的不同發(fā)育階段以及不同部位Figure 1 Different developmental stages and different parts of C. songaricum注：A是未成花;B是成花后。Cy-1是莖上端;Cy-2是莖下端;Cy-3是花序;Cy-4是莖上端;Cy-5是莖下端。

1.2 文庫構(gòu)建及測序

使用pBIOZOL試劑盒提取鎖陽總RNA。cDNA文庫構(gòu)建及測序由華大基因完成。通過Illumina HiSeqTM 2000測序平臺,得到Raw reads,經(jīng)篩選過濾獲得Clean reads。使用TGICL和Trinity軟件進行組裝,形成Unigene[18-19]。

1.3 基因功能注釋及表達量分析

將Unigene序列比對到數(shù)據(jù)庫Nt、Nr、KEGG、COG和Swiss-Prot,根據(jù)條件E-value

使用軟件SOAP和FPKM (Fragments per kb per million fragments)值計算Unigene的表達量。對錯誤發(fā)現(xiàn)率(False discovery rate,FDR)≤0.001且倍數(shù)差異在2倍以上的基因進行差異表達分析[20]。

1.4 兒茶素含量測定

1.4.1 色譜條件 島津Prominence LC-20A高效液相色譜儀(日本)測定,色譜柱：ODS柱(C18,250 mm×4.6 mm,5 μm),流動相為0.04 mol/L枸櫞酸溶液-N, N二甲基甲酰胺-四氫呋喃(50∶4∶1),流速為1.0 mL/min,柱溫為35 ℃,進樣量為20 μL,檢測波長為280 nm[9,21]。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作 稱取兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品適量,加50%甲醇配制成164 μg/mL對照品溶液,進樣量依次為1、4、8、12、16、20 μL。依照上述色譜條件測定。以峰面積為縱坐標(biāo),進樣量為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=107 108x-105 6.4,R2=0.999 8。

1.4.3 供試品溶液 將鎖陽粉末過100目篩,稱取0.8 g置于250 mL圓底燒瓶中,加入100 mL的95%乙醇回流提取40 min,過濾,取濾液。將殘渣加入100 mL 95%乙醇再次回流提取20 min,過濾,合并濾液,減壓濃縮蒸干,加50%甲醇溶解并定容到25 mL容量瓶中,過0.45 μm濾膜,待測[21]。每個處理重復(fù)3次。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用軟件SPSS 19.0進行數(shù)據(jù)分析,運用單因素方差分析(ANOVA)比較不同處理間的差異顯著性(P<0.05),采用EXCEL統(tǒng)計數(shù)據(jù)和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)的整體評估及基因的功能注釋

對未成花鎖陽的莖上端(Cy-1)、莖下端(Cy-2)以及成花鎖陽的花序(Cy-3)、莖上端(Cy-4)和莖下端(Cy-5)進行Illumina測序,分別得到52 665 054條、55 323 034條、54 656 940條、54 272 468條、52 882 120條Clean reads。轉(zhuǎn)錄組測序和組裝數(shù)據(jù),見表1。

表1 測序和組裝數(shù)據(jù)的總結(jié)Table 1 Summary of the sequencing and assembly

由表1可知,組裝后在各樣本中分別獲得51 360、77 540、62 181、75 830、86 702個Unigenes,共獲得106 626個Unigenes。獲得序列的Q20值均大于98%,GC含量均大于46%。通過BLAST分析后,分別有59 547、46 362、32 466、33 609、21 040、39 939個Unigenes在Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫獲得注釋。

鎖陽Unigene 在Nr數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果,見圖2。

(a)序列相似度分布圖

由圖2可知,有41.4%的Unigenes的同源性較低(le-45

2.2 差異表達基因的GO分類

將篩選出來的差異表達基因(DEGs)進行GO分析,共有318 909個差異基因得到注釋,鎖陽不同發(fā)育階段、不同部位之間的差異基因數(shù)量不同。在生物學(xué)過程分類中,注釋到較多基因的詞條主要有“細(xì)胞過程(Cellular process)”“代謝過程(Metabolic process)”“單一生物過程(Single-organism process)”等;在細(xì)胞組分分類中,與“細(xì)胞(Cell)”“細(xì)胞器(Organelle)”“細(xì)胞部分(Cell part)”“膜(Membrane)”等相關(guān)的基因較多;在分子功能分類中,注釋到較多基因的詞條主要包括“催化活性(Catalytic activity)”“結(jié)合(Binding)”“轉(zhuǎn)運活性(Transporter activity)”等,與“結(jié)構(gòu)分子活性(Structural molecule activity)”相關(guān)的基因數(shù)量也較多。結(jié)果表明,這些途徑在鎖陽發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用。

