覃穎，毛錦江，鐘文富

貴港市人民醫(yī)院產(chǎn)科1、檢驗科2，廣西 貴港 537100

稽留流產(chǎn)(missed abortion，MA)是指胚胎或胎兒已死亡，滯留在宮腔內(nèi)未能及時自然排出者[1-2]。8%～15%的孕婦在妊娠早期會發(fā)生自然流產(chǎn)，大多數(shù)發(fā)生在孕早期(7～11周)[3-4]，近幾年有增加趨勢。導致稽留流產(chǎn)的原因眾多，隨著細胞遺傳學技術(shù)的進步和對稽留流產(chǎn)遺傳原因的長期研究，胎兒/胚胎染色體異常是稽留流產(chǎn)最常見的原因，約占75%，這種染色體異常是由于生殖細胞的遺傳物質(zhì)異常所致[3]。既往研究表明，育齡女性中有20%～30%的卵子和年輕健康男性中有6%～8%的精子存在染色體異常，通常是染色體數(shù)目異常[3]。拷貝數(shù)變異測序(CNV-seq)技術(shù)是采用一下代測序技術(shù)(NGS)檢測大于0.2 Mb DNA 序列的結(jié)構(gòu)變異，是一種從基因組的隨機片段拷貝中平行測序大量短DNA 鏈的技術(shù)?；贜GS 正迅速發(fā)展，CNV-seq作為一種低深度全基因組測序，在產(chǎn)前診斷、流產(chǎn)、先天性異?；蛏窠?jīng)發(fā)育遲緩的患兒等臨床檢測染色體疾病中廣泛使用[2，4]。本研究利用CNV-seq 技術(shù)檢測對我院收治的稽留流產(chǎn)患者的絨毛/胎兒組織進行遺傳學分析，以幫助確定病因，并提供遺傳咨詢，評估下一次妊娠的風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2021年12月在貴港市人民醫(yī)院產(chǎn)科就診的220例稽留流產(chǎn)患者的絨毛/胎兒組織，患者年齡17～46 歲。納入標準：根據(jù)臨床病史、實驗室檢查和經(jīng)陰道超聲檢查診斷為稽留流產(chǎn)，所有稽留流產(chǎn)發(fā)生在胎齡6 至13 周之間，并接受流產(chǎn)物細胞遺傳學相關(guān)檢查的患者。排除標準：孕早期有不良接觸史和服藥史，生殖系統(tǒng)解剖結(jié)構(gòu)異常，糖尿病，精神病和免疫系統(tǒng)疾病的患者。本研究已經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者均于檢查前簽署知情同意書。

1.2 研究方法 清宮手術(shù)或藥物流產(chǎn)終止妊娠排出的絨毛/胎兒組織，用0.9%氯化鈉溶液多次漂洗去除母體血液及污染物后挑取樣本，置于無菌容器中，4℃保存及運輸，樣本送至深圳華大臨床檢驗中心進行檢測。使用PCR 擴增產(chǎn)物夠進行單鏈分離和環(huán)化反應(yīng)，最終獲得帶有一個接頭的單鏈環(huán)狀DNA 文庫。采用PCR-free建庫方法建立單鏈環(huán)狀DNA文庫，利用華大自主測序平臺MGISEQ-2000 進行測序，并利用測序儀自帶的數(shù)據(jù)處理軟件Zebracall 找到最終的CNV 結(jié)果。參考美國醫(yī)學遺傳學與基因組學學會(ACMG)、臨床基因組資源中心(ClinGen)等相關(guān)指南共識及數(shù)據(jù)庫對CNV進行解讀判定。

1.3 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS25.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用構(gòu)成比(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CNV-seq檢查結(jié)果 220例稽留流產(chǎn)患者進行其絨毛/胎兒組織經(jīng)CNV-seq檢查，成功檢測215例，失敗5例，成功率為97.73%(215/220)。檢出異常染色體140例，占全部樣本的65.12%(140/215)，檢出正常染色體75例，占全部樣本的34.88%(75/215)。異常染色體中，數(shù)目異常型113 例(80.71%，113/140)，其中三體型82 例(58.57%，82/140)，最常見。16 號、22 號、15 號、21 號和14 號三體發(fā)生率最高，7例為兩條常染色體復合三體。三倍體18例(12.86%，18/140)，單體13例(9.29%，13/140)，主要見于X單體。嵌合體型13例(6.05%，13/215)；染色體節(jié)段缺失/重復14 例(6.51%，14/215)，見表1。

表1 流產(chǎn)胚胎染色體數(shù)目異常及類型(n=140)Table 1 Chromosome number abnormality and types of aborted embryos(n=140)

