郭言午,方才敬,施俊峰,劉 攀,戴小華

慢性心力衰竭(CHF)是由各種心臟疾病引起的心室舒縮功能障礙的一種臨床綜合征,具有發(fā)病率高及病死率高的特點,且CHF病人病程較長,機體耐受力、免疫力差,臨床常采用強心劑、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)、β受體阻斷劑、醛固酮受體拮抗劑等進行常規(guī)治療,盡管治療方案不斷優(yōu)化,但遠期療效始終欠佳,病人再住院率高、生活質(zhì)量低的問題仍未能很好解決[1-3]。

參芪健心方的組方成分為黃芪、紅參、茯苓、白術(shù)、淫羊藿、丹參、桂枝、葶藶子。既往藥理學研究表明,參芪健心方具有抑制心室重構(gòu)、抗動脈粥樣硬化、減輕心臟循環(huán)系統(tǒng)病理性改變、改善心功能等功效[4]。網(wǎng)絡(luò)藥理學具有整體性及系統(tǒng)性的特點,可在分子層面探究中醫(yī)藥治療疾病的多成分、多靶點、多途徑[5-6]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學方法篩選參芪健心方干預氣虛血瘀型慢性心力衰竭的核心靶點及有效成分,并探討其有效成分、靶點、信號通路等之間的聯(lián)系,為研究其多靶點治療慢性心力衰竭的作用機制提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年1月—2019年12月就診于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科西醫(yī)確診為慢性心力衰竭,且中醫(yī)辨證為氣虛血瘀證的病人60例,隨機分為對照組和治療組,每組30例,其中治療組1例病人因服藥依從性差脫落,最終完成29例。兩組病人一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 兩組一般資料比較

1.2 診斷標準 西醫(yī)診斷參考《中國心力衰竭診斷和治療指南2018》[7]中慢性心力衰竭的診斷標準;中醫(yī)診斷及證型參考2014年《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識》[8]、《慢性心力衰竭中西醫(yī)結(jié)合診療專家共識》[9],符合慢性心力衰竭氣虛血瘀型的證候標準。

1.3 納入標準 同時符合上述中、西醫(yī)診斷標準;年齡18～90歲,性別不限;自愿參加并簽署知情同意書;符合HFrEF、HFmrEF診斷標準;中醫(yī)證型屬于氣虛血瘀證;NYHA心功能分級Ⅱ級或Ⅲ級;原發(fā)病為冠心病、高血壓、擴張型心肌病、心臟瓣膜病。

1.4 排除標準 射血分數(shù)保留的心力衰竭(HFpEF)、急性心力衰竭、經(jīng)手術(shù)或器械治療者;嚴重肝、腎功能異常;精神病病人;對試驗藥物過敏者;急性冠脈綜合征(30 d內(nèi))、心源性休克;妊娠及哺乳期婦女;近3個月內(nèi)參加其他臨床研究者;合并嚴重疾病如惡性腫瘤、惡性心律失常、肥厚梗阻型心肌病、高度房室傳導阻滯未置入起搏器、重度貧血、甲狀腺功能亢進危象等嚴重內(nèi)分泌疾病、消化道出血等重癥消化疾病者。

1.5 剔除、脫落標準 病人依從性差,不能配合治療者;入組期間出現(xiàn)藥物過敏者;自行要求退出者;發(fā)生嚴重不良事件、并發(fā)癥者。

1.6 干預方法 兩組均連續(xù)治療4周。

1.6.1 對照組 ①ACEI:鹽酸貝那普利片(10～20 mg,每日1次,北京諾華制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每片10 mg,批號:H20030514),如病人不能耐受鹽酸貝那普利的副作用及不良反應(yīng),可酌情調(diào)整為血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)纈沙坦膠囊(80～160 mg,每日1次,北京諾華制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每片80 mg,批號:H20040217);②β受體拮抗劑:琥珀酸美托洛爾緩釋片(23.75～47.50 mg,每日1次,阿斯利康制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每片47.50 mg,批號:J20150044);③醛固酮受體拮抗劑:螺內(nèi)酯片(20 mg,每日1次,江蘇正大豐海制藥有限公司生產(chǎn),規(guī)格:每片20 mg,批號:H32020077)。

1.6.2 治療組 在對照組基礎(chǔ)上加用參芪健心方,水煎服,每日1劑,早晚分服。

1.7 觀察指標

1.7.1 中醫(yī)證候積分 兩組病人于治療前后參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[10],采用中醫(yī)證候積分表進行評分。

1.7.2 NYHA心功能分級 參照NYHA分級標準中的心功能療效評定標準,顯效:心功能改善≥2級;有效:心功能改善1級;無效:心功能改善不足1級;惡化:心功能惡化≥1級[11]。

1.7.3 血清BNP水平 分別于治療前后采集病人上肢肘靜脈血4 mL,采用免疫熒光檢測法檢測BNP水平,檢測儀器為美國雅培公司AXSYM儀,由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院臨床生化檢驗室規(guī)范操作完成。