2.3 差異表達基因的分析

鎖陽各部位中差異表達基因的數(shù)量及其表達情況,見圖3。

圖3 鎖陽中差異表達基因的數(shù)量Figure 3 Number of differential expressed genes in C. songaricum

由圖3可知,通過比較同一發(fā)育階段的不同部位(Cy-1 vs Cy-2、Cy-3 vs Cy-4、Cy-3 vs Cy-5、Cy-5 vs Cy-4)和同一部位不同發(fā)育階段(Cy-5 vs Cy-2、Cy-4 vs Cy-2)的DEGs表達量發(fā)現(xiàn),在Cy-1 vs Cy-2、Cy-3 vs Cy-4和Cy-3 vs Cy-5中,下調(diào)基因數(shù)量均高于上調(diào)基因數(shù)量,而在其他樣本中均表現(xiàn)為上調(diào)基因數(shù)量高于下調(diào)基因數(shù)量。在Cy-5 vs Cy-2、Cy-4 vs Cy-2中上調(diào)和下調(diào)表達的基因數(shù)量均較多,且在Cy-1 vs Cy-2、Cy-3 vs Cy-4中較少。與其他樣本相比,Cy-3 vs Cy-1、Cy-4 vs Cy-2、Cy-5 vs Cy-2中的上調(diào)基因數(shù)量較多,說明與出土前相比,鎖陽在出土后大量基因表達上調(diào)。結(jié)果表明,在鎖陽的不同發(fā)育階段,莖中的基因表達量始終較高,且成花鎖陽的整體基因表達量比未成花鎖陽高。

鎖陽不同發(fā)育階段的差異表達基因在KEGG中的通路注釋情況,見圖4。

圖4 基于KEGG通路分析鎖陽不同發(fā)育階段的差異表達基因Figure 4 Analysis of differential expressed genes in different developmental stages of C. songaricum based on KEGG pathway

由圖4可知,將差異表達基因進行KEGG通路分析,對于不同發(fā)育階段來說,各組樣本均在“全局和總覽圖”中的DEGs最多,主要包括次生代謝產(chǎn)物的生物合成,此外,翻譯過程、氨基酸代謝、碳水化合物代謝、脂質(zhì)代謝以及折疊、分選與降解途徑也注釋到較多的差異基因。各組樣本之間注釋到較多基因的通路大體相同,只在數(shù)量上有差異,Cy-5 vs Cy-2中注釋到的基因數(shù)量最多,Cy-1 vs Cy-3中注釋到的基因數(shù)量最少。結(jié)果表明,鎖陽在不同發(fā)育階段中,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、翻譯過程、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等過程十分活躍,對鎖陽的生長發(fā)育起著重要作用。

鎖陽不同部位的差異表達基因在KEGG中的通路注釋情況,見圖5。

圖5 基于KEGG通路分析鎖陽不同部位的差異表達基因Figure 5 Analysis of differential expressed genes in different parts of C. songaricum based on KEGG pathway

由圖5可知,同一發(fā)育階段不同部位的通路注釋結(jié)果顯示,各組樣本在“全局和總覽圖”中注釋到的DEGs最多,其次是翻譯、脂質(zhì)代謝和碳水化合物代謝。Cy-3 vs Cy-4和Cy-3 vs Cy-5中DEGs較多,且主要富集在“全局和總覽圖”中,而Cy-1 vs Cy-2和Cy-5 vs Cy-4中DEGs較少,說明在成花鎖陽的花序和莖之間的差異表達基因較多,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、翻譯和脂質(zhì)代謝等過程十分活躍,而在未成花鎖陽和成花鎖陽的莖之間注釋到的差異表達基因較少。結(jié)果表明,在鎖陽生長發(fā)育過程中,次生代謝產(chǎn)物的生物合成、翻譯過程、氨基酸代謝等過程十分活躍,且在鎖陽同一發(fā)育階段的不同部位之間代謝過程也有差異。

2.4 黃酮類生物合成相關(guān)基因的表達分析

鎖陽黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異基因的表達量,見圖6。

圖6 與鎖陽黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異基因的表達量Figure 6 Expression of differential genes related to flavonoid biosynthesis pathway in C. songaricum注：熱圖塊從左到右分別表示Cy-1,Cy-2,Cy-3,Cy-4,Cy-5;紅色表示表達量相對增加;綠色表示表達量相對降低。