2.2 染色體嵌合體異常情況 本研究發(fā)現(xiàn)嵌合體13 例(6.05%)，其中，性染色體嵌合5例(包括X單體嵌合3 例)，常染色體三體嵌合8 例，分別為1 號和2 號和15 號復合三體嵌合1 例，21 單體嵌合1 例，2 號、6號、8號、10號、15號、16號三體嵌合各1例。

2.3 染色體拷貝數(shù)變異情況 本研究發(fā)現(xiàn)染色體片段缺失/重復14 例(6.51%)，其中5 例染色體大片段缺失重復和2例為微缺失微重復綜合征為臨床致病性變異，1例良性變異，6例臨床意義不明確的變異，見表2。

表2 流產(chǎn)胚胎染色體拷貝數(shù)變異檢測結(jié)果Table 2 Detection results of chromosome copy number variation of aborted embryos

2.4 孕婦年齡與染色體的關(guān)系 本研究中，孕婦年齡＜35 歲者共153 例，染色體異常95 例，檢出率為62.09%；孕婦年齡≥35 歲者共62 例，染色異常體45 例，檢出率為72.58%，其中年齡≥35 歲組染色體異常的發(fā)生率更高，但差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.137，P＞0.05)。

3 討論

3.1 流產(chǎn)與染色體數(shù)目異常的關(guān)系 近年來，稽留流產(chǎn)的發(fā)病率逐漸升高，病因復雜多樣，給孕產(chǎn)婦帶來嚴重的心理和社會負擔。研究表明胚胎或胎兒染色體異常是早期稽留流產(chǎn)最常見的原因，而染色體非整倍體改變是自然流產(chǎn)的重要原因[1，3]。本研究利用CNV-seq 對早期稽留流產(chǎn)患者的絨毛/胎兒組織進行檢測，檢測成功率為97.73%，檢出染色體異常為140 例，染色體異常率為65.28%，與文獻報道的基本一致[5]。染色體異常中以非整倍性為主，即染色體數(shù)目增加或減少，其中非整倍體113 例，占染色體異常的80.71%，除了1 號、3 號、5 號7 號和11 號染色體外，大多數(shù)染色體都存在非整倍體性，常染色體三體型占多數(shù)，占染色體異常的51.06%，與既往文獻報道的結(jié)果沒有區(qū)別，在大多數(shù)研究中，常染色體三體型發(fā)生率在33%～66%之間，但最常見的是50%左右[3]。本研究中16號、22號、15號、21號、14號染色體三體占比例最高，這5 條染色體三體占所有三體型的67%，都是比較小的染色體，容易發(fā)生非整倍體異常，大多數(shù)在早期妊娠中流產(chǎn)，活產(chǎn)兒中21 三體最常見，而大的常染色體1 至6 號染色體中的非整倍體是最不常見的。單體型13 例，主要為45,X，性染色體X 單體在流產(chǎn)兒和活產(chǎn)兒中都可見到，但性染色體三體在流產(chǎn)兒中不常見[1]。兩條常染色體復合三體7 例，分別為9 號和16 號、7 號和15號、2 號和14 號、15 號和21 號、16 號和21號、14號和17號染色體復合三體各1例。本研究結(jié)果表明孕早期胚胎染色體異常是導致稽留流產(chǎn)的主要原因之一，染色體非整倍體是早期流產(chǎn)最常見的染色體異常。

3.2 稽留流產(chǎn)與染色體嵌合體的相關(guān)性 本次研究檢測出嵌合體13 例，占染色體異常的9.29%，其中3例為X單體嵌合，性染色體嵌合2 例，常染色體三體嵌合8例。嵌合體是指含同時存在兩種或兩種以上核型的細胞系的個體。其發(fā)生機制主要是早期胚胎發(fā)育過程中有絲分裂和減數(shù)分裂錯誤，導致個體同時存在兩個或多個細胞系[6-7]。1%～2%的胎盤組織(絨毛)可發(fā)現(xiàn)胎盤嵌合體。多數(shù)妊娠胎盤組織(絨毛)與胎兒的核型一致，但當存在限制性胎盤嵌合體(CPM)時，胎盤組織(絨毛)中可能存在幾種不同比例的細胞系核型，多為染色體非整倍體，而胎兒核型無異常[3]。本研究中，研究的主要組織是絨毛膜的細胞滋養(yǎng)層，可能涉及或沒有涉及胚外中胚層，很難評估嵌合體涉及胚胎外組織所占比例，以及是否與正?；虍惓５奶汉诵突蚰阁w細胞污染有關(guān)[3]。有研究認為，大多數(shù)胎盤嵌合體胎兒可以妊娠至足月，沒有合并畸形或異常，但有些會導致宮內(nèi)發(fā)育遲緩(IUGR)、早產(chǎn)、胎盤功能不全和流產(chǎn)。在健康人的各種組織(包括大腦、血液和皮膚)中，嵌合體的發(fā)病率很高，染色體嵌合體可能與包括精神疾病、自身免疫性疾病和先天性畸形等多種疾病有關(guān)[8]。