1.7.4 心臟超聲 采用GE公司VIVID7型號超聲檢測儀檢測LVEF、LVEDD值。

1.7.5 6MWD 測量病人6 min內(nèi)直線行走的最大距離,若試驗過程中病人出現(xiàn)頭暈、胸悶、胸痛、憋喘、冷汗出、面色蒼白等不能耐受情況時,應(yīng)立即終止試驗。依據(jù)《老年患者6分鐘步行試驗臨床應(yīng)用中國專家共識》[12]:6MWD<150 m為重度心力衰竭;150～450 m為中度心力衰竭;>450 m為輕度心力衰竭。

1.8 網(wǎng)絡(luò)藥理學分析 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(TCMSP),以口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18為限制條件搜索參芪健心方各中藥成分及其作用靶點;使用Cytoscape 3.8.1制作中藥成分-靶點圖,可視化中藥成分-靶點之間的具體聯(lián)系;以評分(Score)≥5.0分為限制條件,使用GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索慢性心力衰竭相關(guān)靶點;將中藥靶點、疾病靶點取交集,獲得交集基因(DEGs);以置信度≥0.4為限制條件,使用STRING數(shù)據(jù)庫對交集基因進行分析,獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作圖(PPI),并保存為制表符分隔值(TSV)格式,使用Cytoscape 3.8.1對PPI進行可視化處理;使用DAVID數(shù)據(jù)庫對DEGs進行基因名(gene symbol)轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)換為集合基因(ENSG)格式,使用基迪奧生物信息云(Omic Share)平臺對DEGs進行基因本體(GO)及京都基因和基因組百科全書(KEGG)富集分析。

2 結(jié) 果

2.1 兩組中醫(yī)證候積分比較 治療后,兩組中醫(yī)證候積分較治療前下降,且治療組下降更明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 兩組中醫(yī)證候積分比較(±s) 單位:分

2.2 兩組NYHA心功能分級療效比較 治療后,治療組NYHA心功能分級療效總有效率大于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表3。

表3 兩組NYHA心功能分級療效比較

2.3 兩組血清BNP水平比較 治療后,兩組血清BNP水平較治療前下降,且治療組血清BNP水平下降更明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 兩組血清BNP水平比較(±s) 單位:pg/mL

2.4 兩組6MWD比較 治療后,兩組6MWD均增加,且治療組增加更明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表5。

表5 兩組6MWD比較(±s) 單位:m

2.5 兩組LVEF、LVEDD比較 治療后,兩組LVEF均較治療前升高,且治療組升高更明顯,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。治療后,兩組LVEDD與治療前比較,差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。詳見表6。

表6 兩組LVEF、LVEDD比較(±s)

2.6 “成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵化合物篩選 將基因數(shù)據(jù)導入Cytoscape 3.8.1軟件,獲得“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖,根據(jù)關(guān)聯(lián)程度(Dgree)值篩選出參芪健心方各中藥主要活性成分124個[槲皮素(quercetin)、7-0-甲基異鼠李糖醇(7-0-methylisothamitol)等],關(guān)鍵靶點1 419個。詳見圖1。

圖1 參芪健心方“成分-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖 通過TCMSP,以O(shè)B≥30%、DL≥0.18為限制條件搜索參芪健心方各中藥成分及其作用靶點;使用Cytoscape 3.8.1制作中藥成分-靶點圖,可視化中藥成分-靶點之間的聯(lián)系;以評分(Score)≥5.0分為限制條件,使用GeneCards數(shù)據(jù)庫搜索慢性心力衰竭相關(guān)靶點,獲得慢性心力衰竭靶點241個;將中藥靶點、疾病靶點取交集,獲得白介素6(IL6)、腫瘤壞死因子(TNF)、白介素1β(IL1β)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGFA)等22個DEGs,設(shè)置置信度≥0.4,排除游離基因后獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖。詳見圖2、圖3。

圖2 參芪健心方-慢性心力衰竭交集基因PPI圖

圖3 交集基因可視化PPI圖

2.8 GO和KEGG分析 對22個交集基因進行GO分析后發(fā)現(xiàn),細胞組分(CC)主要富集于細胞質(zhì)膜、細胞外圍等處(見圖4);分子功能(MF)主要富集于類蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等方面(見圖5);生物過程(BP)主要富集于多細胞生物過程調(diào)節(jié)、對有機物的反應(yīng)等方面(見圖6)。KEGG分析獲得與交集DEGs相關(guān)的前20個信號通路(見圖7)。