由圖6可知,在本研究中,共篩選出20個與黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異表達基因,包括1個苯丙氨酸解氨酶基因(Unigene1091_ALL)、1個肉桂酸-4-羥化酶基因(Unigene37878_ALL)、2個4-香豆酸-輔酶A連接酶基因(Unigene26993_ALL、Unigene5468_ALL)、2個查爾酮合酶基因(Unigene10860_ALL、Unigene33900_ALL)、1個查爾酮異構(gòu)酶基因(Unigene10157_ALL)、4個黃烷酮3-羥化酶基因(Unigene1305_ALL、Unigene34429_ALL、Unigene37419_ALL、Unigene7591_ALL)、4個類黃酮3’-羥化酶基因(Unigene14231_ALL、Unigene31016_ALL、Unigene33968_ALL、Unigene7941_ALL)、1個二氫黃酮醇還原酶基因(Unigene5884_ALL)、2個無花色素還原酶基因(Unigene4993_ALL、Unigene5270_ALL)、1個無色花青素雙加氧酶基因(Unigene10888_ALL)和1個黃酮醇合成酶基因(Unigene37498_ALL)。在本研究中,苯丙氨酸解氨酶基因PAL和肉桂酸-4-羥化酶基因C4H在鎖陽整個發(fā)育階段的表達量均較高,2個查爾酮合酶基因CHS在整個發(fā)育階段的表達趨勢恰好相反,即在鎖陽各部位中的表達量均較低。2個4-香豆酸-輔酶A連接酶基因4CL在鎖陽不同發(fā)育階段的表達模式不同,分別在出土前和出土后表達量較高。查爾酮異構(gòu)酶基因CHI在Cy-1、Cy-2和Cy-3中的表達水平較高,在Cy-5中的表達量最低。黃酮醇合成酶基因FLS在未成花鎖陽中的表達量較低,在成花鎖陽中較高。而二氫黃酮醇還原酶基因DFR和無花色素還原酶基因LAR在未成花鎖陽中的表達量較高,在成花鎖陽中較低,且在花序中表達量較高,在莖中較低。結(jié)果表明,與黃酮類生物合成途徑相關(guān)的基因在鎖陽不同發(fā)育階段和不同部位中的表達水平有所不同,可能與鎖陽的生長發(fā)育過程有關(guān)。

2.5 兒茶素含量分析

鎖陽各樣本之間的兒茶素含量差異,見圖7。

圖7 鎖陽中的兒茶素含量Figure 7 Catechin content in C.songaricum注：不同字母表示鎖陽不同部位之間在0.05水平有顯著性差異(P<0.05)。

由圖7可知,對鎖陽中兒茶素含量進行測定后發(fā)現(xiàn),在未成花鎖陽中,Cy-1的兒茶素含量最高,達到5.74 mg/g。與Cy-1相比,Cy-2的兒茶素含量顯著減少了30.66%。在成花鎖陽中,Cy-3的兒茶素含量最低,值為2.28 mg/g。與Cy-3相比,Cy-5中的兒茶素含量顯著增加了19.30%,Cy-4的兒茶素含量增加了12.72%。結(jié)果表明,在所有樣本中,未成花鎖陽莖上端的兒茶素含量最高,成花鎖陽花序的兒茶素含量最低,未成花鎖陽中的兒茶素含量顯著高于其他樣本。在不同發(fā)育階段,鎖陽莖中的兒茶素含量始終比花序中高;在鎖陽的不同部位,未成花鎖陽中的兒茶素含量均比成花鎖陽的高。這與之前的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中兒茶素合成相關(guān)基因DFR和LAR的表達量變化規(guī)律一致。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在植物生長發(fā)育調(diào)控、脅迫響應(yīng)以及不同器官的形態(tài)建成方面得到了廣泛研究[22-24]。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測序分析了成花和未成花鎖陽的花序和莖在發(fā)育過程中的差異,結(jié)果表明,大量差異基因富集在次生代謝產(chǎn)物的生物合成和代謝、氨基酸代謝、碳水化合物代謝等途徑中,說明這些是鎖陽生長發(fā)育過程中的重要代謝途徑。