3.3 稽留流產(chǎn)與染色體CNV的相關(guān)性 研究表明，有些致病性的CNV與發(fā)育遲緩、智力障礙、特殊面容、多發(fā)畸形、癲癇等相關(guān)，有些含有重要基因片段的CNV缺失和重復可能導致胚胎發(fā)育畸形或死亡，但與稽留流產(chǎn)是否相關(guān)還需更多的研究來驗證[9-10]。本研究中檢出有臨床意義染色體CNV 8 例(檢出率為3.72%)，其中有5 例為大片段缺失和(或)重復，涉及大量的功能基因，為致病性變異，另外有2例分別為16號微缺失綜合征和19 號微缺失綜合征，缺失長度均在5 Mb 以下，1 例14 號長臂微重復為良性變異，這些微小變異常規(guī)G 顯帶染色體核型分析不能檢測出的染色體異常。由此可見，對絨毛/胎兒組織進行拷貝數(shù)變異分析可提高染色體異常檢出率，能夠發(fā)現(xiàn)更多罕見的微缺失微重復綜合征，為遺傳咨詢提供依據(jù)，指導再次妊娠。本研究檢出臨床意義不明確CNV 的病例6例，檢出率為2.79%，這類病例CNV的結(jié)果解讀與遺傳咨詢，需通過夫婦雙方進行同種類型CNV-seq 檢測以驗證變異來源。若CNV是遺傳性的，則臨床指導意義較小，若為新發(fā)的變異，則臨床指導意義較大，但仍需要考慮不完全外顯和臨床表型差異的影響[11]。

3.4 染色體異常與患者年齡的相關(guān)性 研究表明，胚胎染色體發(fā)生非整倍性改變隨著年齡的增長呈升高趨勢，在28～29歲時染色體非整倍性發(fā)病率最低，為25%，35歲后急劇上升，在45歲時達到90%的峰值[2，7]。從機制上講，隨著年齡的增加，卵細胞質(zhì)量下降，卵細胞在有絲分裂和減數(shù)分裂過程中延滯，導致染色體的異常。本研究結(jié)果顯示年齡≥35 歲組的染色體異常率高于年齡＜35 歲組，但差異并無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，發(fā)生這一現(xiàn)象的原因可能是本研究樣本量較少，未來需要擴大樣本進一步統(tǒng)計。

3.5 CNV-seq 技術(shù)的優(yōu)勢及臨床意義 常規(guī)G顯帶染色體核型分析是檢測染色體非整倍性和不平衡易位的金標準，但總體檢測失敗率為20%，當出現(xiàn)母體細胞污染時會導致假陰性結(jié)果。常規(guī)G 顯帶染色體核型分析僅能檢測＞5 Mb 的染色體節(jié)段改變，且存在分辨率低、成本較低、細胞培養(yǎng)周期長等缺點。熒光原位雜交(FISH)、多重連接依賴性探針擴增(MLPA)和定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)(QF-PCR)等技術(shù)克服了傳統(tǒng)細胞遺傳學技術(shù)的一些缺點，但因其分辨率不高，未能對全基因組覆蓋而在臨床中受到限制[2-3]。隨著下一代測序(NGS)技術(shù)的發(fā)展，CNV-seq 是一種高通量基因測序技術(shù)，具有周期短、分辨率高、通量高、成本低、只需要少量DNA、高診斷性能等特點。臨床上特別是在僅有少量組織時，CNV-seq 可能是不夠用于成功的細胞培養(yǎng)進行遺傳學核型分析；或細胞培養(yǎng)失敗時，CNV-seq 是核型分析的可行替代或補充方法，用于準確識別與流產(chǎn)相關(guān)的已知染色體原因，適用于研究流產(chǎn)的遺傳學病因，具有相對較高的基因組分辨率和精確定量拷貝數(shù)的能力，可提高胚胎染色體異常的診斷率[2]。

綜上，染色體數(shù)目異常是導致早期流產(chǎn)最常見的染色體異常。應(yīng)用CNV-seq對流產(chǎn)物進行染色體檢測為早期流產(chǎn)的遺傳學檢測提供更多的遺傳信息，為稽留流產(chǎn)的病因和遺傳咨詢提供依據(jù)，具有很好的應(yīng)用價值，對再次妊娠具有很好的指導意義。