圖4 細胞組分分析

圖5 分子功能分析

圖6 生物過程分析

圖7 KEGG富集分析

3 討 論

西醫(yī)認為慢性心力衰竭是多種因素共同作用引起的心肌受損[13],已成為重點關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[14]。目前,針對心力衰竭的治療著重于防止和延緩心肌重構(gòu)[15],從而降低其死亡率和再住院率等。中醫(yī)將本病歸屬于“心衰”“喘證”“水腫”等范疇,形成的根本原因是心臟臟器、臟真受損,心臟氣血陰陽衰竭,危及五臟六腑及全身氣血陰陽氣化升降出入。而五臟六腑的氣化失常,又進一步導致內(nèi)生邪實(如瘀血痰濁、水氣痰飲、寒濕凝滯等)的產(chǎn)生,從而形成虛更虛、實更實的惡性循環(huán),為“本虛標實,標本具病”之證。因此,本病病因可歸納為痰、瘀、虛,而痰責之于脾,瘀責之于心肺,虛則是正氣不足,可見本病與肺、脾、心、腎關(guān)系最為密切;主要病機為心氣、心陽不振。故臨床治療本病時可采用益氣活血法。戴小華教授基于中醫(yī)基礎(chǔ)理論及多年臨床經(jīng)驗創(chuàng)參芪健心方,方中含黃芪、紅參、茯苓、白術(shù)、淫羊藿、丹參、桂枝、葶藶子等藥材,其中黃芪、紅參益氣溫陽為君藥,茯苓、白術(shù)、淫羊藿為臣藥以益脾腎之氣,丹參、桂枝溫經(jīng)通絡(luò),葶藶子瀉肺平喘,三者為佐使藥,共同發(fā)揮補氣溫陽、化瘀利水功效,使氣旺、陽足、瘀消、水行。

本研究結(jié)果表明,治療后,兩組病人中醫(yī)證候積分較治療前下降,且治療組下降更明顯(P<0.05),表明參芪健心方可改善病人臨床癥狀、降低中醫(yī)證候積分;治療后,治療組病人BNP水平較對照組明顯降低(P<0.05),表明參芪健心方可降低BNP水平,改善心功能;治療后,治療組病人6MWD明顯高于對照組(P<0.05),表明參芪健心方可改善病人運動耐量。網(wǎng)絡(luò)藥理學研究發(fā)現(xiàn),參芪健心方和慢性心力衰竭的交集基因有22個,其中關(guān)鍵交集基因為IL6、TNF、IL1β、VEGFA。核心差異基因主要在細胞質(zhì)膜、細胞外圍等處富集,與類蛋白結(jié)合、酶結(jié)合相關(guān),參與多細胞生物過程調(diào)節(jié)、對有機物的反應(yīng)等過程。參芪健心方防治慢性心力衰竭的主要活性成分為槲皮素、7-0-甲基異鼠李糖醇等,機制可能是通過干預動脈粥樣硬化、晚期糖基化終末產(chǎn)物-糖基化終末產(chǎn)物受體(AGE/RAGE)、白介素17(IL17)信號通路防治慢性心力衰竭。

參芪健心方由紅參、黃芪、茯苓、白術(shù)、桂枝、丹參、淫羊藿、葶藶子組成,現(xiàn)代藥理學研究表明,紅參中的人參皂苷可保護血管內(nèi)皮、抗動脈粥樣硬化、抑制心肌細胞增大、逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)及調(diào)節(jié)心肌能量代謝[16]。黃芪最主要的藥用成分為黃芪甲苷和黃酮類化合物芒柄花素,黃芪甲苷有助于減輕心臟循環(huán)系統(tǒng)病理性改變,維持腦循環(huán),控制血壓;芒柄花素能夠拮抗活性氧和超氧離子通道,保護心肌細胞[17-18]。茯苓的特征性成分是三萜類,可通過阻斷腎小管遠曲小管Na+與K+、H+之間的交換,達到利尿的作用[19]。白術(shù)的主要成分是白術(shù)內(nèi)酯、多糖等,具有抗炎、利尿、抗血小板聚集、降糖、呼吸興奮、抗腫瘤、調(diào)節(jié)胃腸道功能、調(diào)節(jié)子宮平滑肌等藥理作用[20]。桂枝可通過阻斷轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)信號通路,發(fā)揮抗心肌纖維化的作用[21]。丹參中的丹參素具有保護心肌、緩解心肌缺血再灌注損傷的作用[22]。丹參酮ⅡA可減輕氧化應(yīng)激,同時能夠加強氧自由基的消除,抗心肌纖維化[23]。淫羊藿主要成分為淫羊藿苷、總黃酮、淫羊藿多糖等,具有抗細胞鈣化、抗氧化、抗衰老、調(diào)節(jié)免疫作用,可通過調(diào)節(jié)能量生成通道促進能量生成而防治心力衰竭[24-25]。葶藶子的主要成分有強心苷、硫苷和異硫氰酸、香豆素等,實驗研究發(fā)現(xiàn),葶藶子具有利尿作用,其抗心力衰竭機制主要是緩解氧化應(yīng)激,抑制神經(jīng)體液機制激活,逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)[26-28]。

綜上所述,本研究在臨床觀察結(jié)果有效的基礎(chǔ)上通過網(wǎng)絡(luò)藥理學工具探析參芪健心方干預氣虛血瘀型慢性心力衰竭的可能機制,為后續(xù)設(shè)計實驗證明其具體作用機制奠定基礎(chǔ),也為臨床防治本病提供參考。