在鎖陽的不同發(fā)育階段,莖中的基因表達量始終較高,這可能是由于鎖陽在生長發(fā)育過程中其藥效成分在莖中大量積累,KEGG通路注釋結(jié)果也表明,鎖陽次生代謝產(chǎn)物的合成十分旺盛[14]。成花鎖陽的整體基因表達量較未成花鎖陽高,這一結(jié)果可能與其出土后的開花和結(jié)實等過程有關(guān)[25-26]。鎖陽不同器官中的兒茶素含量也具有明顯差異。其中,未成花鎖陽莖上端中的兒茶素含量最高,莖下端次之,而成花鎖陽花序中含量最低,莖上端和莖下端的含量相對較高,與前人的研究結(jié)果相似[14]。鎖陽在中藥中為去花序入藥,這是因為莖中的兒茶素含量較高,去花序入藥保證了鎖陽中較高的藥效成分含量;在蒙藥中則以全草入藥,因為鎖陽花序中仍然存在一定含量的兒茶素,本研究結(jié)果證實了這2種不同入藥方式的正確性。

兒茶素是由苯丙氨酸解氨酶PAL和肉桂酸-4-羥化酶C4H等酶催化合成的黃酮類化合物,主要存在于茶樹等天然植物中[27]。一些研究表明,兒茶素的積累與植物的儲能和抗逆有關(guān),兒茶素通過其羥基提供電子來清除活性氧,從而在抵御氧化應(yīng)激方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[28-29]。在本研究中,苯丙氨酸解氨酶基因PAL和肉桂酸-4-羥化酶基因C4H在鎖陽整個發(fā)育階段的表達量均較高,保證了鎖陽在生育期內(nèi)次生代謝產(chǎn)物合成與積累的起始,而黃酮醇合成酶基因FLS在未成花鎖陽中的表達量較低,在成花鎖陽中較高,這與前人的研究結(jié)果一致[27]。作為鎖陽中重要的活性成分,兒茶素在鎖陽的整個發(fā)育階段都會積累,但其含量在不同發(fā)育階段存在差異。在鎖陽的不同部位,未成花鎖陽中的兒茶素含量均比成花鎖陽高,且在成花鎖陽花序中含量最低,之前的研究也有類似結(jié)果[21]?；駾FR和LAR的表達水平與兒茶素含量的變化規(guī)律相似,但在成花鎖陽花序中的表達水平大于莖。有研究表明,基因DFR和LAR的調(diào)控與茶樹中總兒茶素含量緊密相關(guān),其表達量隨兒茶素含量的增加而增加[30-31]。因此,基因DFR和LAR可能對鎖陽兒茶素的合成起著重要的調(diào)控作用。在黃酮類生物合成途徑中,FLS與DFR可能對底物存在競爭性利用,FLS在成花鎖陽的花序中表達活躍,改變了兒茶素的合成途徑,可能是導(dǎo)致花序中兒茶素含量降低的原因[32]。

3.2 結(jié)論

本研究通過Illumina HiSeqTM 2000技術(shù)對未成花鎖陽的莖上端(Cy-1)、莖下端(Cy-2)以及成花鎖陽的花序(Cy-3)、莖上端(Cy-4)和莖下端(Cy-5)進行了測序,成功構(gòu)建了鎖陽的轉(zhuǎn)錄組文庫,并對黃酮類化合物生物合成相關(guān)基因的表達進行了分析。共獲得106 626個Unigenes,通過BLAST分析后,在各樣本中分別有59 547、46 362、32 466、33 609、21 040、39 939個Unigenes在Nr、Nt、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫獲得注釋,共有318 909個差異基因在GO得到注釋。在鎖陽的不同發(fā)育階段,莖中的基因表達量始終較高,且成花鎖陽的整體基因表達量比未成花鎖陽高。將篩選到的318 909個差異表達基因進行KEGG通路注釋分析,各組樣本在“全局和總覽圖”中注釋到的差異表達基因最多,其次是翻譯、脂質(zhì)代謝和碳水化合物代謝,鎖陽同一發(fā)育階段的不同部位之間代謝過程也有差異。共篩選出20個與黃酮類生物合成途徑相關(guān)的差異表達基因,黃酮醇合成酶基因FLS在未成花鎖陽中的表達量較低,在成花鎖陽中較高。而二氫黃酮醇還原酶基因DFR和無花色素還原酶基因LAR在未成花鎖陽中的表達量較高,在成花鎖陽中較低。在所有樣本中,未成花鎖陽莖上端的兒茶素含量最高,成花鎖陽花序的兒茶素含量最低,且未成花鎖陽中的兒茶素含量均比成花鎖陽高,這與DFR和LAR表達量的變化規(guī)律一致,說明DFR和LAR對鎖陽兒茶素的合成起著重要的調(diào)控作用。本研究為瀕危藥用植物鎖陽次生代謝的研究、鎖陽資源的綜合利用及其最佳采收期的確定提供了參考。